響應面法優化靈芝多糖的酶法提取工藝研究

朱 玲史吉平王晨光劉 莉*李保國1*周 靖

(1.上海理工大學醫療器械與食品學院,上海 200093;2.中國科學院上海高等研究院,上海 201210;3.上海百信生物科技有限公司,上海 201401)

響應面法優化靈芝多糖的酶法提取工藝研究

朱 玲,史吉平2,王晨光3,劉 莉2,*,李保國1,*,周 靖3

(1.上海理工大學醫療器械與食品學院,上海 200093;2.中國科學院上海高等研究院,上海 201210;3.上海百信生物科技有限公司,上海 201401)

以靈芝子實體粗多糖得率為考察指標,比較了不同種類酶對靈芝多糖的提取效果,篩選出能夠提高靈芝多糖提取率的四種酶,即木瓜蛋白酶、破壁酶、纖維素酶和果膠酶;通過單因素和響應面優化實驗確定了四種酶的復配方案和最佳酶用量,即木瓜蛋白酶1.6%、破壁酶2.1%、纖維素酶1.6%、果膠酶2.3%,在此基礎上,以酶法提取過程中的四個重要參數溫度、時間、pH和液固比為自變量,靈芝粗多糖得率為因變量,采用響應面優化設計的方法,研究了各自變量及其相互關系對粗多糖得率的影響,獲得了最佳的酶解條件為:溫度60 ℃,時間118 min,pH4.6,液固比16∶1,在此條件下粗多糖得率為4.41%,與傳統水提法粗多糖得率3.12%相比,提高了41.3%。

響應面法,靈芝,多糖,酶法提取,子實體

靈芝(Ganodermalucidum),又名芝草、瑞草,是一種營養、保健價值極高的扇形或馬蹄形大型擔子菌[1]。現代醫學研究表明,靈芝用于治療肝、腎病,高血壓,高血脂,神經衰弱,心血管疾病以及抗腫瘤等都有良好的臨床療效。靈芝作為日常生活的保健滋補品,備受人們青睞。而靈芝多糖是靈芝的主要活性成分之一,現已成為健康產業的研究熱點。大量研究表明,靈芝多糖具有免疫調節、抗腫瘤、抗病毒、抗衰老、抗氧化、降血糖、降血脂和降血壓等多種生物活性[2-6]。

工業上一般采用熱水提取法[7-8]提取靈芝多糖,但這種方法存在提取得率低、提取溫度高、效率低等諸多缺陷[9-11]。靈芝多糖存在于靈芝子實體的細胞壁內壁,除了靈芝多糖以外,子實體細胞壁還含有蛋白質、纖維素、半纖維、果膠和幾丁質等物質,這些物質的存在都會影響多糖的提取[12]。

酶法是一種通過酶解破壞細胞結構來強化有效成分的傳質過程,能最大限度提取中藥有效成分的方法[13],已有研究表明,采用單一酶法[14-16]能夠提高多糖的得率,同時兩種不同種類的酶[17-18]復合提取靈芝多糖的研究也有報道,而且提取效果也優于單一酶法提取靈芝多糖,但多種酶協同作用于靈芝多糖提取的研究鮮有報道。

本研究以靈芝子實體為原料,利用復合酶法提取靈芝多糖,并用響應面[19]分析優化復合酶法提取靈芝多糖的最優工藝條件,以期提高靈芝多糖的得率,為酶法提取靈芝多糖的工業化生產和靈芝多糖的生物活性研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

靈芝子實體 龍芝二號,由上海百信生物科技有限公司提供,烘干粉碎過40目篩備用;溶菌酶(2萬U/g)、破壁酶(5萬U/g)、木瓜蛋白酶(80萬U/g)、酸性蛋白酶(20萬U/g)、堿性蛋白酶(20萬U/g)、中性蛋白酶(20萬U/g)和果膠酶(3萬U/g) 均購于南寧龐博生物工程公司;木聚糖酶(20萬U/g) 諾維信公司;纖維素酶(200萬U/g) 尤特爾公司;無水乙醇、氫氧化鈉、鹽酸等均為分析純 購于國藥集團化學試劑有限公司。

高速離心機 日本Hitachi公司;水浴搖床 上海智城分析儀器制造有限公司;全自動新型鼓風干燥箱 上海智城分析儀器制造有限公司;旋轉蒸發儀 德國IKA集團;真空泵 鄭州長城科工貿有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 靈芝多糖的酶法提取工藝 靈芝子實體干粉5±0.01 g→加入蒸餾水100 mL→用鹽酸和NaOH溶液調節至最適pH→加酶酶提(60 ℃,120 min,135 r/min)→煮沸滅酶(10 min)→第一次水提(100 ℃,120 min,135 r/min)→離心(10000 r/min,15 min)→沉淀第二次水提(100 ℃,60 min,150 r/min)→離心(10000 r/min,15 min)→濾液合并→旋蒸濃縮至原體積的四分之一(55 ℃,120 r/min)→4倍體積的無水乙醇醇沉→過濾得到濾渣→干燥(60 ℃干燥箱至恒重)→粗多糖。

