一種以魚鱗為原料的多產物聯產工藝的建立與優化

胡 楊,王希搏,熊善柏,*,劉友明,尤 娟,尹 濤

(1.華中農業大學食品科學技術學院,國家大宗淡水魚加工技術研發分中心,湖北武漢 430070;2.水產高效健康生產湖南省協同創新中心,湖南常德 415000)

一種以魚鱗為原料的多產物聯產工藝的建立與優化

胡 楊1,2,王希搏1,熊善柏1,2,*,劉友明1,尤 娟1,2,尹 濤1

(1.華中農業大學食品科學技術學院,國家大宗淡水魚加工技術研發分中心,湖北武漢 430070;2.水產高效健康生產湖南省協同創新中心,湖南常德 415000)

魚鱗中含有豐富的膠原和鈣,可以作為生產膠原類產品和補鈣產品的原料。為了提高魚鱗的綜合利用效果,解決魚類加工過程中因副產物污染產生的環境問題,本研究以魚鱗為原料,研究聯合生產有機酸鈣、膠原和膠原蛋白肽的工藝。具體地,魚鱗先經過超聲波輔助檸檬酸脫灰制備檸檬酸鈣,再采用超聲波輔助胃蛋白酶提取膠原,最后將提取膠原后的魚鱗殘渣用于制備膠原蛋白肽,并對所建立的聯產工藝進行驗證。結果表明,魚鱗脫灰制備檸檬酸鈣的條件為:超聲波功率120 W,料液比1∶20 g/mL,檸檬酸濃度6%,處理時間180 min,草魚鱗、鰱魚鱗、沙丁魚鱗的脫灰率分別為97.8%、97.6%、98.1%;膠原提取條件為:超聲波功率180 W,料液比1∶20 g/mL,胃蛋白酶用量2000 U/g,處理時間8 h,草魚鱗、鰱魚鱗、沙丁魚鱗膠原溶出率分別為40.1%、42.2%、56.2%;膠原蛋白肽制備條件為:底物濃度5%,胃蛋白酶用量280 U/g,初始pH2,處理溫度65 ℃,草魚鱗、鰱魚鱗、沙丁魚鱗膠原溶出率分別為91.7%、89.3%、88.9%。從魚鱗中連續提取制備有機酸鈣、膠原和膠原蛋白肽的工藝具有較好的可靠性和穩定性,有望在工業化生產中得到應用。

魚鱗,有機酸鈣,膠原,膠原蛋白肽,聯產

我國是世界水產品生產和消費的大國,尤其魚類資源十分豐富。在魚類產品的消費和加工過程中會產生大量副產物,其中就包括3%～5%的魚鱗,目前對這部分魚鱗尚缺乏有效的處理手段[1-2]。據報道[2],魚鱗中含有豐富的蛋白質和鈣等,蛋白質含量約為50%～70%、鈣含量約為7%～25%,生物學效價較高。若能利用規模優勢對魚鱗加以利用,不僅可以實現魚鱗副產物的高價值,而且可促進魚類加工業的發展,減少環境污染。

截至目前,已經報道的國內外有關魚鱗加工利用的文獻較多,主要包括制備膠原、膠原蛋白肽、羥基磷灰石、補鈣劑等[3-9]。然而,針對不同產品的提取工藝是分離的,對魚鱗的利用有限,仍然存在資源浪費和環境污染等問題。在此背景下,本文擬建立一種以魚鱗為原料的多產物聯產工藝,在保證產品品質的基礎上,提高魚鱗的綜合利用效率和企業經濟效益,實現魚鱗副產物污染的零排放和降低企業生產成本。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

沙丁魚鱗 購自福建晉江;草魚鱗、鰱魚鱗 購自華中農業大學菜市場,魚鱗經蒸餾水清洗干凈后,晾干、保存備用;胃蛋白酶(1.8×105U/g) 購自拜爾迪生物技術有限公司;氫氧化鈉 購自天津市風船化學試劑科技有限公司;一水合檸檬酸 購自國藥集團化學試劑有限公司。

