運動免疫檢測方法的研究進展*

王 恬

(浙江師范大學 杭州幼兒師范學院,浙江 杭州 310012)

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運動免疫檢測方法的研究進展*

王 恬

(浙江師范大學 杭州幼兒師范學院,浙江 杭州 310012)

生物技術的發展，使得越來越多的高新技術和方法運用于運動免疫的研究中.運用文獻資料法，對細胞免疫、免疫分子的檢測手段和方法進行了深入的探討和研究，對不同的檢測方法進行比較和分析，為運動免疫的研究提供方法學上的依據，并為通過更有效的研究方法來判斷和辨別運動性免疫抑制的現象和機制提供參考.

運動免疫；檢測；方法；免疫細胞；細胞因子

隨著生物科學技術的發展，新的檢測手段和技術的推出，越來越多的高新技術和檢測方法應用于運動免疫的研究中，已成為運動免疫學倍受關注的研究內容之一.免疫標記物、免疫檢測儀器的不斷問世，免疫分析靈敏度的不斷提高，使得運動免疫的研究不斷地深入.

1 免疫細胞的檢測

1.1 T淋巴細胞和細胞亞群的檢測

T淋巴細胞在人體細胞免疫中發揮著重要的作用.測定運動過程中T淋巴細胞及亞群的變化可以判斷運動機體的免疫功能狀態，并能為免疫機能的轉歸提供一定的參考依據.

T淋巴細胞及其亞群的檢測方法包括細胞數量檢測和細胞功能的檢測.常用的數量檢測方法有[1]：免疫熒光法、磁株分離法、流式細胞術等.常用的功能檢測方法有[2]：細胞毒試驗、T細胞增殖試驗、T細胞分泌功能檢測等.早期的一些檢測方法如玫瑰花環試驗等已經被淘汰，目前應用最為普及的是流式細胞術，它具有快速、準確等優點，被認為是最先進的細胞定量分析技術之一.

流式細胞術(flow cytometry，FCM)是利用流式細胞儀進行的一種在功能水平上對單細胞進行定量分析和分選的技術.它可以對混合細胞群中的亞群細胞進行計數.隨著流式細胞技術的發展，其發展趨勢體現在從相對細胞計數到絕對細胞計數、從單色到多色熒光分析、從相對定量到絕對定量分析.流式細胞術已廣泛應用于免疫相關疾病的臨床研究和運動免疫發生機制及運動性免疫抑制的研究中[3-4].

1.2 自然殺傷細胞、自然殺傷T細胞的檢測

1)自然殺傷細胞(natural killer cells，NK)介導天然免疫應答，能直接殺傷靶細胞，是機體重要的免疫細胞之一，具有抗病毒、抗腫瘤及免疫調節等功能.NK細胞是一類被認為在運動中反應明顯、變化幅度大的細胞群[5]，因而為了準確地了解運動機體細胞免疫的變化及免疫系統的功能狀況，通常需要監測運動過程中NK細胞的活性及數量[6-7].

NK細胞的檢測方法有細胞活性的測定和細胞數量的測定.放射性核素釋放法、四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT) 微量酶反應比色法、乳酸脫氫酶釋放法等[8-10]都是細胞活性常用的檢測方法.放射性核素釋放法較為經典的是采用51Cr釋放法檢測人體NK細胞活性，但其缺點是存在放射性污染.NK細胞活性也可用流式細胞術進行檢測，其優點是能夠在單細胞水平上進行分析，敏感性較強.張嘉等[11]通過構建穩定表達增強型綠色熒光蛋白的K562細胞株，作為靶細胞株，進行流式細胞術檢測，認為該檢測快速、穩定、準確，可作為NK細胞活性檢測的一種新方法.NK細胞的數量檢測較多地采用流式細胞術進行檢測.