在用水浴搖床對靈芝進行提取的過程中每隔15 min對三角瓶中的樣液進行觀察,防止靈芝樣品不能完全浸沒在液體中而不能得到充分的提取;熱水提取法為去掉酶提部分。

1.2.2 酶的篩選 按照方法1.2.1,分別選用酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、果膠酶、木聚糖酶、破壁酶、溶菌酶和纖維素酶,取酶量為靈芝子實體的1.5%,對靈芝子實體進行酶法提取多糖,計算粗多糖得率,以此為考察指標篩選提取效果較好的酶。

1.2.3 酶用量的單因素實驗 參考張天笑[17],控制酶解pH為5.0,酶解溫度60 ℃,酶解時間120 min不變,調節酶用量分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%,以粗多糖得率為考察指標,確定酶的最佳酶用量。

1.2.4 酶的復配及用量的響應面優化實驗 根據酶用量的單因素實驗結果,選擇木瓜蛋白酶(A)、破壁酶(B)、纖維素酶(C)和果膠酶(D)為自變量,以粗多糖得率(Y)為響應值,根據Box-Benhnken的中心設計原理,進行四因素三水平響應面優化實驗,利用Design Expert V8.05軟件對數據進行分析,響應面實驗的因素和水平見表1。

表1 酶的復配及用量響應面實驗的因素和水平

1.2.5 酶解條件的響應面優化實驗 參考賀寅[20],在確定了最佳酶的復配方案和酶用量基礎上,選擇酶解溫度(A)、時間(B)、pH(C)和液固比(D)為自變量,以粗多糖得率(Y)為響應值,根據Box-Benhnken的中心設計原理,進行四因素三水平的酶解條件的響應面優化實驗,利用Design Expert V8.05軟件對數據進行分析,得到最適酶解條件。響應面實驗的因素和水平見表2。

表2 酶解條件響應面實驗的因素和水平

1.2.6 粗多糖得率的計算方法 靈芝粗多糖得率計算如式(1):

式(1)

式中:M為提取得到的粗多糖的質量;M0為樣品的質量。

1.3 數據處理

實驗數據采用Origin軟件進行分析,ANOVA程序進行方差分析,當p<0.05時認為平均值有顯著性差異,最小顯著差異法用于數據多重比較分析。

2 結果與分析

2.1 不同酶對靈芝粗多糖得率的影響

圖2 酶用量對靈芝粗多糖得率的影響Fig.2 Influence of enzyme dosage on the crude polysaccharide yield

考察9種酶對靈芝多糖的提取效果,如圖1所示。由圖1可以看出:熱水提取法中的靈芝粗多糖得率為3.12%;在所選擇的4種蛋白酶中,木瓜蛋白酶中粗靈芝多糖的得率為3.35%,對靈芝多糖提取的效果最好,這可能與幾種蛋白酶的作用位點不同有關;因為靈芝多糖存在于細胞壁里面,而細胞壁上有幾丁質、果膠和纖維素等物質,分別添加破壁酶、纖維素酶和果膠酶后,這些酶能促進細胞壁的破裂,對靈芝多糖提取的會起到促進作用,添加這三種酶處理后,靈芝粗多糖得率分別為3.37%、3.34%和3.27%;而靈芝子實體細胞壁上沒有能被溶菌酶和木聚糖酶催化分解的物質,這兩種酶對靈芝子實體細胞壁的破碎沒有起到作用,不能促進多糖的提取,提取的得率分別為3.12%和3.13%。因此選定木瓜蛋白酶、破壁酶、纖維素酶和果膠酶作為靈芝多糖提取的酶源。

圖1 不同種類的酶對靈芝粗多糖得率的影響Fig.1 Influence of different kinds of enzymes on the crude polysaccharide yield

2.2 酶用量對粗靈芝多糖得率的影響

不同濃度的木瓜蛋白酶、破壁酶、纖維素酶和果膠酶對靈芝粗多糖得率的影響如圖2所示,由圖2可看出,隨著酶用量的增大,粗靈芝多糖的得率隨之增大,但酶用量增大到一定值之后,粗靈芝多糖的得率沒有明顯增高,說明酶濃度已經趨于飽和,從經濟性考慮,確定四種酶的最佳用量分別為:木瓜蛋白酶1.5%、破壁酶2.0%、纖維素酶1.5%、果膠酶2.0%。

