復合菌固態發酵豬骨素產谷氨酸培養基優化

王新惠,張 超,朱文優,肖龍泉,李 婧,黃艷淋

(1.成都大學藥學與生物工程學院,四川成都 610106;2.宜賓學院發酵資源與應用四川省高校重點實驗室,四川宜賓 644000)

復合菌固態發酵豬骨素產谷氨酸培養基優化

王新惠1,張 超2,朱文優2,肖龍泉1,李 婧1,黃艷淋1

(1.成都大學藥學與生物工程學院,四川成都 610106;2.宜賓學院發酵資源與應用四川省高校重點實驗室,四川宜賓 644000)

優化米曲霉-紅曲霉復合菌固態發酵豬骨素產谷氨酸的固態培養基以提高谷氨酸產量。通過單因素實驗和正交實驗,以谷氨酸產量為指標,研究培養基中碳源、氮源和表面活性劑對谷氨酸產量的影響并對其進行優化。結果表明,復合菌固態發酵的最佳固態培養基組分為麩皮100 g,豬骨素600 g,硫酸銨15 g,三聚甘油單硬脂酸酯3 g,補水至1000 g。在此條件下,30 ℃發酵5 d,谷氨酸產量達到167.8 g/kg,總氨基酸產量達到728.6 g/kg。

米曲霉,紅曲霉,豬骨素,谷氨酸

我國是產肉大國,四川是肉類生產大省,年出欄生豬8000多萬頭,約占全國70%[1]。據統計,每年屠宰加工過程中產生大量的肉類副產物,其中鮮骨可達2000萬噸以上,由于缺乏相應的處理技術,其精深加工率不足10%[2]。如何高效利用屠宰分割副產物-豬骨,已經成為肉類加工業亟待解決的首要問題。近年來,提取骨中蛋白質、氨基酸等營養物質,提升肉類加工副產品的附加值已成為研究熱點之一。

豬骨素是以天然豬骨抽提物為原料制備的膏狀物,呈淺褐色或褐色,有較強的腥味,其主要成分為膠原、骨膠原及軟骨素(酸性粘多糖),其中的膠原蛋白分子形成一種十分穩定的三股超螺旋結構,不利于人體吸收消化[3],若能將其水解成多肽和氨基酸,有利于提高豬骨素的鮮味、吸收力、營養特性、功能性特征和風味等優勢。目前,對豬骨素中蛋白質的水解主要采用酸堿水解法和酶解法。利用化學方法水解豬骨素,存在某些缺陷,如堿法水解可使L-氨基酸轉變為D-氨基酸,形成有毒物質,且水解過程中氨基酸破壞比較多,從而導致呈味效果不突出[4]。酶解法可有效釋放出氨基酸和多肽物質,顯著提高營養價值,但酶解易使酶解液產生苦味肽,使酶解液呈苦味,導致豬骨素的應用范圍大大受限[5]。因此,尋求一種既可增強豬骨素香味,又能避免苦味產生的技術已迫在眉睫。

張宇等[6]報道紅曲霉、米曲霉發酵豬骨素可產生多肽、氨基酸和一些揮發性風味物質,增加呈味效果。微生物發酵過程中,發酵培養基的組成成分,會對發酵效果產生一定的影響,因此,選擇合適的培養基,對最終發酵效果的好壞尤為重要。為了進一步提高菌株發酵產以谷氨酸為代表的鮮味氨基酸和總氨基酸的產率,本文以紅曲霉-米曲霉雙菌組合為出發菌株固態發酵豬骨素,利用復合菌分泌的蛋白酶酶解豬骨素產谷氨酸和其它氨基酸,以谷氨酸和總氨基酸為指標,在單因素實驗的基礎上,采用正交實驗進一步優化固態培養基組分,確定復合菌固態發酵豬骨素產谷氨酸和總氨基酸的固態培養基組分的最佳配比。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

米曲霉A-3(Aspergillusoryzae)、紅曲霉M-4(Monascuspurpureus) 由成都大學食品加工四川省高校重點實驗室提供;種子培養基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA培養基):馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,瓊脂20 g,蒸餾水1000 mL,pH7[7];基礎固態培養基 麩皮100 g,豬骨素600 g,豆粕粉10 g,補水至1000 g,攪拌均勻,121 ℃濕熱滅菌20 min;豬骨素 蛋白質73.1%、氨基酸7.2%、脂肪0.28%、水分16.93%、其它成分2.49%,由四川天添調味品食品公司提供;麥麩、玉米芯、淀粉、豆粕粉 購于四川省成都市十陵鎮農貿市場;酪蛋白胨、牛肉膏、尿素、硫酸銨、磺基水楊酸、茚三酮、蔗糖酯、三聚甘油單硬脂酸酯和丙二醇硬脂酸酯 購于上海化學試劑總廠;谷氨酸標品 購于上海生物工程股份有限公司。