2)自然殺傷T細胞(natural killer T cells，NKT)是Budd等[12]在1987年首次報道的，之后的研究表明,NKT是不同于T細胞、B細胞和NK細胞的另一類細胞群，兼具NK細胞和T細胞特征的免疫細胞.臨床研究發現，NKT細胞參與了機體的免疫反應和免疫防御，在抑制自身免疫性疾病、抗腫瘤和克服器官移植排斥等方面都發揮了免疫保護作用[13-14].運動免疫的研究也發現，運動中NKT會出現明顯的變化，是能夠較好地反映機體免疫功能狀況的敏感指標[15].

NKT的檢測同樣可采用細胞活性的測定和細胞含量的測定.51Cr釋放法、MTT法可用于細胞毒活性的檢測，細胞毒活性的殺傷效應也可用雙標記細胞毒法、細胞光掃描法等進行測定.NKT細胞含量的測定較多的是選用流式細胞儀和克隆定量進行檢測的[16].流式細胞儀與克隆定量相比較，顯得更為簡單、方便.

1.3 樹突狀細胞的檢測

自1973年Steimant等[17]首次報道樹突狀細胞(DC)以來，DC已被認為是目前已知的功能最強的抗原提呈細胞，在細胞免疫和體液免疫的調控中起到了重要的作用.由于DC參與抗原的識別、加工處理和提呈，因而,DC的研究頗受免疫學界的矚目.盡管目前運動醫學界對DC的研究較少，但是由于DC具有啟動初使免疫應答的獨特功能，因此，在運動過程中,檢測DC的改變對于尋找運動性免疫抑制的敏感指標可能提供了一條新的線索.

外周血液中DC1及DC2細胞的檢測通常采用熒光抗體標記和流式細胞術.流式細胞儀檢測可直接定量DC數量和百分率，并具有快速、簡便、準確、靈敏等特點.傳統的檢測方法主要是通過密度梯度離心、培養、和(或)陰性選擇富集后的DC細胞，費時、費力，不能夠準確反映DC在體內的真實特性.

2 免疫分子的檢測

2.1 細胞因子的檢測

機體功能在正常狀態下，Th1和Th2細胞(輔助性T細胞,helper T cell，簡稱Th細胞)處于動態平衡，維持著細胞免疫和體液免疫的正常功能狀態.隨著對運動免疫研究的深入，許多學者認為Th1/Th2淋巴細胞失衡與運動免疫抑制有密切關系.由于Th1和Th2細胞的表面標志物無法區分，只能通過細胞亞群所分泌的細胞因子的不同，對Th1和Th2細胞進行間接測定.

細胞因子的檢測[18-19]主要包括細胞生物學檢測法、免疫學檢測法及分子生物學檢測法.

1)生物學檢測法又稱生物活性檢測法.根據細胞因子具有的不同活性，對其進行檢測.生物活性檢測法有細胞增殖法、靶細胞殺傷法、細胞因子誘導的產物分析法等.該檢測法敏感性較高，但特異性較差、操作煩瑣、易受干擾.

2)免疫學檢測法是根據細胞因子的抗原性與相應的特異性抗體結合的特性，通過免疫學技術如同位素、熒光或酶標記技術測定細胞因子的含量.有放射免疫測定法、免疫熒光法、酶聯免疫吸附法(ELISA)、酶聯免疫斑點法(ELISPOT)、流式細胞術等.

目前使用較多的是ELISA法，其優點是特異、方便、易標準化和批量化，很適合臨床應用.其缺點是敏感性較低.隨著研究技術的進步，ELISPOT已應用到細胞因子的檢測中，它可以從單細胞水平觀察細胞因子的表達.ELISPOT比ELISA具有更高的靈敏度，更為高效、簡單、快捷.

流式細胞術和ELISPOT技術均是胞內細胞因子檢測的理想手段.流式細胞術能快速、簡單地進行單細胞水平細胞因子的檢測，同時還能較精確地判斷不同分泌特性的細胞亞群.流式細胞術和ELISPOT技術已在運動免疫的研究中得到較為廣泛的認可和應用.

