雙水相法提取油菜籽粕中原花青素

王 芳,廖 亮,黃 瑜,趙曉敏,侯俊楠,曹文利,李 丹,李學文

(新疆農業大學食品科學與藥學學院,新疆烏魯木齊 830052)

雙水相法提取油菜籽粕中原花青素

王 芳,廖 亮,黃 瑜,趙曉敏,侯俊楠,曹文利,李 丹,李學文*

(新疆農業大學食品科學與藥學學院,新疆烏魯木齊 830052)

采用雙水相法對油菜籽粕中原花青素進行提取。在單因素實驗基礎上,選取乙醇體積分數、硫酸銨質量分數、pH和提取溫度為自變量,以原花青素得率為響應值,利用Box-Benhnken中心組合設計原理和響應面分析法,研究各自變量的交互作用對原花青素得率的影響,建立油菜籽粕原花青素提取得率的二次回歸方程。結果表明,雙水相法提取油菜籽粕原花青素的最佳工藝條件:乙醇體積分數26%,硫酸銨質量分數18%,pH2.40,提取溫度39 ℃,在此最優條件下原花青素得率為7.78 mg/g。該研究為油菜籽粕中原花青素合理開發利用提供一定的數據基礎。

油菜籽粕,原花青素,雙水相,提取,響應面

油菜是十字花科植物中一種重要的油料作物,截止至2014年底,僅我國油菜籽的種植面積已達到7587.92千公頃,年產量達到1477.22萬噸[1]。油菜籽加工成菜籽油后可得到55%左右的菜籽粕[2],然而,菜籽粕利用率低,大部分用于飼料、肥料或者垃圾處理,尚未得到合理開發利用,但其潛在營養價值極高[3],研究表明,十字花科的油菜,其種皮與仁均含有一定量的原花青素[4]。劉建平等[5]用超聲輔助法從油菜籽皮中提取了原花青素;于京等[6]通過加速溶劑萃取法從油菜籽粕中得到較高含量的原花青素。

原花青素(Proanthocyanidins)是一種有著特殊分子結構的生物類黃酮[7],廣泛存在于植物的種子、核、花、果實和皮等部位[8],具有清除自由基[9]、抗癌[10]、遏制糖化終產物形成[11]、改善視力[12]等多重功效,在食品、醫藥、化妝品等領域備受青睞。當前,原花青素的主要提取方法包括溶劑浸提法[13]、超臨界萃取法[14],酶輔助法[15]、微波輔助法[16]、超聲輔助法[17]等。

雙水相(aqueous two-phase system,ATPS)提取法因其含水量高,過程易于放大,生物親和性好,高效節約和安全環保等特點,已成功運用于生物制品、食品工業、化工等方面[18],但在提取原花青素方面研究較少。目前尚未見雙水相法在提取油菜籽粕中原花青素方面的應用,本研究以油菜籽粕為原材料,采用乙醇-硫酸銨雙水相法提取原花青素,既能增加油菜籽的附加值,又能促進天然活性物質的開發與應用,同時在提高食品安全性方面起到積極作用,為油菜籽粕的綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

油菜籽粕 購于新疆伊寧市榨油廠;無水乙醇、硫酸銨、氯化鉀、鹽酸 均為分析純。

UV-1200型紫外-可見分光光度計 上海美普達儀器有限公司;FA2004型電子分析天平 上海天平儀器廠;DZKW-D-2型電熱恒溫水浴鍋 北京市永光明醫療儀器廠;GL-20G-Ⅱ高速離心機 上海安亭科學儀器廠;FW-100型高速萬能粉碎機 北京市永光明醫療儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原花青素的提取工藝流程 油菜籽粕→挑選、除雜→恒溫干燥(40 ℃、2 d)→超微粉碎→稱取1 g放入乙醇硫酸銨雙水相[19]→離心(8000 r/min,10 min)→取上相液→定容至50 mL→待測樣品。

1.2.2 原花青素的測定 取待測樣品各1 mL于25 mL容量瓶,用pH=4.50醋酸鈉緩沖溶液和pH=1.00氯化鉀緩沖溶液定容,混勻后靜置2 h,過濾后所得濾液用紫外-可見分光光度計分別在520 nm和700 nm下測定吸光度。計算公式如下:

原花青素得率(mg/g)=(A×Mr×DF×V)/(P×m)

