維拉帕米對梗阻性黃疸大鼠肝損傷的保護作用及機制探討

禹良國，王崇高，陸志斌，蔡華忠，徐三榮

（1江蘇建康職業學院，2南京市浦口區中心醫院，江蘇南京211800；3江蘇大學附屬醫院，江蘇鎮江212001）

維拉帕米對梗阻性黃疸大鼠肝損傷的保護作用及機制探討

禹良國1，王崇高2，陸志斌2，蔡華忠3，徐三榮3

（1江蘇建康職業學院，2南京市浦口區中心醫院，江蘇南京211800；3江蘇大學附屬醫院，江蘇鎮江212001）

目的：探討梗阻性黃疸時大鼠肝組織細胞凋亡與NF-κB表達的變化，并研究維拉帕米對大鼠肝臟損傷的保護作用.方法：選取80只雄性SD大鼠隨機分成假手術組（Sham組）、膽總管結扎組（BDL組）、膽總管結扎后不同劑量維拉帕米干預組（BDL＋V1－3組），分別于術后第7天、14天將大鼠處死，比較各組大鼠肝組織中丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）含量的變化、細胞凋亡及NF-κB P65蛋白的表達，以及血清丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST）的變化.結果：各維拉帕米干預組MDA低于BDL組而SOD高于BDL組，維拉帕米可不同程度下調肝組織NF-κB的表達，并減輕細胞凋亡，且呈劑量依賴性.結論：鈣通道阻滯劑維拉帕米可減輕梗阻性黃疸大鼠肝損害，NF-κB的活化可能是介導肝臟功能損害的重要因素.

維拉帕米；梗阻性黃疸；核因子-κB；細胞凋亡；肝損傷

0 引言

梗阻性黃疸（obstructive jaundice，OJ）是一種較為普遍的外科疾病，其會引起肝臟等機體各系統器官發生損害以及一系列的病理生理改變.有報道［1－3］表明，梗阻性黃疸患者有較高的死亡率和術后并發癥發生率，這主要與其內促炎細胞因子的過度釋放、毒素血癥以及氧化應激等密切相關.肝組織核因子-κB（NF-κB）能高效參與誘導，可高效誘導參與TNF-α、IL-6、iNOS以及自由基等免疫和炎癥反應的炎癥介質［4］，在多種免疫炎癥相關基因的轉錄調控中起核心作用［5］.本研究以自制梗阻性黃疸大鼠模型作為研究對象，探討梗阻性黃疸時大鼠肝組織細胞凋亡與NF-κB表達的變化，并研究維拉帕米對大鼠肝臟損傷的保護作用，現報道如下.

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組選取江蘇大學實驗動物中心80只體重為250～300 g的健康雄性SD大鼠作為研究對象，將其通過隨機分組的方法分成5組：假手術組（Sham組），膽總管結扎組（BDL組），膽總管結扎后腹腔注射1 mg維拉帕米干預組（BDL＋V1組），2 mg維拉帕米組（BDL＋V2組），5 mg維拉帕米組（BDL＋V3組），每組16只.

1.2 動物模型的建立大鼠在可自由飲水的條件下，禁食12 h后進行手術，麻醉方法為腹腔注射氯胺酮，劑量為100 mg/kg，在無菌環境中取上腹部正中縱切口進腹，用3－0號絲線在膽總管完全游離進行雙重結扎，結間橫斷膽總管后逐層關腹.Sham組大鼠不進行結扎和切斷，只游離膽總管.

1.3 處理方法BDL＋V1－3組動物模型建立后第1天直至處死，分別給予維拉帕米（美國Sigma公司）1、2、5 mg/kg，腹腔注射.其余兩組則同期給予等量生理鹽水，腹腔注射.分別于給藥后第7天、14天將動物處死（n＝8），下腔靜脈采血，留存血清備用；將大鼠右葉肝組織，部分置于4%多聚甲醛溶液固定，其余迅速置液氮再轉存－70℃深低溫冰箱.