pHS-3C型數字酸度計 上海日島科技有限公司;FA2004電子分析天平 上海舜宇恒平科學儀器有限公司;SH-020恒溫恒濕發酵箱 上海上器集團實驗設備有限公司;LRH系列生化培養箱 上海一恒科學儀器有限公司;LDZX-50KBS手輪式不銹鋼立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械有限公司;TGL-20M高速臺式冷凍離心機 湖南湘儀科學儀器設備有限公司;XW-80A漩渦混合器 江蘇麒麟科教設備有限公司;SZ-93A自動雙重純水蒸餾器 上海亞榮生化儀器有限公司;UV741型可見紫外分光光度計 惠普上海分析儀器有限公司;VOSHIN-600R型均質器 江蘇無錫沃信儀器有限公司;Deckman 6300型氨基酸自動分析儀 美國貝克曼庫爾特有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 固態發酵 基礎培養基滅菌冷卻后,以1∶1比例接入米曲霉和紅曲霉孢子懸浮液(107個/mL),接種量10%,均勻鋪在細網篩上放入發酵箱中,發酵溫度30 ℃,相對濕度95%～100%,通風量0.2 L·min-1·kg-1,每12 h翻松培養基一次,發酵120 h。

1.2.2 氨基酸的測定 取發酵樣品加入等體積的8%磺基水楊酸除去蛋白質和多肽,10000 r/min離心20 min,取上清液經0.5(m濾膜過濾后,采用氨基酸自動分析儀測定樣品中的谷氨酸和總氨基酸量。測定條件:緩沖液流量:20 mL/h,茚三酮流量:10 mL/h,柱溫:60 ℃,色譜柱:20 cm,分析時間:42 min。

1.2.3 固態發酵培養基的優化

1.2.3.1 不同碳源對氨基酸產量的影響 在基礎培養基的基礎上,選擇麥麩、玉米芯、淀粉3種碳源,添加量為10%(w/w),發酵溫度30 ℃,相對濕度95%～100%,通風量0.2 L·min-1·kg-1,每12 h翻松培養基一次,發酵120 h后測定發酵培養基中谷氨酸和總氨基酸量,以確定最佳碳源種類。選擇麥麩添加量5%、10%、15%、20%、25%進行單因素實驗。

1.2.3.2 不同氮源對氨基酸產量的影響 在基礎培養基的基礎上,麥麩添加量為10%,選擇豆粕粉、蛋白胨、牛肉膏、尿素、硫酸銨5種氮源,添加量為1%(w/w),發酵溫度30℃,相對濕度95%～100%,通風量0.2 L·min-1·kg-1,每12 h翻松培養基一次,發酵120 h后測定發酵培養基中谷氨酸和總氨基酸量,以確定最佳氮源種類。選擇硫酸銨添加量0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%進行單因素實驗。

1.2.3.3 不同表面活性劑對氨基酸產量的影響 在基礎培養基的基礎上,麥麩添加量為10%,硫酸銨添加量為1%,選擇蔗糖酯、三聚甘油單硬脂酸酯和丙二醇硬脂酸酯3種表面活性劑,添加量為0.1%(w/w),發酵溫度30℃,相對濕度95%～100%,通風量0.2 L·min-1·kg-1,每12 h翻松培養基一次,發酵120 h后測定發酵培養基中谷氨酸和總氨基酸量,以確定最佳表面活性劑種類。選擇三聚甘油單硬脂酸酯添加量0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%進行單因素實驗。

1.2.3.4 正交實驗設計 通過對碳源、氮源和表面活性劑單因素實驗,確定正交實驗的各因素水平。在單因素實驗基礎上,設計三因素三水平正交實驗,以谷氨酸產量為評價指標,進一步優化固態發酵培養基,確定最佳培養基組分。正交實驗因素水平見表1。

表1 正交實驗因素水平表

1.3 數據處理與統計分析

數據統計分析,采用SAS軟件(SAS Institute,2000)的ANOVA進行分析,采用普通線性模型(GLM)計算,用最小顯著性差異檢驗平均值間的差異,設定5%為顯著性差異水平。對每次實驗的每個樣品做三次重復測定。