式(1)

式中:A-最終吸光度,A=(A520 nm,pH1.0-A700 nm,pH1.0)-(A520 nm,pH4.5-A700 nm,pH4.5);Mr-相對分子質量443.2u;DF-稀釋倍數;V-定容體積(mL);P-標品矢車菊色素-3-葡萄糖苷摩爾吸光系數26900(L/(cm·g));m-樣品質量(g)。

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.1 乙醇體積分數的確定 以料液比1∶35 g/mL,加入質量分數為16%硫酸銨溶液和體積分數分別為22%、24%、26%、28%、30%乙醇溶液,調pH為2.00,置于35 ℃恒溫水浴鍋中提取60 min,每組三個平行實驗,測定原花青素得率。

1.2.3.2 硫酸銨質量分數的確定 以料液比1∶35 g/mL,加入30%乙醇溶液和質量分數分別為16%、17%、18%、19%、20%硫酸銨溶液,調pH為2.00,置于35 ℃恒溫水浴鍋中提取60 min,每組三個平行實驗,測定原花青素得率。

1.2.3.3 pH確定 以料液比1∶35 g/mL,加入30%乙醇溶液和質量分數為16%硫酸銨溶液,調pH為1.00、1.50、2.00、2.50、3.00,置于35 ℃恒溫水浴鍋中提取60 min,每組三個平行實驗,測定原花青素得率。

1.2.3.4 提取時間的確定 以料液比1∶35 g/mL,加入30%乙醇溶液和質量分數為16%硫酸銨溶液,調pH為2.00,置于35 ℃恒溫水浴鍋中分別提取30、40、50、60、70 min,每組三個平行實驗,測定原花青素得率。

1.2.3.5 提取溫度的確定 以料液比1∶35 g/mL,加入30%乙醇溶液和質量分數為16%硫酸銨溶液,調pH為2.00,分別置于30、35、40、45、50 ℃恒溫水浴鍋中提取60 min,每組三個平行實驗,測定原花青素得率。

1.2.3.6 料液比的確定 以料液比1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 g/mL,分別加入30%乙醇溶液和質量分數為16%的硫酸銨溶液,調pH為2.00,置于35 ℃恒溫水浴鍋中提取60 min,每組三個平行實驗,測定原花青素得率。

1.2.4 響應面分析實驗設計 在單因素實驗基礎上,選用Box-Benhnken模型,以乙醇體積分數、硫酸銨質量分數、pH和提取溫度為自變量,以原花青素的得率(Y)為響應指標,設計四因素三水平的響應面分析實驗。根據單因素實驗結果,4個自變量的實驗水平見表1。

表1 響應面實驗因素水平編碼表

1.3 數據處理

數據用Microsoft Office Excel 2007處理,利用Spss19.0進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果及分析

2.1.1 乙醇體積分數對原花青素得率的影響 由圖1可知,當體系中乙醇濃度由22%增加到26%時,原花青素的得率也隨之升高,當乙醇濃度為28%時,原花青素得率最高,達到6.54 mg/g,當乙醇濃度超過28%后,原花青素的得率隨著乙醇濃度的增加而減小。這是由于乙醇濃度過低不利于雙水相體系分相,并且原花青素在上相中溶解度較小,而乙醇濃度過高易使雙水相穩定性降低,易使下相硫酸銨鹽析晶[14]。

圖1 乙醇體積分數對原花青素得率的影響Fig.1 Effects of ethanol content on the proanthocyanidins yield

2.1.2 硫酸銨質量分數對原花青素得率的影響 由圖2可知,隨著硫酸銨質量分數增加,原花青素的得率呈現出先增加后降低的趨勢,分析原因可能是隨著硫酸銨質量濃度增大,其爭奪水分子的能力越強,導致上相中水分子減少,乙醇濃度相對增加,根據相似相容原理,不同濃度的乙醇由于極性不同對溶質的溶解程度不同,在硫酸銨質量分數超過18%后,原花青素得率明顯下降,可能由于上相與原花青素極性的相似程度降低所致。

圖2 硫酸銨質量分數對原花青素得率的影響Fig.2 Effects of ammonium sulfate concentration on the proanthocyanidins yield