818型pH計 ORINO研究公司;SHA-B水浴恒溫振蕩器 常州國華電器有限公司;KQ-300DE型數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;FD-1A-50型冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司;SD-1500噴霧干燥機 上海沃迪科技有限公司;KDN-08E凱氏定氮儀 上海精隆科學儀器有限公司。

1.2 聯產工藝的建立

多產物聯產工藝流程如圖1所示。魚鱗經氫氧化鈉脫脂和去除雜蛋白后,首先采用超聲波輔助檸檬酸脫灰,制備目標產物檸檬酸鈣,脫灰后的魚鱗再經過超聲波輔助胃蛋白酶水解制備目標產物膠原,最后將提取膠原后的魚鱗殘渣進一步經胃蛋白酶高溫水解制備目標產物膠原蛋白肽。為了便于聯產工藝路線的研究,先對其中檸檬酸鈣、膠原、膠原蛋白肽制備工藝條件進行優化。

圖1 聯產工藝流程圖Fig.1 The flow chart of joint production process

1.2.1 超聲波輔助檸檬酸脫灰工藝的優化 基于預實驗結果,將超聲波功率固定為120 W,以沙丁魚鱗為原料,以脫灰率為評價指標,針對處理時間、檸檬酸濃度以及料液比設計正交實驗,各因素水平如表1所示。具體地,準確稱取一定量的保存備用的魚鱗,調節料液比1∶15 g/mL,先用0.4%的氫氧化鈉處理12 h,以去除脂肪及非膠原組分的雜蛋白,處理后的魚鱗于表1設計的實驗條件下進行脫灰處理(注意控制過程溫度在20 ℃以下),之后過濾,濾液經堿中和、過濾、干燥得到檸檬酸鈣,濾渣即為脫灰后的魚鱗,用于后續膠原及膠原蛋白肽的提取。

表1 因素水平表

1.2.2 超聲波輔助胃蛋白酶提取魚鱗膠原的工藝優化 基于預實驗結果,以膠原溶出率為評價指標,針對超聲波功率、料液比、胃蛋白酶用量以及處理時間設計正交實驗,各因素水平如表2所示。具體地,將脫灰后的魚鱗,按1∶10～1∶20 g/mL料液比加入1.0%的檸檬酸溶液,加入2000～4000 U/g的胃蛋白酶,之后于超聲波功率150～210 W條件下處理8～16 h(注意控制過程溫度在20 ℃以下),最后于低溫條件下4000 r/min離心20 min,上清液經超濾膜脫鹽、濃縮、冷凍干燥得到目標產物膠原,殘渣用于后續膠原蛋白肽的提取。

表2 因素水平表

1.2.3 胃蛋白酶提取魚鱗膠原蛋白肽的工藝優化 基于預實驗結果,以膠原溶出率和產物水解度為綜合評價指標,針對處理溫度、初始pH、底物濃度以及胃蛋白酶用量設計正交實驗,各因素水平如表3所示。具體地,將超聲波輔助胃蛋白酶提取魚鱗膠原的殘渣,用蒸餾水調節底物濃度為3%～7%,隨后用鹽酸或氫氧化鈉調節初始pH至2～4,之后加入140～420 U/g的胃蛋白酶,于55～65 ℃的溫度條件下恒溫水浴振蕩器中水解120 min,隨后沸水浴滅酶處理10 min,于4000 r/min離心20 min,上清液調節溶液pH至5～7,經濃縮、噴霧干燥得到目標產物膠原蛋白肽。

表3 因素水平表

1.3 聯產工藝的驗證

以3種魚鱗(草魚鱗、鰱魚鱗、沙丁魚鱗)為原料,以脫灰工序脫灰率、膠原提取工序和膠原蛋白肽提取工序膠原溶出率為評價指標,按優化確定的檸檬酸鈣、膠原以及膠原蛋白肽聯產工藝進行實驗,并對所得產物的性質進行分析,以此驗證所建立的聯產工藝的可靠性和穩定性,以為今后的工業化應用提供依據。

