地塞米松對兔眼水通道蛋白-1表達的影響及其與眼壓的關系

杜靜　劉蘇

地塞米松對兔眼水通道蛋白-1表達的影響及其與眼壓的關系

杜靜1劉蘇2

目的 研究地塞米松（DEX）對兔眼小梁內(nèi)皮細胞（TM）和睫狀體無色素上皮（NPCE）細胞水通道蛋白-1（AQP1）表達的影響。方法 建立兔皮質(zhì)類固醇性高眼壓模型，用免疫組化和免疫熒光方法檢測高眼壓組與正常對照組AQP1表達水平的差異。結(jié)果 實驗組兔眼NPCE的AQP1表達比正常對照組增強（P＜0.05），而在TM細胞則減弱（P＜0.05）。結(jié)論 地塞米松能使兔眼眼壓升高，可能是通過抑制AQP1在TM的表達，并使NPCE的AQP1表達上調(diào)，這可能是皮質(zhì)類固醇性青光眼的病理機制之一。

地塞米松；睫狀體無色素上皮細胞；小梁細胞；水通道蛋白-1；青光眼

1　引言

水通道蛋白（aquaporins，AQPs）是一類廣泛存在于哺乳動物體內(nèi)細胞膜或細胞內(nèi)囊泡中的水分子跨膜轉(zhuǎn)運蛋白，目前在眼組織中發(fā)現(xiàn)有5種AQP亞型［1-2］，與眼內(nèi)液體轉(zhuǎn)運和眼功能的維持密切相關。目前皮質(zhì)類固醇性青光眼（corticosteroid glaucoma）的發(fā)病機制不明確，但睫狀體房水產(chǎn)生過多或者小梁網(wǎng)房水流出障礙引起的眼內(nèi)壓的升高是公認的主要危險因素［3］。AQP家族的發(fā)現(xiàn)，為房水動力學開啟了新的研究領域。

2　材料與方法

2.1主要試劑及實驗動物

地塞米松磷酸鈉（Sigma），鼠抗兔AQP1多克隆抗體（ADI，免疫組化一抗），山羊抗鼠IgG（Sigma，免疫組化二抗），Cy3熒光標記羊抗鼠IgG（Sigma，免疫熒光二抗），SABC免疫組化試劑盒（中杉）。8周齡健康新西蘭大白兔30只。

2.2實驗方法

2.2.1兔激素性高眼壓模型的建立 采用隨機數(shù)字法將30只兔分為兩組：實驗組（20只）和正常對照組（10只）。處理前用Schiotz眼壓計測量兔眼壓［4］，然后用1%地塞米松磷酸鈉溶液［5］滴實驗組雙眼，用無菌生理鹽水滴對照組雙眼，連續(xù)3周，監(jiān)測眼壓。眼壓成功升高的實驗組兔再隨機分為DEX組（10只）和觀察組（9只，死亡1只）。DEX組立即取下眼球標本固定，觀察組繼續(xù)監(jiān)測眼壓6周，最后取下眼球標本固定、包埋、切片。

2.2.2免疫組織化學（SABC法）和免疫熒光 石蠟片經(jīng)常規(guī)處理及免疫組化、免疫熒光方法處理，拍照采集圖片。陰性對照用PBS緩沖液代替一抗。最后采集圖片用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件定量分析免疫組化染色的陽性光密度值。

2.3統(tǒng)計學方法

DEX作用前后眼內(nèi)壓數(shù)據(jù)用自身配對t檢驗方法。正常對照組、DEX組和觀察組之間免疫組化的光密度值（OD）的比較用多個樣本均數(shù)間比較的SNK法單因素方差分析。統(tǒng)計學資料用SPSS 19.0軟件進行分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

3　結(jié)果

3.1眼壓

用1%地塞米松磷酸鈉溶液滴眼可以成功建立兔皮質(zhì)類固醇性高眼壓模型，成功率95%（P＜0.05）。用藥前兔眼基礎眼壓為（35.591±2.513 1）mm Hg，實驗組用藥后第13～19 d時達高峰，約（50.5±3.829 7）mm Hg，觀察組眼壓在停藥8周后基本降到用藥前水平。