2 結果與分析

2.1 發酵培養基組分對氨基酸產量的影響

2.1.1 不同碳源對氨基酸產量的影響 不同碳源對復合菌固態發酵豬骨素產谷氨酸和總氨基酸的影響如圖1所示。復合菌在麥麩的基質上產谷氨酸和總氨基酸能力顯著高于玉米芯和淀粉基質(p<0.05)。因此,選擇麥麩為最佳發酵碳源,進一步優化麥麩添加量,結果如圖2所示。隨著麥麩添加量的增加,谷氨酸和總氨基酸產量呈先增大后下降的趨勢,當添加量為15%時,谷氨酸和總氨基酸產量最高,分別達到114.2 g/kg和627.6 g/kg。此后,隨著麥麩添加量增加,谷氨酸和總氨基酸產量呈下降趨勢。在固態發酵培養基中添加麩皮,不僅可以補充培養基中不足的碳源和維生素,而且能增加基質的透氣性,并保持培養基中水分不散失,有利于菌體生長和發酵[8]。但麩皮添加量也不能太高,過高的麩皮的添加量增加基質的C/N,會使米曲霉和紅曲霉的菌絲體生長過旺,呼吸作用強,微生物產生的有害物質增多,抑制菌體發酵產酶能力,導致氨基酸的產量降低[9]。

圖1 不同碳源對谷氨酸和總氨基酸產量的影響Fig.1 Effects of different carbon sources on Glutamic acid and total amino acids production

圖2 麩皮添加量對谷氨酸和總氨基酸產量的影響Fig.2 Effects of wheat bran concentration on Glutamic acid and total amino acids production

2.1.2 不同氮源對氨基酸產量的影響 不同氮源對復合菌固態發酵豬骨素產谷氨酸和總氨基酸的影響如圖3所示。有機氮源中,以豆粕粉為氮源,復合菌發酵產谷氨酸和總氨基酸的能力顯著高于蛋白胨和牛母膏(p<0.05),這可能是因為豆粕粉除了能提供氮源外,還能提供維生素等其它營養成分,有利復合菌的發酵。無機氮源中,尿素不利于菌體發酵產谷氨酸,添加硫酸銨顯著增加發谷氨酸的產量(p<0.05),且產量最高,達132.5 g/kg。硫酸銨比其它無機氮和有機氮有利于發酵產谷氨酸的可能原因是麩皮蛋白質含量達16.4%[10],豐富的有機氮已可滿足菌體對有機氮的需要,添加適量硫酸銨后可產生有機氮與無機氮的協同作用。因此,選擇硫酸銨為最佳發酵氮源,進一步優化硫酸銨添加量,結果如圖4所示。隨著硫酸銨添加量的增加,谷氨酸和總氨基酸產量呈先增大后下降的趨勢,當添加量1.5%時,谷氨酸產量最高達到140.5 g/kg,總氨基酸產量達到693.5 g/kg。硫酸銨添加量過大,不利于米曲霉和紅曲霉菌體的生長,從而導致產酶能力降低,影響谷氨基酸和總氨基酸的產量。

圖3 不同氮源對谷氨酸和總氨基酸產量的影響Fig.3 Effects of different nitrogen sources on Glutamic acid and total amino acids production

圖4 硫酸銨添加量對谷氨基酸和總氨基酸產量的影響Fig.4 Effects of(NH4)2SO4 concentration on Glutamic acid and total amino acids production

2.1.3 不同表面活性劑對氨基酸產量的影響 添加三聚甘油單硬脂酸酯、蔗糖酯和丙二醇硬脂酸酯3種可食用表面活性劑對復合菌固態發酵豬骨素產谷氨酸和氨基酸的影響如圖5所示,其中三聚甘油單硬脂酸酯效果最佳,谷氨酸產量達到164.5 g/kg,總氨基酸產量為723.1 g/kg。郭繼平等[11]報道添表面活性劑能促進米曲霉產蛋白酶活力,這可能是因為表面活性劑改變細胞膜的通透性,胞內的酶能更容易透過細胞分泌出來,從而促進酶的分泌。此外,表面活性劑可提高氧在氣液界面的傳遞速率,可增加微生物的溶氧,促進微生物的生長,從而提高菌體產蛋白酶能力,使谷氨酸和總氨基酸的產量提高。選擇三聚甘油單硬脂酸酯為最佳表面活性劑,進一步優化三聚甘油單硬脂酸酯添加量,結果如圖6所示。三聚甘油單硬脂酸酯添加量為0.3%時谷氨酸量高達164.5 g/kg,總氨基酸產量為723.5 g/kg。

圖5 不同表面活性劑對谷氨酸和總氨基酸產量的影響Fig.5 Effects of different surfactants on Glutamic acid and total amino acids production