1.4 測試方法

1.4.1 魚鱗基本成分分析 參考文獻方法[10]測定魚鱗中的膠原含量,GB/T 6436-2002乙二胺四乙酸二鈉絡合滴定法測定魚鱗中的鈣含量。

1.4.2 脫灰率的測定 參考GB 5009.4-2010分別測定脫灰前后的魚鱗中的灰分總量,按式(1)計算脫灰率。

脫灰率(%)=脫灰前魚鱗中的灰分總量-脫灰后魚鱗中的灰分總量/脫灰前魚鱗中的灰分總量×100

式(1)

1.4.3 膠原溶出率的測定 參考GB/T 9695.23-2008分別測定水解上清液和水解操作前原料中的羥脯氨酸總量,按式(2)計算膠原和膠原蛋白肽提取工序的膠原溶出率。

膠原溶出率(%)=水解上清液中的羥脯氨酸總量/水解操作前原料中的羥脯氨酸總量×100

式(2)

1.4.4 水解度的測定 采用甲醛滴定法和凱氏定氮法分別測定水解上清液中的氨基氮和水解操作前原料中的總氮,按式(3)計算水解度[11-13]。

水解度(%)=水解上清液中的氨基氮/水解操作前原料中的總氮×100

式(3)

1.4.5 圓二色譜(CD)分析 參考文獻方法[14]對膠原和膠原蛋白肽的圓二色譜特征進行分析。

1.4.6 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析 參考文獻方法[14]采用SDS-PAGE對膠原和膠原蛋白肽的相對分子質量及分布進行測定。

1.5 數據分析

每組實驗重復3次以上,采用Excel進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 魚鱗基本成分分析

通常魚鱗主要由蛋白質和灰分組成,其他還含有少量脂肪、色素和黏液質等,而蛋白質和灰分的主要成分為膠原和鈣,其他雜蛋白(如魚鱗硬蛋白、角質蛋白等)和礦物質的含量很少。如表4所示,給出了3種魚鱗中的膠原和鈣含量測定結果。由表4可知,魚鱗中含有豐富的膠原,根據魚鱗來源的不同,魚鱗中膠原的含量高達39.1%～63.1%。此外,魚鱗中還含有一定量的鈣。魚鱗中膠原和鈣的總含量高達55.6%～71.7%,膠原和鈣占到了魚鱗總質量的一半及以上,說明魚鱗是一種制備有機酸鈣、膠原或膠原蛋白肽的理想原料。

表4 魚鱗基本組成成分

注:結果以干重計。

2.2 超聲波輔助檸檬酸脫灰工藝的優化

如表5所示,為超聲波輔助檸檬酸脫灰的正交實驗結果。由表5可知,在超聲波功率為120 W的條件下,料液比的極差值最大,說明其對超聲波輔助檸檬酸脫灰的影響程度最大,其次為檸檬酸濃度,處理時間的影響程度最小。隨料液比的增大,魚鱗與檸檬酸的接觸面積增大,有利于脫灰反應的進行。檸檬酸濃度的增大,同樣可增大魚鱗與檸檬酸的接觸,加快脫灰反應的進行。處理時間的延長,為魚鱗與檸檬酸的接觸提供了更多機會,魚鱗的脫灰效果更加理想。單以脫灰率看,超聲波輔助檸檬酸脫灰的最佳條件為:A3B3C3,即料液比1∶20 g/mL,檸檬酸濃度6.5%,處理時間210 min。然而,在A2B2C3,即料液比1∶20 g/mL,檸檬酸濃度6%,處理時間180 min的條件下,魚鱗的脫灰率已高達99.8%,脫灰后的魚鱗中的灰分含量為0.13%,低于企業提取魚鱗膠原時對原料灰分含量1.0%的上限要求。因此,結合企業提取魚鱗膠原時對原料灰分含量的具體控制,綜合企業生產成本(檸檬酸用量減小,處理時間縮短),理想的魚鱗脫灰條件為A2B2C3,即料液比1∶20 g/mL,檸檬酸濃度6%,處理時間180 min。曾芳[15]研究了磁力攪拌輔助檸檬酸脫灰,其在檸檬酸質量分數9.8%,料液比1∶23 g/mL的條件下,脫灰率為93.4%,該結果進一步證明了超聲波對檸檬酸脫灰具有明顯的促進作用,超聲波輔助檸檬酸脫灰不但減少了原料的使用量,同時還提高了檸檬酸的脫灰效果。