3)分子生物學檢測方法測定的并非細胞因子本身，而是利用細胞因子的基因探針檢測特定細胞因子基因表達的技術.通過聚合酶鏈反應法(PCR)、實時熒光定量PCR(RT-PCR)或熒光定量PCR方法，可對細胞因子的DNA或RNA進行檢測.PCR技術是用于體外放大擴增特定的DNA片段以獲得大量拷貝數的分子生物學技術.PCR技術從1985年問世以來，就得到了普遍的關注和應用.20世紀90年代中期發展起來的RT-PCR技術，是從定性到定量的飛躍，被認為是一種重復性好、靈敏性和準確性都很高的檢測方法[20-21].RT-PCR的出現，毫無疑問地成為了檢測基因表達量的最適合方法.上海體育學院人體運動科學研究人員探索了絕對定量的實時熒光PCR細胞因子mRNA檢測方法，該方法可檢測外周血白細胞γ-干擾素、白細胞介素-2、白細胞介素-4和白細胞介素-10等細胞因子mRNA的表達量，由于它不需要對免疫細胞進行刺激，因而可反映生理狀態下機體的免疫機能[22].在運動免疫的研究中，運用絕對定量的實時熒光PCR細胞因子mRNA檢測，能夠較早地從mRNA水平檢測到外周血細胞自發性細胞因子的表達，在某種程度上可以認為更具有前瞻性和敏感性.

2.2 免疫球蛋白的檢測

免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)屬免疫活性分子，指存在于血漿中的一類具有抗體活性的或化學結構與抗體相似的球蛋白.主要參與機體的體液免疫，在免疫防御、免疫自穩、免疫監控中發揮作用.檢測運動中免疫球蛋白IgG,IgA,IgM等變化,可反映運動機體的體液免疫狀況.

免疫球蛋白的檢測方法有單向擴散法、免疫濁度法(透射濁度法、散射濁度法)、免疫電泳法和酶聯免疫吸附法等.單向擴散法、免疫電泳法操作簡便，但準確性較差.免疫濁度法是免疫定量檢測的一大進步，它是將免疫沉淀反應與現代光學測量儀器、自動化檢測系統相結合所進行的定量檢測方法，具有快速、精確等特點，能夠檢測微量蛋白和超微量生物活性物質，已普遍應用于免疫球蛋白的檢測中.

3 結 語

隨著運動免疫檢測方法的日趨深入，尤其是生物技術在運動免疫研究中的不斷拓展，我們有理由相信，會有更多新的、有效的免疫學研究方法運用于運動免疫的研究中，筆者將從更深層次上理解固有免疫和適應性免疫、免疫細胞和免疫分子間的內在聯系，運動所致的免疫機能變化及運動免疫抑制的機制將得到更進一步地闡明.

[1]沈關心,周汝麟.現代免疫學實驗技術[M].2版.武漢:湖北科學技術出版社,2002:391-394.

[2]但剛,劉晨霞.T淋巴細胞功能及檢測方法[J].國際檢驗醫學雜志.2015,26(3):377-379.

[3]Rehm K,Sunesara I,Marshall G D.Increased circulating anti-inflammatory cells in marathon-trained runners[J].Int J Sports Med,2015,36(10):832-836.

[4]Xing J Q,Zhou Y,Fang W,et al.The effect of pre-competition training on biochemical indices and immune function of volleyball players[J].Int J Clin Exp Med,2013,6(8):712-715.

[5]Zhang X,Matsuo K,Farmawati A,et al.Exhaustive exercise induces differential changes in serum granulysin and circulating number of natural killer cells[J].Tohoku J Exp Med,2006,210(2):117-124.

[6]Roberts C,Pyne D B,Horn P L.CD94 expression and natural killer cell activity after acute exercise[J].J Sci Med Sport,2004,7(2):237-247.