圖6 三聚甘油單硬脂酸酯添加量對谷氨酸和總氨基酸產量的影響Fig.6 Effects of tripolycerol monostearates concentration on Glutamic acid and total amino acids production

2.2 正交優化實驗結果

在單因素實驗的基礎上,選擇麩皮、硫酸銨、三聚甘油單硬脂酸酯為3個主要外加營養源。谷氨酸產量為評價指標,通過三因素三水平正交實驗確定麩皮、硫酸銨、三聚甘油單硬脂酸酯的濃度對發酵產谷氨基酸的影響,正交實驗結果見表2。結果表明,RC>RB>RA,各因素從主到次的順序為C(三聚甘油單硬脂酸酯),B(硫酸銨),A(麩皮),最優固態培養基組分方案為A1B2C2,即麩皮添加量10%,硫酸銨添加量1.5%,三聚甘油單硬脂酸酯添加量0.3%,在此培養基中復合菌固態發酵豬骨素谷氨酸量達163.5 g/kg。

表2 正交實驗結果

2.3 驗證性實驗

按正交實驗優化的培養基成分進行驗證實驗,以確保實驗的準確性。在最優組合條件下,麩皮添加量為10%、硫酸銨添加量為1.5%、三聚甘油單硬脂酸酯添加量為0.3%,此時米曲霉-紅曲霉復合菌固態發酵產谷氨酸量為167.8 g/kg,總氨基酸產量為728.6 g/kg,而正交實驗2組實驗谷氨酸產量最高為163.5 g/kg,基礎培養基谷氨酸產量為105.6 g/kg,總氨基酸產量為615.4 g/kg,說明優化組合的谷氨酸產量高于正交實驗結果中最高產量,故本研究確定的固態發酵培養基組成合理可信。

3 結論

通過單因素實驗,初步確定了有利于米曲霉-紅曲酶復合菌固態發酵谷氨酸和總氨基酸的碳源為麩皮,添加量為10%(w/w);氮源為硫酸銨,添加量為1.5%(w/w);表面活性劑為三聚甘油單硬脂酸酯,添加量為0.3%(w/w)。在單因素實驗的基礎上,采用正交實驗對固態培養基組分進行了優化,比較了麩皮、硫酸銨、三聚甘油單硬脂酸酯三個因素對菌株發酵產谷氨酸的影響,三個因子對谷氨酸的影響作用由大到小依次為:三聚甘油單硬脂酸酯、硫酸銨、麩皮;最終確定復合菌固態發酵谷氨酸的最佳發酵培養基組分為:麩皮100 g,豬骨素600 g,硫酸銨15 g,三聚甘油單硬脂酸酯3 g,補水至1000 g。在此條件下,30 ℃發酵5 d,谷氨酸產量達到167.8 g/kg,總氨基酸產量達到728.6 g/kg。

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Optimization of medium constituents for Glutamic acid production by mixed starter cultures in pig ossein solid state fermentation

WANG Xin-hui1,ZHANG Chao2,ZHU Wen-you2,XIAO Long-quan1,LI Jing1,HUANG Yan-lin1

(1.School of Pharmacy and Bioengineering,Chengdu University,Chengdu 610106,China; 2.Key Laboratory of Fermentation Resource and Application of Institutes in Sichuan Higher Education,Yibin University,Yibin 644000,China)

The medium constituents for producing Glutamic acid by a mixed starter culture composed ofAspergillusoryzaeandMonascuspurpureusin pig ossein solid state fermentation were optimized. The effects of carbon sources,nitrogen sources and surfactants on the yield of Glutamic acid and total amino acids were studied by single factor and orthogonal array design methods. Results suggested that the optimal medium constituents were bran concentration of 100 g,pig ossein concentration of 60 g(NH4)2SO4concentration of 15 g and tripolycerol monostearates concentration of 3 g. Under these conditions,the yields of Glutamic acid and total amino acids were 167.8 g/kg and 728.6 g/kg,respectively,after a fermentation 5 days at 30 ℃.

Aspergillusoryzae;Monascuspurpureus;pig ossein;Glutamic acid

2016-06-13

王新惠(1982-)，女，博士,副教授，主要從事肉類加工及質量控制的研究，E-mail：wangxinhui19820319@163.com。

發酵資源與應用四川省高校重點實驗室開放基金項目(2015FJZ003)；國家自然科學基金資助項目(31301552)；成都大學大學生創新性實驗項目(CDU-CX-2016051)。

TS251

A

1002-0306(2016)24-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.24.000