2.3 酶的復配及用量對靈芝多糖得率的影響

以靈芝多糖的得率(Y)為響應值,29個實驗點由分析點和零點組成,其中分析點為自變量A、B、C、D的取值所構成的三位頂點,零點為區域中心點,其中零點實驗重復5次以便估算實驗誤差響應面實驗,結果見表3。

表3 酶的復配及用量的響應面實驗設計及結果

利用Design Expert V8.05軟件對表3中的實驗數據進行多項式回歸,得到粗多糖得率(Y)與木瓜蛋白酶(A)、破壁酶(B)、纖維素酶(C)、果膠酶(D)四個因素的二次多項回歸方程為:

Y=-1.19692+1.44767A+0.55133B+2.41767C+1.18133D+4.8AB+0.02AC-0.06AD-0.22BC+1.12BD+0.08CD-0.72333A2-0.83533B2-0.68033C2-0.79033D2(R2=0.9352)

由表4方差分析表可知,一次項A(p=0.0050<0.01)、B(p=0.0098<0.01)和D(p<0.01)都極其顯著,而C(0.01FA>FB>FC,即果膠酶>木瓜蛋白酶>破壁酶>纖維素酶。

為了考察木瓜蛋白酶、破壁酶、纖維素酶和果膠酶的交互作用對粗多糖得率的影響,采用Design Expert V8.05軟件得到了交互作用顯著的破壁酶和木瓜蛋白酶、交互作用極其顯著的破壁酶和果膠酶的響應面圖,由圖3可知,靈芝多糖得率在木瓜蛋白酶用量為1.6%時達到最大,當木瓜蛋白酶的用量大于1.6%后,繼續增加木瓜蛋白酶用量,靈芝粗多糖的得率反而下降,這可能是因為木瓜蛋白酶分子過飽和,一部分沒有機會與底物結合,酶解效果變差;而隨著破壁酶的增大,粗靈芝多糖的得率也隨之增大,當破壁酶用量增大到2.0%左右時,靈芝多糖得率最高,繼續增加酶用量,靈芝多糖得率開始下降,這可能是破壁酶過飽和時,破壁酶除了水解細胞壁上的幾丁質,也對多糖起到了水解的作用。由圖4可知,破壁酶和纖維素酶交互效應的響應面走勢陡峭,表明兩者交互作用對多糖提取率影響極其顯著,而這也與方差分析的結果一致。

圖3 木瓜蛋白酶與破壁酶交互作用對粗多糖得率的影響Fig.3 Influence of the interaction of papain and lyticase on the crude polysaccharide yield

圖4 破壁酶與果膠酶交互作用對粗靈芝多糖得率的影響Fig.4 Influence of the interaction of lyticase and pectinase on the crude polysaccharide yield

表4 回歸模型方差分析表

注:**表示極顯著(p<0.0001),*表示顯著(p<0.05);表6同。

表5 酶解條件響應面實驗設計及結果

通過模型預測最佳酶用量為:木瓜蛋白酶1.6%、破壁酶2.1%、纖維素酶1.6%、果膠酶2.3%,在此酶用量下預測靈芝粗多糖得率為3.84%。對最佳酶用量條件進行實驗驗證,得到靈芝粗多糖得率為3.67%,與預測值相比,誤差為4.42%。因此,優化得到的酶法提取靈芝多糖的酶的復配和用量有參考價值。

2.4 酶解條件對靈芝多糖得率的影響

在確定了最優酶的復配和用量的條件后,選擇溫度(A)、時間(B)、pH(C)、液固比(D)四個因素為自變量,以粗多糖得率(Y)為響應值,設計四因素三水平實驗對靈芝多糖酶解提取條件進行優化,結果見表5。

利用Design-Expert V8.05軟件對表5中實驗數據進行多項式回歸,得到粗多糖得率(Y)與溫度(A)、時間(B)、pH(C)、液固比(D)四個因素的二次多項回歸方程:

Y=-45.72+0.30A+0.37×B+4.89C+0.96D+0.0010AB-0.0153AC-0.0095AD+0.0004×BC+0.0006BD+0.0305CD-0.0015A2-0.0019B2-0.4949C2-0.0186D2(R2=0.9660)

表6 回歸模型方差分析表

由表6方差分析結果表明,一次項B(p<0.01)影響極顯著;C、D(p<0.05)影響顯著;A(p>0.05)影響不顯著;二次項B2、C2、D2、AD(p<0.01)影響極顯著;AB、A2(p<0.05)影響顯著;AC、BC、BD、CD(p>0.05)影響不顯著。從方差分析表可知:FA=1.60,FB=61.82,FC=15.77,FD=21.92,各因素對粗多糖得率的影響順序為:B>D>C>A,即時間>液固比>pH>溫度。