[7]匡晶,袁海平,史仍飛,等.摔跤運動員冬訓大負荷訓練期間若干生化及免疫指標的監測研究[J].體育科學,2006,26(5):37-40.

[8]Faraoni I,Cottarelli A,Giuliani A,et al.A novel telomerase-based approach to detect natural cell-mediated cytotoxic activity against tumor cells in vitro[J].J Immunol Methods,2005,305(2):162-172.

[9]Wallace D,Hildesheim A,Pinto L A.Comparison of benchtop microplate beta counters with the traditional gamma counting method for measurement of chromium-51 release in cytotoxic assays[J].Clin Diagn Lab Immunol,2004,11(2):255-260.

[10]顧忠民,馬忠森,安繼紅,等.改良MTT比色法檢測NK細胞活性[J].吉林大學學報:醫學版,2003,29(1):119-120.

[11]張嘉,王晶石,王旖旎,等.一種新型穩定的流式細胞術檢測NK細胞活性的方法[J].白血病·淋巴瘤,2015,24(8):264-266.

[12]Budd R C,Miescher G C,Howe R C.Developmentally regulated expression of T cell receptor beta chain variable domains in immature thymocytes[J].J Exp Med,1987,166(2):577-582.

[13]Godfrey D I,Hammond K J,Poulton L D,et al.NKT cells:facts,functions and fallacies[J].Immunol Today,2000,21(11):573-583.

[14]Baxter A G,Kinder S J,Hammond K J,et al.Association between alphabeta TCR+CD4-CD8- T-cell deficiency and IDDM in NOD/Lt mice[J].Diabetes,1997,46(4):572-582.

[15]王恬,陳佩杰,高炳宏.模擬低氧訓練對女子賽艇運動員淋巴細胞亞群等指標變化的影響[J].體育科學,2006,26(6):59-61.

[16]閻有功,黃光華,張利方.第四種淋巴細胞——NKT細胞[J].生命的化學,2003,23(4):284-286.

[17]Steinman R M,Cohn Z A.Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice:morphology,quantitation,tissue distribution[J].J Exp Med,1973,137(5):1142-1162.

[18]李梅,宋達琳.細胞因子檢測技術進展[J].國際檢驗醫學雜志,2006,27(6):540-542.

[19]Stenken J A,Poschenrieder A J.Bioanalytical chemistry of cytokines——A review[J].Anal Chim Acta,2015,853:95-115.

[20]Giulietti A,Overbergh L,Valckx D,et al.An overview of real-time quantitative PCR:applications to quantify cytokine gene expression[J].Methods,2001,25(4):386-401.

[21]Bustin S A.Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR):trends and problems[J].J Mol Endocrinol,2002,29(1):23-39.

[22]陳佩杰,董強剛,王茹.生理狀態下外周血白細胞γ-干擾素、白細胞介-2、白細胞介素-4和白細胞介素-10基因表達的熒光定量PCR檢測[J].體育科學,2006,26(1):74-76.

(責任編輯 杜利民)

Research progress on detection methods of sports immunology

WANG Tian

(HangzhouCollegeofPreschoolTeacherEducation,ZhejiangNormalUniversity,Hangzhou310012,China)

With the development of biotechnology, an increasing number of high technologies and methods had been used in research on sports immunology. By using literature method, it was discussed in detail on detection methods of cellular immunology and immune molecules, compared and analyzed different detection methods, provided methodology basis for sports immunology, and made reference for determining and identifying phenomena and mechanisms of sports immunosuppression through more effective research methods.

sports immunology; detection; methods; immune cells; cytokines

10.16218/j.issn.1001-5051.2016.04.019

2016-08-16；

2016-09-15

國家自然科學基金資助項目(30671012)

王 恬(1961-)，女，浙江金華人，教授，博士.研究方向:運動生理學;運動醫學.

G804.2;G804.5

A

1001-5051(2016)04-0471-04