2.1.3 料液比對原花青素得率的影響 由圖3可知,在一定范圍內,原花青素得率隨著料液比的增大而升高,在料液比為1∶30時,原花青素得率高達7.35 mg/g。料液比過小油菜籽粕不能完全被浸透,不利于溶劑破壞植物細胞內疏水鍵,并且原花青素易達到飽和狀態,從而影響其擴散與傳質。繼續增大料液比原花青素得率變化很小,同時料液比過大不利于濃縮回收。因此,確定1∶30為最佳料液比。

圖3 料液比對原花青素得率的影響Fig.3 Effects of solid liquid ratio on proanthocyanidins yield

2.1.4 pH對原花青素得率的影響 由圖4可知,在pH=2.5時,原花青素得率達到了7.43 mg/g,在此酸度下,油菜籽粕的細胞壁和纖維素結構易被破壞,使得更多活性成分與溶劑成分接觸。隨著提取液pH上升,雙水相酸性降低,原花青素得率逐漸下降,可能是由于隨著pH升高,原花青素分子構象發生改變[16]。

圖4 pH對原花青素得率的影響Fig.4 Effects of pH on the proanthocyanidins yield

2.1.5 溫度對原花青素得率的影響 由圖5可知,提取溫度不斷升高時,原花青素得率也逐漸升高,當提取溫度達到45 ℃之后,原花青素得率隨之增大而略有降低。提取是一種擴散過程,溫度升高,會加快細胞內活性分子運動速度,從而有利于原花青素擴散到溶劑中,溫度高于45 ℃,原花青素結構被破壞,所以得率反而降低。因此提取的最佳溫度為45 ℃。

圖5 提取溫度對原花青素得率的影響Fig.5 Effects of temperature on the proanthocyanidins yield

2.1.6 提取時間對原花青素得率的影響 由圖6可以看出,在30～50 min之間,原花青素得率隨著提取時間的延長而迅速增大,當提取時間超過50 min后,繼續延長提取時間原花青素得率趨于穩定。原料顆粒內部溶質的溶解及擴散需要一定的時間,提取時間過短原花青素不能及時溶出,在50 min時原花青素和提取劑之間已經達到了動態平衡,提取時間過長反而易導致原花青素發生氧化和聚合反應[17]。因此,原花青素的最佳提取時間為50 min。

圖6 提取時間對原花青素得率的影響Fig.6 Effects of extraction time on the proanthocyanidins yield

2.1.7 Plackett-Burman結果分析 采用Plackett-Burman實驗篩選,通過表2可以得出料液比和提取時間對雙水相提取原花青素影響不顯著(p>0.05),考慮到生產成本和經濟效益,料液比選擇為1∶30 g/mL,提取時間為50 min。乙醇體積分數、硫酸銨質量分數、pH和提取溫度對原花青素得率(Y)的影響顯著(p<0.05),因此通過響應面對其進行優化。

表2 Plackett-Burman實驗結果表

注:**表示差異高度顯著(p<0.01),*表示差異顯著(p<0.05)。2.2 響應面結果分析

2.2.1 回歸方程的建立與方差分析 采用Design-Expert 8.05軟件對表2數據進行多元回歸擬合,得到響應值Y對影響因子乙醇體積分數(A)、硫酸銨質量分數(B)、pH(C)和提取溫度(D)的二次多項式回歸模型,如式2所示:

Y=7.87+0.15A+0.24B-0.054C-0.036D-0.17AB-0.13AC-0.45AD+0.019BC-0.096BD+0.066CD-0.34A2-0.22B2-0.23C2-0.62D2

式(2)

2.2.2 各因素交互作用分析 響應面圖坡度的陡峭程度直觀地反映了各因素對響應值原花青素得率的影響,由圖7～圖12可知,開始時原花青素得率隨著乙醇體積分數、硫酸銨質量分數、pH和提取溫度的增大而增大,達到中心值以后,得率隨著各因素增大而減小;兩兩因素間均有交互作用,其中乙醇體積分數和提取溫度交互作用最強,如圖9對應的響應面曲線變化較為陡峭,在乙醇體積分數為27%原花青素得率達到最大值;乙醇體積分數和pH的交互作用最弱,如圖10對應的曲線較為平緩。

圖7 乙醇體積分數和硫酸銨質量分數對原花青素得率影響的響應面圖Fig.7 Response surface of ethanol concentration and ammonium sulphate concentration on the proanthocyanidins yield