1.4 檢測指標

1.4.1 肝臟組織病理學 將固定好的肝臟組織常規石蠟包埋，HE染色制片后于光鏡下觀察.

1.4.2 肝功能測定 通過全自動生化分析儀（日本Olympus AU2700）檢測大鼠血清各項肝功能指標包括總膽紅素（TB）、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）以及天冬氨酸氨基轉移酶（AST）.

1.4.3 肝組織MDA和SOD的檢測 取1.3方法下制備的大鼠肝組織200 mg，通過內切式勻漿機制備成10%肝組織勻漿（重量體積比加生理鹽水），離心后取組織勻漿上清按說明書進行檢測.MDA、SOD測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所.

1.4.4 NF-κB P65蛋白的表達的檢測 選擇的方法為免疫組化Envision二步法，空白對照為以PBS代替一抗.兔抗大鼠NF-κB P65多克隆抗體（美國Cell Signaling Technology公司），Envision試劑盒（丹麥Dako公司）.取1.3項下制備的肝組織（4%多聚甲醛固定），進行石蠟包埋后切片.根據光鏡所見，陽性信號為細胞核和/或胞漿出現棕黃色顆粒.每張切片隨機取5個高倍鏡不重復視野，計算陽性細胞百分率.1.4.5 TUNEL法檢測肝細胞凋亡 細胞凋亡檢測試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司，以PBS代替一抗.凋亡細胞在光鏡下細胞核中棕黃著色.每例切片計數5個400倍視野，凋亡指數（AI）為平均每100個細胞核中含凋亡細胞個數.

1.5 統計學處理采用SPSS17.0統計學軟件進行單因素方差分析，計量資料用±s表示，組間比較用t檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義.

2 結果

2.1 肝組織病理學改變根據肉眼觀察，除Sham組外，其余各組大鼠第7天、14天處死后，肝臟均呈黃褐色，且明顯腫大，膽總管近端出現顯著擴張，且張力較大.根據光鏡所見，BDL組大鼠第7天標本出現小膽管增生，匯管區改變明顯，出現大量炎性細胞浸潤，第14天標本小膽管增生明顯，部分區域肝細胞出現變性、壞死；BDL＋V1－3組大鼠肝臟病理改變較BDL組輕；Sham組大鼠則無顯著肝臟病理改變.

2.2 各組大鼠肝功能指標變化情況比較Sham組的血清TB水平顯著低于BDL＋V1－3組和BDL組；BDL組的7 d、14 d血清ALT和AST水平均顯著高于BDL＋V1－3組，差異具有統計學意義（P＜0.05，表1）.

表1 各組大鼠血清生化指標的變化（n＝16，±s）

表1 各組大鼠血清生化指標的變化（n＝16，±s）

bP＜0.01 vs Sham組；aP＜0.05 vs BDL組，dP＜0.01 vs BDL組.

組別TB（ummol·L－1）ALT（U·L－1）AST（U·L－1）Sham組7 d4.28±1.1041.13±11.00146.75±25.19 14 d3.09±0.8737.50±11.82143.25±27.05 BDL組7 d179.83±16.99b171.88±21.61b758.25±33.35b14 d173.65±32.10b164.75±36.96b802.13±35.87bBDL＋V1組7 d167.25±20.65b145.75±19.30bd617.75±45.57bd14 d171.61±23.03b144.62±29.86b763.88±26.00baBDL＋V2組7 d164.50±21.06b139.50±20.58bd618.63±32.62bd14 d169.84±22.58b143.63±32.40b763.63±26.47baBDL＋V3組7 d165.55±20.90b137.50±18.65bd601.13±39.83bd14 d170.06±19.35b140.63±30.81b759.25±26.37ba

2.3 各組大鼠肝組織MDA及SOD含量變化情況比較Sham組的血清MDA含量明顯低于其它各組，但SOD含量明顯高于其它各組；但在BDL＋V1－3組7 d、BDL＋V2－3組14 dMDA含量低于BDL組；而在BDL＋V2－3組7 d、BDL＋V1－3組14 dSOD含量高于BDL組，差異具有統計學意義（P＜0.05，表2）.