圖5為固定pH為5.0,液固比為20∶1得到交互作用顯著的酶解溫度和時間的響應面圖,由圖5可知,隨著酶解時間的增加,多糖得率增大,當酶解時間增加到120 min后,繼續延長酶解時間,粗多糖得率反而下降,這可能是時間過長,導致多糖分解;在圖示的溫度范圍內,粗多糖的得率隨溫度的變化不大,這可能是選擇的溫度范圍在復合酶的最適溫度范圍內,酶解溫度的變化沒有影響到酶的活性。圖6為固定時間為100 min,pH為5.0得到的的酶解溫度與液料比交互作用的響應面圖,圖形的走勢極其陡峭,表明酶解溫度與料液比交互作用顯著,這也與方差分析的結果一致。

圖5 酶解溫度與時間交互作用對粗多糖得率的影響Fig.5 Influence of the interaction of enzymolysis hydrolysis temperature and time on the crude polysaccharide yield

圖6 溫度與料液比交互作用對粗多糖得率的影響Fig.6 Influence of the interaction of enzymolysis hydrolysis temperature and liquid to solid ratio on the crude polysaccharide yield

通過模型預測得到最佳酶解條件:溫度60 ℃、時間118 min、pH4.6、液固比16∶1,在該條件下模型預測靈芝粗多糖得率為4.55%。為了驗證模型的可靠性,對最優的條件進行了驗證實驗,靈芝粗多糖實際得率為4.41%,與理論預測值相比誤差為2.86%。因此,采用響應面優化得到的酶法提取靈芝多糖的條件參數具有實用參考價值。

3 結論

本實驗通過單因素和響應面實驗優化,最終得到的酶法提取靈芝多糖的工藝條件為:a.酶及酶用量:木瓜蛋白酶1.6%、破壁酶2.1%、纖維素酶1.6%、果膠酶2.3%;b.最佳酶解條件:溫度60 ℃,時間118 min,pH4.6,液固比16∶1。在此條件下靈芝粗多糖得率為4.41%,與傳統的水提法粗多糖得率3.12%相比,提高了41.3%。可為復合酶法提取靈芝多糖的工業化生產提供理論依據。

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Optimization of enzymatic extraction of polysaccharides fromganodermalucidumusing response surface methodology

ZHU Ling1,SHI Ji-ping2,WANG Chen-guang3,LIU Li2,*,LI Bao-guo1,*,ZHOU Jing3

(1.School of Medical Instrument and Food Engineering,University of Shanghai for Science and Technology,Shanghai 200093,China; 2.Shanghai Advanced Research Institute,Chinese Academy of Sciences,Shanghai 201210,China; 3.Shanghai Baixin Bio-Tech Co.,Ltd.,Shanghai 201401,China)

Effects of different kinds of enzymes on the extraction ofGanodermalucidumpolysaccharides have been investigated,with the crude polysaccharides yield fromGanodermalucidumfruit body as the index. The results showed that four enzymes,i.e.,papain,lyticase,cellulase,and pectinase,could increase the polysaccharides yield. The optimal combination and dosages of the four enzymes were determined by the single factor experiment method and the response surface methodology,which was papain 1.6%,lyticase 2.1%,cellulase 1.6%,and pectinase 2.3%,respectively. Then the response surface methodology was used again to determine the optimal enzymatic extraction conditions,with the temperature,time,pH value,and liquid to solid ratio as the variables,as well as the crude polysaccharides yield as the response. The optimal enzymatic extraction conditions were as follow:temperature 60 ℃,time 118 min,pH value 4.6,the liquid to solid ratio of 16∶1. Under these conditions,the crude polysaccharide yield was 4.41%,which was 41.3% higher than that of 3.12% extracted by traditional hot water extract method.

response surface methodology;Ganodermalucidum;polysaccharides;enzymatic extraction;fruit body

2016-07-07

朱玲(1992-)，男，碩士研究生，研究方向：食品科學與工程，E-mail：15921079038@163.com。

*通訊作者:劉莉(1982-)，女，博士，副研究員，研究方向：食品生物技術，E-mail: liul@sari.ac.cn。 李保國(1961-)，男，博士，教授，研究方向：食品和農產品加工新技術，E-mail:lbaoguo@126.com。

上海市農業科技成果轉化項目(滬農科轉字2015第2-2號)；中國科學院青年創新促進會專項經費項目(2015232)。

TS201.1

A

1002-0306(2016)24-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.24.000