圖8 乙醇體積分數和pH對原花青素得率影響的響應面圖Fig.8 Response surface of ethanol concentration and pH on the proanthocyanidins yield

表3 原花青素得率實驗結果的方差分析

圖9 乙醇體積分數和提取溫度對原花青素得率影響的響應面圖Fig.9 Response surface of ethanol concentration and extraction temperature on the proanthocyanidins yield

圖10 硫酸銨質量分數和pH對原花青素得率影響的響應面圖Fig.10 Response surface of ammonium sulphate concentration and pH on the proanthocyanidins yield

圖12 pH和提取溫度對原花青素得率影響的響應面圖Fig.12 Response surface of pH and temperature on the proanthocyanidins yield

注:***表示差異極顯著(p<0.0001),**表示差異高度顯著(p<0.01),*表示差異顯著(p<0.05)。2.2.3 提取工藝條件驗證實驗 根據回歸模型得到最佳提取工藝條件是乙醇體積分數為26.00%,硫酸銨質量分數為18.07%,pH為2.44,提取溫度為39.00 ℃,原花青素得率最大預測值為7.89 mg/g。考慮到實際生產,將提取工藝參數調整為乙醇體積分數為26%,硫酸銨質量分數為18%,pH為2.40,提取溫度為39 ℃,為檢驗實驗結果的可靠性,采用上述工藝參數進行驗證,進行3次平行實驗,測得的原花青素的平均得率得率為(7.78±0.49) mg/g,與理論值相比,其相對誤差約為1.41%,說明采用響應面法得到的優化工藝可行性強,優化結果可靠。

3 討論

如何使油菜籽粕變廢為寶、使其所含活性物質充分利用,是綜合開發油菜籽粕附加值的關鍵。本實驗采用雙水相法提取油菜籽粕中的原花青素,和傳統提取方法相比,避免了有機溶劑萃取對原花青素結構的破壞作用;盡管響應面分析方法因其實驗次數少、分析全面等優點被眾多領域應用,但在油菜籽粕原花青素雙水相法提取工藝參數的優化方面尚未有報道,本實驗通過響應面尋找出最佳工藝條件,解決了以往正交實驗無法在全部區域上獲取最佳因素和最優值的問題。

為了驗證雙水相法提取油菜籽粕原花青素的高效實用性,選用水提法和于京等[6]采用的加速溶劑萃取法對同一批油菜籽粕進行提取,提取后原花青素得率分別為2.49、4.06 mg/g,而雙水相法所得原花青素的得率為7.76 mg/g,雙水相法提取得率明顯高于以上兩種方法,約為水提法的4倍,加速溶劑法的2倍,均有極顯著差異(p<0.01),可能是雙水相體系萃取過程中能夠將部分雜多糖與雜蛋白去除,在一定程度上提高了原花青素的得率,由此可以得出雙水相法在原花青素的提取上更有優勢。

4 結論

通過單因素實驗,擬合了乙醇體積分數、硫酸銨質量分數、pH、提取溫度,這四個因素對原花青素得率的二次多項式數學模型回歸模型,經驗證重復實驗證明Box-Benhnken 設計法所得模型擬合度高,準確有效,用于預測雙水相法提取油菜籽粕中花青素的得率是可行的。由該模型優化后的提取條件如下:乙醇體積分數為26%,硫酸銨質量分數為18%,pH為2.40,提取溫度為39 ℃,在此最優條件下原花青素得率為7.78 mg/g,該方法易操作、對比傳統提取方法提取效果較好。

[1]中國統計局編著.中國統計年鑒2015[M].中國統計出版社,2015.

[2]李培武,周海燕.油菜硫代葡萄糖苷檢測技術研究進展[J].中國油料作物學報,2008,30(1):127-131.

[3]劉大川,童波.再談油菜籽加工業面臨的挑戰及其對策[J].中國油脂,2012,37(8):1-3.

[4]張小軍,夏春鏜,吳建銘,等. 原花青素的資源研究[J].中藥材,2009,32(7):1154-1160.

[5]劉建平,楊小敏,李倩倩,等.響應曲面法優化超聲輔助提取油菜籽皮中的原花青素[J].精細化工,2011,28(7):

680-684.

[6]于京,王晶,劉春明,等.油菜籽餅粕中原花青素的提取工藝研究[J].時珍國醫國藥,2012,23(3):562-564.