表5 超聲波輔助檸檬酸脫灰正交實驗結果

2.3 超聲波輔助胃蛋白酶提取魚鱗膠原的工藝優化

表6 超聲波輔助胃蛋白酶提取魚鱗膠原正交實驗結果

如表6所示,為超聲波輔助胃蛋白酶提取魚鱗膠原的正交實驗結果。由表6可知,超聲波功率的極差值最大,其次為料液比,胃蛋白酶用量和處理時間的極差值較小,說明超聲波功率的影響程度最大。超聲波功率對胃蛋白酶提取膠原的影響是雙向的,適度增大超聲波功率可為魚鱗和胃蛋白酶提供更多接觸機會,加快酶解反應的進行,繼續增大超聲波功率可對胃蛋白酶結構產生影響,使胃蛋白酶變性從而影響其活力。隨著酶解反應的進行,反應液的黏度會逐步增加,因此,在料液比較小的情況下,酶作用的傳遞也急劇減慢,從而影響酶解反應的進行,該現象與已有文獻[16]的報道一致。胃蛋白酶用量和處理時間的極差值較小,說明其對魚鱗膠原溶出率的影響程度較小。單以膠原溶出率來看,超聲波輔助胃蛋白酶提取魚鱗膠原的最佳條件為:A2B3C3D3,即超聲波功率180 W,料液比1∶20 g/mL,胃蛋白酶用量4000 U/g,處理時間16 h。然而,一個工藝能否得到工業化應用,除與生產工藝過程和特點有關外,同時還要結合生產成本。由正交實驗結果可知,胃蛋白酶用量和處理時間對膠原溶出率的影響程度較小,隨胃蛋白酶用量的增大和處理時間的延長,魚鱗膠原溶出率的增幅不大,但生產成本增加(胃蛋白酶用量增大、處理時間延長)。因此,綜合魚鱗膠原溶出率和企業生產成本,超聲波輔助胃蛋白酶提取魚鱗膠原的理想條件為:A2B3C1D1,即超聲波功率180 W,料液比1∶20 g/mL,胃蛋白酶用量2000 U/g,處理時間8 h。在此條件下,膠原溶出率達到45.8%,高于常規機械作用下膠原溶出率[17],說明超聲波對胃蛋白酶提取魚鱗膠原具有一定的促進作用,可提高魚鱗膠原的提取效果。

2.4 胃蛋白酶提取魚鱗膠原蛋白肽的工藝優化

由2.3的實驗結果可知,在優化確定的超聲波輔助胃蛋白酶提取魚鱗膠原的實驗條件下,魚鱗膠原溶出率為45.8%,說明魚鱗中的膠原并未完全溶解出來,仍有54.2%的膠原在殘渣中,未得到利用。為了最大程度提高魚鱗的利用價值,實現對魚鱗中膠原的回收再利用,將提取膠原后的殘渣進一步經胃蛋白酶高溫水解制備膠原蛋白肽。

表7 胃蛋白酶提取魚鱗膠原蛋白肽正交實驗結果

如表7所示,為胃蛋白酶提取魚鱗膠原蛋白肽的正交實驗結果。以膠原溶出率為評價指標,底物濃度的影響程度最大,其次為胃蛋白酶用量,初始pH和處理溫度的影響程度最小,最優的水解條件為:A3B1C1D3,即底物濃度3%,胃蛋白酶用量420 U/g,初始pH2,處理溫度65 ℃。然而,以產物水解度為評價指標,最優的水解條件為:A2B1C2D2,即底物濃度5%,胃蛋白酶用量280 U/g,初始pH2,處理溫度60 ℃。膠原溶出率和產物水解度之間并不存在一定的相關性,該結果與已有文獻[18]的報道一致。由于本實驗以膠原溶出率為主要評價指標,同時考慮產物水解度以及企業生產成本(水用量和胃蛋白酶用量減小),胃蛋白酶提取魚鱗膠原蛋白肽的理想水解條件為:A3B1C2D2,即底物濃度5%,胃蛋白酶用量280 U/g,初始pH2,處理溫度65 ℃。在此條件下,魚鱗膠原溶出率為86.0%。