2.4 肝組織NF-κB P65蛋白表達及凋亡指數比較

Sham組肝組織僅出現少量淡黃色細胞胞漿，未發現胞核著色；BDL組胞漿染色加深，為棕黃色，且出現胞核著色；BDL組NF-κB P65蛋白在7 d和14 d的表達均顯著高于BDL＋V1－3組，差異具有統計學意義（P＜0.05，表3）.

表2 各組大鼠肝組織MDA及SOD含量變化情況比較（n＝16，±s）

表2 各組大鼠肝組織MDA及SOD含量變化情況比較（n＝16，±s）

aP＜0.05 vs Sham組，bP＜0.01 vs Sham組；cP＜0.05 vs BDL組，dP＜0.01 vs BDL組.

組別MDA（nmoL/mgprot）SOD（U/mgprot）Sham組7 d1.94±0.58198.90±26.04 14 d1.88±0.24205.71±24.52 BDL組7 d4.36±0.82b141.95±25.04b14 d5.63±1.49b118.29±14.96bBDL＋V1組7 d3.33±0.66bc169.26±24.00a14 d4.46±0.97b137.09±12.77bcBDL＋V2組7 d3.25±0.72bd170.49±30.55ac14 d4.45±1.05bc139.51±12.72bcBDL＋V3組7 d3.22±0.66bd173.36±27.30ac14 d4.36±0.98bc143.62±11.90bc

表3 各組大鼠肝臟NF-κB P65蛋白表達及凋亡指數比較（n＝16，±s）

表3 各組大鼠肝臟NF-κB P65蛋白表達及凋亡指數比較（n＝16，±s）

bP＜0.01 vs Sham組；aP＜0.05 vs BDL組，dP＜0.01 vs BDL組.

組別NF-κB P65蛋白AI Sham組7 d5.13±0.923.25±1.04 14 d4.30±1.393.88±1.36 BDL組7 d15.48±3.27b32.63±5.80b14 d21.45±3.58b41.63±5.78bBDL＋V1組7 d12.18±3.23ba25.88±5.77ba14 d17.23±2.86bd36.75±5.68baBDL＋V2組7 d11.53±3.11bd25.50±4.81bd14 d16.95±3.17bd35.88±5.44baBDL＋V3組7 d11.45±2.60bd25.13±4.94bd14 d16.28±3.23bd33.75±6.16bd

2.5 肝細胞凋亡的檢測Sham組僅出現少量凋亡肝細胞，其余各組均出現大量凋亡肝細胞；但BDL組凋亡肝細胞顯著高于BDL＋V1－3組，差異具有統計學意義（表3）.

2.6 NF-κB P65蛋白的表達與凋亡指數相關性分析

Spearman相關分析結果表明，梗阻性黃疸大鼠肝組織NF-κB p65蛋白的表達與細胞凋亡正相關（7 d：r＝0.733，P＜0.01；14 d：r＝0.679，P＜0.01）.

3 討論

NF-κB作為一種廣泛存在于多種細胞中的轉錄因子，嚴重影響著機體的免疫和炎癥反應.NF-κB在非激活狀態下主要存在于胞漿中，其存在形式為與其抑制蛋白IκB結合成三聚體復合物.當其受到外界因素包括細胞因子、氧化應激以及細菌產物等刺激時被激活，然后進入細胞核，導致相關基因發生轉錄［4］.正常情況下肝細胞中無活性NF-κB存在，但在肝枯否細胞中可以檢測到NF-κB.相關研究［6－7］報道中指出，在肝枯否細胞中，NF-κB最初被激活，但是如果肝細胞受到白介素和腫瘤壞死因子等刺激，引起其NF-κB活性增強.相關研究［8－9］報道，梗阻性黃疸時肝臟的炎性損傷與NF-κB及其下游調控的炎癥因子的高表達密切相關.