[7]張慧文,張玉,馬超美.原花青素的研究進展[J].食品科學,2015,26(5):296-304.

[8]Monagas M,Quintanilla-Lopez J E,Gomez-Corveso C,et al. MALDI-TOF MS analysis of plant proanthocyanidins[J].J Pharm Biomed Anal,2010,2:358-72.

[9]Han Y T,Chen X H,Xie J,et al. Purple sweet potato pigments scavenge ROS,Reduce p53 and Modulate Bcl-2/Bax to inhibit irradiation-induced apoptosis in murine thymocytes[J].Cell Physiol Biochem,2011,28:865-872.

[10]Schmidt BM,Erdman JW,Lila MA.Differential effects of blueberry proanthocyanidins on androgen sensitive and insensitive human prostate cancer cell lines[J].Cancer Letters,2006,231-240.

[11]Wu Qian,Li Shuyi,Yang Tang,et al. Inhibitory effect of lotus seedpod oligomeric procyanidins on advanced glycation end product formation in a lactose-lysine modle system[J]. Electronic Journal of Biotechnology,2015,18(2):68-76.

[12]MANSOURI E,KHORSANDI L,ZAREMOAIEDI M. Grape seed proanthocyanidin extract improved some of biochemical parameters and antioxidant disturbances of red blood cells in diabetic rats[J].Iranian Journal of Pharmaceutical Research 2015,14(1):329-334.

[13]黨婭,劉水英,李新生,等.響應面法優化紫山藥花青苷提取工藝[J].天然產物研究與開發,2015,35(22):404-410.

[14]劉文玉,顏雪琴,林祥群,等.響應面法優化超臨界CO2萃取葡萄籽原花青素工藝[J].安徽農業科學,2015,12(9):292-294.

[15]歐陽健,金家宏,王洪倫.響應面法優化纖維素酶協同提取沙棘籽粕原花青素的工藝研究[J].天然產物研究與開發,2015,27(9):1589-1594.

[16]蔣海偉,楊婷婷,李佳橋,等.響應面法優化紅米花色苷微波輔助提取工藝及其抗氧化活性研究[J].中國食品學報,2015,15(5):74-81.

[17]李茜,呂萍,薛波,孫瀟輝,等.響應面法優化超聲波輔助提取石榴籽中原花青素工藝的研究[J].食品工業科技,2013,10(9):224-228.

[18]謝藍華,杜冰,張嘉怡,等.雙水相萃取技術在食品工業中的應用研究進展[J].食品與機械,2012,28(5):234-238.

[19]Yingchun Wua,Yun Wang. Extraction and preliminary purification of anthocyanins from grape juice in aqueous two-phase system[J]. Separation and Purification Technology,2014,124 170-178.

Extraction of proanthocyanidins from rapeseed meal with aqueous two-phase system

WANG Fang,LIAO Liang,HUANG Yu,ZHAO Xiao-min,HOU Jun-Nan,CAO Wen-li,LI Dan,LI Xue-wen*

(College of Food and Pharmaceutical Sciences,Xinjiang Agricultural University,Urumqi 830052,China)

Aqueous two-phase system was used to extract proanthocyanidins from rapeseed meal. Four extraction parameters including ethanol concentration,ammonium concentration,pH,temperature were optimized based on single factor investigations for achieving yield of proanthocyanidins,the interaction of the respective variables and their influence on the yield were studied by using Box-Benhnken central composite design and response surface analysis theory,a quadric regression equation forpredicting the extraction yield of proanthocyanidins was established . The results showed that better extraction conditions were as follows:ethanol mass fraction of 26%,ammonium sulfate mass fraction of 18%,pH of 2.40,the extraction temperature 39 ℃,Under optimum conditions,the yield of proanthocyanidins was 7.78 mg/g. The study would provide certain data base for the effective utilization and development of proanthocyanidin.

rapeseed meal;proanthocyanidins;aqueous two-phase;extracting;response surface methodology

2016-06-28

王芳(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：食品工程，E-mail:lei8883@163.com。

*通訊作者:李學文(1964-)男，教授，主要從事果蔬采后生理及貯運保鮮技術研究，E-mail:1741695056@qq.com。

新疆維吾爾自治區高校科研計劃青年教師科研啟動基金(XJEDU2014S018)。

TS

A

1002-0306(2016)24-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.24.000