2.5 聯產工藝的驗證

為進一步考察所得聯產工藝的可靠性和穩定性,以不同魚鱗為原料,對所建立的聯產工藝及條件進行驗證。如圖2所示,為聯產工藝各工序過程參數。可以看到,在優化確定的脫灰工藝條件下,草魚鱗、鰱魚鱗、沙丁魚鱗的脫灰率分別為97.8%、97.6%、98.1%,說明魚鱗中的鈣已基本完全溶解出來;經提取膠原處理,草魚鱗、鰱魚鱗、沙丁魚鱗膠原溶出率分別為40.1%、42.2%、56.2%,說明魚鱗中的膠原并未完全溶解出來,仍有一半的膠原在殘渣中,未得到利用;進一步對提取膠原后的魚鱗殘渣作提取膠原蛋白肽處理,草魚鱗、鰱魚鱗、沙丁魚鱗膠原溶出率分別達到了91.7%、89.3%、88.9%,魚鱗中的膠原已基本完全以膠原或膠原蛋白肽形式溶解出來。以上數據說明所建立的聯產工藝是有效的,基本實現了對魚鱗中鈣和膠原的回收再利用。不同魚鱗膠原溶出率差異明顯,主要在于不同魚鱗的形狀、結構等存在差異[1,19]。

圖2 聯產工藝驗證及各工序過程參數Fig.2 The joint production process validation

如圖3(A)所示,為膠原和膠原蛋白肽的圓二色譜圖。圓二色譜主要用來測定蛋白質的立體結構,具體到膠原,圓二色譜可用來表征其三股螺旋結構的完整性。通常來講,具有完整三股螺旋結構的膠原,其圓二色譜特征是在198 nm左右有一個負吸收峰,在221 nm左右有一個弱的正吸收峰[14]。當膠原的結構完整性遭到破壞,三股螺旋結構發生坍塌時,在198 nm左右波長處的負吸收峰會向低波長處發生略微移動,而在221 nm左右波長處的正吸收峰會根據三股螺旋結構被破壞的程度呈現不同程度的削弱甚至消失[20]。從圖3可以看到,膠原的圓二色譜圖在198 nm左右波長處有負吸收峰,在221 nm左右波長處有弱的正吸收峰,屬于典型的三股螺旋構象特征。而膠原蛋白肽在整個波長范圍內均沒有明顯的負吸收峰和弱的正吸收峰,說明膠原蛋白肽中已不存在完整的三股螺旋結構。

圖3 膠原和膠原蛋白肽的圓二色譜和SDS-PAGE圖譜Fig.3 CD and SDS-PAGE analysis of collagen and collagen peptide

如圖3(B)所示,為膠原和膠原蛋白肽的SDS-PAGE電泳圖譜。SDS-PAGE可用于測定膠原的相對分子質量大小。從圖3(B)可以看到,膠原的電泳圖譜主要有4條譜帶,在116～130 ku附近出現的2條譜帶分別是膠原分子的α1鏈和α2鏈,在205 ku附近出現的1條譜帶是膠原分子的β鏈,另外也觀察到了在300 ku附近出現的1條譜帶是膠原分子特有的γ鏈,而膠原蛋白肽的電泳圖譜為一個連續帶,無典型的膠原譜帶出現。導致膠原、膠原蛋白肽相對分子質量差異的主要原因是制備工藝的不同,膠原是在低溫條件下用胃蛋白酶提取得到的,在較低溫度下該酶僅作用于膠原的端肽,不作用于膠原分子的三股螺旋結構。膠原蛋白肽是在高溫條件下用胃蛋白酶水解得到的,受高溫和酶的雙重作用,魚鱗中的膠原發生變性,三股螺旋結構被破壞,因此膠原蛋白肽的相對分子質量變小,且分布變寬。此外,由于在較高溫度條件下,酶對膠原蛋白肽鍵的水解是隨機的,得到的水解產物組成較復雜,因此其電泳圖譜為一個連續帶。