梗阻性黃疸時肝臟損害的重要特征為肝細胞的凋亡，而細胞凋亡的發生機制尚未充分闡明.目前的研究認為，梗阻性黃疸時細胞凋亡可能受到多種因素包括促炎細胞因子、氧自由基、線粒體功能障礙及胞內鈣超載等的影響［5，10］.目前臨床上治療梗阻性黃疸及其圍手術期護理的主要內容為提高患者肝功能，避免肝細胞發生凋亡.Han等［11］報道表明，肝細胞凋亡在梗阻性黃疸早期開始出現，且其數量隨著黃疸的加重而顯著上升，但由于梗阻性黃疸后期患者的凋亡調控機制被激活，同時肝臟纖維組織出現增生，凋亡細胞數逐漸下降.細胞凋亡是梗阻性黃疸肝損害發生和發展變化的重要機制之一，同時其可能是梗阻性黃疸時肝臟損害的早期事件.

Hoesel等［4］報道表明，NF-κB參與細胞凋亡調控的具體機制尚未十分明確，但其能夠調控多種凋亡相關基因的轉錄，能夠起到抑制細胞凋亡和促進細胞凋亡的雙重作用.Kucharczak等［12］報道因活化的NF-κB在不同時間、不同部位組成不同的二聚體，能夠調控其相應靶基因以及轉錄相應蛋白質，所以能夠在細胞凋亡的最終效應中起到雙重作用，同時可能還受到同時激活的其他轉錄因子、細胞環境及外界刺激物種類等因素的影響.

正常機體內會有少量不同種類自由基產生，其中具有活性的氧自由基是作用最為廣泛的一種.Aliomrani等［13］報道表明，氧自由基在患者發生膽道梗阻的早期就參與進來.Badger等［14］報道，膽道梗阻時細胞內、外活性氧量上升，其能夠使細胞生物膜發生脂質過氧化反應，同時能夠激活NF-κB，最終導致炎癥蛋白基因以及促炎細胞因子的過度表達，這又能促進活性氧的生成形成正反饋環，進而使肝臟組織的炎性損傷加重.相關研究［15－16］報道表明，谷胱甘肽（GSH）、吡咯烷二硫代氨基甲酸酯（PDTC）以及超氧化物歧化酶（SOD）等能夠通過抑制氧自由基的生成來實現抑制NF-κB活性的目的，同時還能抑制IL-1β和IL-6基因的表達.

生理情況下，鈣離子在細胞內外存在巨大的濃度差，此為其信息傳遞的物質基礎.如果細胞內Ca2＋的釋放增加或者細胞外Ca2＋發生內流，則胞漿Ca2＋濃度會上升，此時細胞即被激活.Collage等［17－18］報道細胞內鈣穩態被打破是細胞發生炎性損傷的重要機制之一，Ca2＋活動在各種炎癥以及免疫性疾病的發生中起著非常重要的作用.研究［19－21］報道梗阻性黃疸引起的多種損傷因素如內毒素血癥、缺血、缺氧以及氧化應激等均能導致肝細胞出現ATP缺乏，胞膜受損，Ca2＋發生非正常跨膜內流，最終出現胞漿內鈣超載現象.肝細胞、枯否細胞和肝竇內皮細胞均可出現鈣超載現象.維拉帕米是一種鈣通道阻滯劑，其作用的發生依賴于L型電壓，其減輕細胞內鈣超載的機制主要為與鈣通道α亞單位兩個不同的位點相結合，使通道蛋白構象發生改變，最終實現阻滯胞外Ca2＋內流的目的.