3.2組織病理學改變

3.2.1免疫熒光切片 AQP1在正常兔眼角膜內(nèi)皮和虹膜后色素上皮、睫狀體無色素上皮、小梁內(nèi)皮等多處表達。Cy3熒光成亮紅色，表達部位在陽性細胞的胞膜。

3.2.2免疫組化切片 AQP1的表達在組織切片上表現(xiàn)為陽性細胞膜上的棕褐色顆粒。AQP1在DEX組NPCE的表達（0.365±0.112）較對照組（0.276±0.077）增強（P＜0.05），在觀察組（0.280±0.086）則恢復到正常水平。AQP1在DEX組TM的表達（0.164±0.085）較對照組減弱（0.265±0.056）（P＜0.05），陽性細胞數(shù)量也減少，觀察組（0.181±0.066）與DEX組的情況接近、尚未恢復。

4　討論

Bogner B［2］等研究發(fā)現(xiàn)并定位了兔眼內(nèi)5個AQPs亞型。在胎鼠發(fā)育過程中AQP1表達在NPCE以及虹膜后上皮層，提示其與房水的分泌有關［6］。本實驗發(fā)現(xiàn)AQP1在兔眼TM和Schlemm管以及NPCE的內(nèi)皮表達，可以看出這種分布與眼內(nèi)房水的分泌和流出密切相關。Zhang等［7］進一步研究發(fā)現(xiàn)AQP1基因敲除鼠的房水生成明顯減少，眼壓下降，因此AQP1被證實參與了睫狀體房水的分泌過程。那么本實驗發(fā)現(xiàn)DEX使兔眼NPCE的AQP1表達上調(diào)，房水分泌增加，可以認為是激素性高眼壓的原因之一。

另一方面本實驗還發(fā)現(xiàn)DEX抑制兔眼小梁組織AQP1的表達，同樣地塞米松也抑制體外培養(yǎng)的人眼小梁細胞［8］AQP1的表達。AQP1在小梁和Schlemm管內(nèi)皮細胞的作用還不得而知，而房水的外流主要是通過細胞外途徑還是跨細胞途徑，地塞米松對房水外流阻力有哪些影響等，都有待進一步研究。

綜上所述，DEX誘導兔眼壓升高，可能是通過上調(diào)睫狀體無色素上皮AQP1的表達，增加房水生成，同時抑制小梁組織AQP1表達，同時小梁細胞減少，細胞外基質(zhì)堆積，房水排出受阻。兩方面綜合作用，導致激素性青光眼的發(fā)生。

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［4］Best M，Pola R，Galin MA，et al. Tonometric calibration for the rabbit eye［J］. Arch Ophthalmol，1970，84（2）：200-205.

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Effects of Dexamethasone on Expression of Aquaporin-1 in Rabbit Eye and the Correlation to Intraocular Pressure

DU Jing1LIU Su21 Department of Ophthalmology， Chongqing Aier Eye Hospital， Chongqing 400000， China， 2 Department of Ophthalmology， The Second Affliated Hospital of Chongqing University of Medical Sciences，Chongqing 400010， China

Objective To study the effects of dexamethasone （DEX）on expression of aquaporin-1 （AQP1） in rabbit eye's trabecular meshwork （TM） and non-pigmented ciliary epithelium （NPCE） cells. Methods To establish a rabbit model of high intraocular pressure induced by corticosteroids， and to detect the difference of AQP1 expression between high intraocular pressure group and normal control group by immunohistochemistry and immunofluorescence method. Results The expression of AQP1 of NPCE in the experimental group was stronger than that in the normal control group （P＜0.05）， while the TM cells were decreased （P＜0.05）. Conclusion Dexamethasone can increase the intraocular pressure of the rabbit eyes， may be throughinhibiting the expression of AQP1 in TM， and make AQP1 of NPCE expression up regulation， which may be one of the pathological mechanisms of corticosteroid glaucoma.

Dexamethasone， Non-pigmented ciliary epithelium，Trabecular meshwork， Aquaporin-1， Glaucoma

R775

A

1674-9308（2016）22-0212-02

10.3969/j.issn.1674-9308.2016.22.140

1重慶愛爾眼科醫(yī)院眼科，重慶 400000；2 重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院眼科，重慶 400010

劉蘇，E-mail：liusu2836@sina.com