3 結論

魚鱗中含有豐富的膠原和鈣,可以作為生產魚鱗有機酸鈣、膠原和膠原蛋白肽的理想原料。為了提高魚鱗的綜合利用效果,本文在優化研究魚鱗脫灰、膠原和膠原蛋白肽提取工藝條件的基礎上,建立了魚鱗有機酸鈣、膠原和膠原蛋白肽聯產工藝。具體地,魚鱗先經過氫氧化鈉脫脂和去除雜蛋白處理;隨后,在超聲波功率120 W,料液比1∶20 g/mL,檸檬酸濃度6%的條件下處理180 min,制備目標產物檸檬酸鈣;脫灰處理后的魚鱗進一步在超聲波功率180 W,料液比1∶20 g/mL,胃蛋白酶用量2000 U/g的條件下處理8 h,制備目標產物魚鱗膠原;最后,再將提取膠原后的魚鱗殘渣在底物濃度5%,胃蛋白酶用量280 U/g,初始pH2,處理溫度65 ℃的條件下制備膠原蛋白肽。經驗證,所建立的聯產工藝具有較好的可靠性和穩定性,草魚鱗、鰱魚鱗、沙丁魚鱗的脫灰率分別達到了97.8%、97.6%、98.1%,總膠原溶出率分別達到了91.7%、89.3%和88.9%。盡管已經取得的研究結果表明,所建立的聯產工藝是有效的,然而有關聯產工藝所得產品的品質有待研究。下一步的工作重點是對聯產工藝所得產品的品質進行分析,并與傳統法所得產品的品質及得率進行對比,以為聯產工藝在工業生產中的應用提供依據。

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Study on the joint production technology of multi-products from fish scale

HU Yang1,2,WANG Xi-bo1,XIONG Shan-bai1,2,*,LIU You-ming1,YOU Juan1,2,YIN Tao1

(1.The Sub Center of National Technology and R&D of Staple Freshwater Fish Processing,College of Food Science and Technology,Huazhong Agricultural University,Wuhan 430070,China; 2.Collaborative Innovation Center for Efficient and Health Production of Fisheries in Hunan Province,Changde 415000,China)

Fish scale,rich in collagen and calcium,can be used as the raw material of producing collagen products and calcium supplements. In order to improve the comprehensive utilization and eliminate the pollution to environment from fish scale,the joint production technology of calcium citrate,collagen and collagen peptide was studied. The optimized de-ashing process parameters were ultrasonic power 120 W,ratio of material to water 1∶20 g/mL,citric acid mass fraction 6%,processing time 180 min,as the de-ashing rate of grass carp scale,silver carp scale and sardine scale could reach 97.8%,97.6% and 98.1%,respectively. After de-ashing,pepsin hydrolysis assisted by ultrasonic was used to extract collagen from fish scale,the optimum extraction conditions were as follows:ultrasonic power 180 W,ratio of material to water 1∶20 g/mL,enzyme dosage 2000 U/g,extraction time 8 h. Under this condition,the collagen extraction rate of grass carp scale,silver carp scale and sardine scale was 40.1%,42.2% and 56.2%. Scale residue after extracting collagen was directly used for collagen peptide preparation,the optimum conditions were as follows:substrate mass fraction 5%,enzyme dosage 280 U/g,the pH value of 2,processing temperature 65 ℃. Under this condition,the collagen extraction rate of grass carp scale,silver carp scale and sardine scale reached 91.7%,89.3% and 88.9%. Eventually,the joint production technology was verified and the result showed that the established joint production technology was stable and reliable,and may pave the way for industrial production.

fish scale;calcium citrate;collagen;collagen peptide;joint production

2016-06-13

胡楊(1987-)，男，博士，講師，研究方向：農產品加工與貯藏，E-mail：huyang@mail.hzau.edu.cn。

*通訊作者:熊善柏(1963-)，男，博士，教授，研究方向：農產品加工與貯藏，E-mail：xiongsb@mail.hzau.edu.cn。

湖北省自然科學基金青年科學基金(2015CFB391)；華中農業大學自主科技創新基金(2662015QC014)；國家自然科學基金青年科學基金(21506070)；現代農業產業技術體系專項(CARS-46-23)。

TS254.9

A

1002-0306(2016)24-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.24.000