本研究結果顯示，梗阻性黃疸時，活性氧以及丙二醛的含量上升，但是抗氧化酶SOD含量下降；大量肝組織NF-κB被激活，同時凋亡肝細胞數量上升，兩者呈正相關.腹腔注射不同劑量的維拉帕米后，ALT、AST、肝組織NF-κB P65蛋白及細胞凋亡較BDL組均顯著下降，其下降程度與維拉帕米劑量相關.這提示維拉帕米能夠通過抑制梗阻性黃疸時肝組織NF-κB的激活，降低肝臟損害程度.細胞內鈣穩態及氧化/抗氧化等平衡狀態被打破可能與NF-κB和細胞凋亡的變化密切相關.因鈣通道阻滯劑能夠調節細胞內鈣穩態，所以能夠避免活性氧的生成、調控NF-κB.同時，Steffan等［22］報道細胞內Ca2＋濃度與IκB的降解呈正相關，鈣通道阻滯劑能夠通過避免IκB的降解，來實現抑制NF-κB活化轉位的目的.

綜上所述，NF-κB的激活在梗阻性黃疸時肝臟等器官損害的多種致病機制中起到紐帶的作用［23］，其持續、過度的激活能夠增加肝臟損傷及各種并發癥的發生率.將抑制NF-κB的表達與及早解除消除梗阻性黃疸始動環節結合起來，能夠提高膽道梗阻患者的臨床療效，改善患者的預后.

［1］湯 地，呂明德，梁力建，等.阻塞性黃疸病人圍手術期肝腎功能保護的臨床研究［J］.中華肝膽外科雜志，2002，8（10）：614－616.

［2］Zhu L，Chen X.Change and significance of T-cell subsets and TNF-α in patients with advanced malignant obstructive jaundice treated by percutaneous transhepatic biliary external and internal drainage［J］.Front Med China，2007，1（4）：364－368.

［3］Martínez-Cecilia D，Reyes-Díaz M，Ruiz-Rabelo J，et al.Oxidative stress influence on renal dysfunction in patients with obstructive jaundice：A case and control prospective study［J］.Redox Biol，2016（8）：160－164.

［4］Hoesel B，Schmid JA.The complexity of NF-κB signaling in inflammation and cancer［J］.Mol Cancer，2013，12：86.

［5］李達民.梗阻性黃疸致肝細胞凋亡的研究進展［J］.中國普通外科雜志，2014，23（7）：967－971.

［6］詹志林，卞建民，孔勝兵.PP2A在肝枯否細胞NF-κB活化中的調控作用及其效應機制［J］.肝膽外科雜志，2011，19（6）：467－470.

［7］Fox ES，Kim JC，Tracy TF.NF-kappaB activation and modulation in hepatic macrophages during cholestatic injury［J］.J Surg Res，1997，72（2）：129－134.

［8］賀 凱，蘇 松，倪建斌，等.膽道梗阻肝損傷早期NF-κB活性變化的影響及意義［J］.肝膽胰外科雜志，2013，25（6）：477－479.

［9］Lin SY，Wang YY，Chen WY，et al.Beneficial effect of quercetin on cholestatic liver injury［J］.J Nutr Biochem，2014，25（11）：1183－1195.

［10］Kosar NM，Tosun M，Polat C，et al.Hepatocyte apoptotic index and p53 expression in obstructive jaundice rats［J］.Bratisl Lek Listy，2014，115（6）：352－356.

［11］Han JM，Kim HG，Choi MK，et al.Artemisia capillaris extract protects against bile duct ligation-induced liver fibrosis in rats［J］.Exp Toxicol Pathol，2013，65（6）：837－844.

［12］Kucharczak J，Simmons MJ，Fan Y，et al.To be，or not to be：NF-kappaB is the answer－－role of Rel/NF-kappaB in the regulation of apoptosis［J］.Oncogene，2003，22（56）：8961－8982.

［13］Aliomrani M，Sepand MR，Mirzaei HR，et al.Effects of phloretin on oxidative and inflammatory reaction in rat model of cecal ligation and puncture induced sepsis［J］.Daru，2016，24（1）：15.

［14］Badger SA，Jones C，McCaigue M，et al.Cytokine response to portal endotoxaemia and neutrophil stimulation in obstructive jaundice［J］.Eur J Gastroenterol Hepatol，2012，24（1）：25－32.

［15］Gloire G，Legrand-Poels S，Piette J.NF-kappaB activation by reactive oxygen species：fifteen years later［J］.Biochem Pharmacol，2006，72（11）：1493－1505.

［16］Toka? M，Aydin S，Taner G，et al.Hepatoprotective and antioxidant effects of lycopene in acute cholestasis［J］.Turk J Med Sci，2015，45（4）：857－864.

［17］Collage RD，Howell GM，Zhang X，et al.Calcium supplementation during sepsis exacerbates organ failure and mortality via calcium/calmodulin-dependent protein kinase kinase signaling［J］.Crit Care Med，2013，41（11）：e352－360.

［18］錢愛華，宋丹丹，李 勇，等.電壓門控鈣通道在三硝基苯磺酸誘導的炎癥性內臟高敏中作用機制的研究［J］.中華消化雜志，2011，31（6）：381－386.

［19］戴 維，陳念平，陳賽紅，等.柴胡皂苷d對阻塞性黃疸大鼠肝細胞游離鈣及基質交聯分子1的調控機制［J］.中華實驗外科雜志，2012，29（11）：2122－2124.

［20］崔瑞冰，閻 明.肝細胞鈣離子通道及其在乙醇誘導肝細胞損傷中作用研究進展［J］.中國肝臟病雜志：電子版，2012，4（4）：47－52.

［21］崔 宏，崔桂英，劉東舉，等.維拉帕米對三磷酸肌醇引起的大鼠肝細胞鈣釋放激活的鈣電流的影響［J］.中國應用生理學雜志，2000，16（3）：265－267.

［22］Steffan NM，Bren GD，Frantz B，et al.Regulation of IkB alpha phosphorylation by PKC-and Ca（2＋）-dependent signal transduction pathways［J］.J Immunol，1995，155（10）：4685－4691.

［23］許朝龍，鄔善敏.梗阻性黃疸對多器官系統損害及其機制的研究進展［J］.腹部外科，2015，28（5）：367－370.

Protective effect and mechanism of verapamil on liver injury of obstructive jaundice rats

YU Liang-Guo1，WANG Chong-Gao2，LU Zhi-Bin2，CAI Hua-Zhong3，XU San-Rong3

1Jiangsu Jiankang Vocational College，2Nanjing Pukou Central Hospital，Nanjing 211800，China；3Affiliated Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang 212001，China

AIM：To investigate the role of NF-κB and apoptosis in liver injury of rats with obstructive jaundice and the protective effect of verapamil.METHODS：A total of 80 SD male rats were randomly divided into Sham group，BDL group and BDL＋V1－3group，with 16 rats in each group.The rats were sacrificed at 7th and 14th day after operation，then the changes of MDA and SOD in hepatic tissue，hepatic NF-κB activities and cell apoptosis，ALT and AST of each group were compared.RESULTS：Compared with BDL group，lower MDA and higher SOD were found in different dose of verapamil group，verapamil can down-regulate the expression of NF-κB and reduce the apoptosis at different levels，presenting dose dependence.CONCLUSION：The activation of NF-κB may be one of the most important factors in liver injury.Verapamil can protect against the liver injury in rats with obstructive jaundice through reducing the expression of NF-κB and cell apoptosis.

verapamil；obstructive jaundice；NF-κB；apoptosis；liver injury

R96

A

2095-6894（2016）12-07-04

2016－10－22；接受日期：2016－11－10

南京市科技發展計劃項目（201402061）；南京醫科大學科技發展基金項目（2012NJMU236）

禹良國.碩士，主治醫師.研究方向：普通外科的基礎與臨床.E-mail：yu_lg＠126.com