響應面法優(yōu)化紫萁多糖提取工藝及體外抗癌活性研究

林 薇,李巧鳳,陳 曄,詹壽發(fā)

(九江學院藥學與生命科學學院,江西九江 332000)

響應面法優(yōu)化紫萁多糖提取工藝及體外抗癌活性研究

林 薇,李巧鳳,陳 曄,詹壽發(fā)*

(九江學院藥學與生命科學學院,江西九江 332000)

本文意在優(yōu)化紫萁多糖的提取工藝,并探討紫萁多糖對癌細胞的作用。以超聲-微波協(xié)同萃取方法,料液比、微波功率和提取時間為考察因素,在單因素實驗的基礎上,設計響應面法Box-Benhnken中心組合實驗,對紫萁多糖提取工藝參數(shù)進行優(yōu)化,得到優(yōu)化紫萁多糖的提取條件:料液比1∶35(g/mL),微波功率353 W,提取時間250 s時,紫萁多糖的提取率為0.236%。以體外細胞毒性實驗方法研究紫萁多糖對HepG-2癌細胞的抑制作用,當紫萁多糖濃度為0.001 mg/mL時,對HepG-2癌細胞的抑制率為18.13%,在10 mg/mL時抑制率為72.65%,IC50值為0.474 mg/mL。

紫萁,水溶性多糖,響應面法,抑癌率

紫萁(Osmundajaponica)為紫萁科多年生草本蕨類植物,嫩葉干品可食,稱為薇菜,含有豐富的維生素、蛋白質、氨基酸[1]、多糖、黃酮、鞣酸[2]、無機鹽等多種人體所需營養(yǎng)成分,具清熱解毒、潤肺理氣、補虛舒絡、止血、安神、降壓、解熱之功效[3],主要活性成分是多糖和黃酮類化合物。多糖存在于植物體中,有廣泛的生物學活性和功能,如抗衰老、抗菌[4]、降血糖[5]等。人們逐漸認識到植物多糖不僅能作為能量資源和結構材料,更重要的是植物活性多糖參與了生命現(xiàn)象中細胞的各種活動[6],多糖在抗腫瘤[7]、抗病毒、抗輻射方面的作用引起了人們的關注。

國內外學者對紫萁多糖功能活性進行了相關研究,戴金鳳、陶海南等[8-9]對紫箕的水溶性多糖進行了提取研究,并運用氣相色譜測定了紫萁單糖由葡萄糖、甘露糖、木糖和半乳糖組成,同時也證明紫萁水溶性多糖的抑菌作用是廣譜性的,而且紫萁水溶性多糖在抗菌消炎的同時,具有止痛、生肌和護膚等功效;周仁超[10]也證明了紫萁多糖具有一定抑菌活性,特別對金色葡萄球菌和痢疾桿菌抑菌效果明顯;許文濤[11]用FARP法測定了紫萁多糖的抗氧化活性,結果表明紫萁多糖具有較好抗氧化活性;此外,Takashi等[12]曾從幼小紫萁葉中提取分離出一種具有血細胞凝集抑制作用的蛋白聚糖,這種蛋白聚糖對血型H有活性。但有關紫萁多糖抗腫瘤活性鮮見報道。

目前,有的學者分別以乙醇、水為溶劑,采用水浴浸提取法進行紫萁多糖提取,提取時間分別為2～6 h,提取溫度為90～100 ℃[13-14],該方法提取時間長,提取溫度高;張鐘等[15]以水為溶劑采用微波輔助提取技術從紫萁中提取多糖,在微波強度為539 W的條件下提取35 s,雖然提取時間較短,但微波功率較高。而超聲微波協(xié)同提取技術作為一種新興的樣品前處理方法,具有快速、高效、安全、提取時間短[16]、提取效率高[17]、重現(xiàn)性好及目標物損失少等優(yōu)點,已在天然產物活性成分研究領域廣泛應用。有關超聲微波協(xié)同提取技術在紫萁多糖提取工藝方面研究鮮見報道。本實驗以提取時間、微波功率、液料比為實驗因素,采用響應面法優(yōu)化紫萁水溶性多糖的超聲-微波協(xié)同萃取工藝,并通過細胞毒性實驗研究其對HepG-2癌細胞的體外抗癌活性,為紫萁多糖研究與利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫萁 2015年6月在江西廬山采集紫萁新鮮植株,太陽下曬干后取紫萁葉在干燥箱中烘干,將干燥的紫萁葉用粉碎機粉碎,過40目篩,貯于密封袋放入冰箱備用;HepG-2細胞 中國科學院生物化學研究所提供;葡萄糖,Sevage試劑[氯仿(V)∶正丁醇(V)=4∶1],3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT) Sigma-Aldrich公司;RPMI 1640培養(yǎng)基和胰蛋白酶-EDTA 基諾生物技術公司;胎牛血清(FBS) 杭州四季青生物工程材料有限公司。

CW-2000超聲-微波協(xié)同萃取儀 新拓分析儀器科技有限公司;(BSA124S電子天平 賽多利斯科學儀器有限公司;TDL-40B低速臺式大容量離心機 上海安亭科學儀器廠;721可見光分光光度計 天津普瑞斯儀器有限公司;AE31倒置生物顯微鏡 麥克奧迪實業(yè)集團有限公司;酶標儀 美國伯騰儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 水溶性紫萁多糖的提取和精制 稱取紫萁葉粉末2.00 g(M)加去離子水,使用超聲-微波協(xié)同提取儀提取紫萁多糖,4000 r/min離心15 min得上清液,加入3倍體積95﹪冰乙醇,置冰箱過夜后4000 r/min離心15 min,沉淀即為紫萁粗多糖。Sevage法脫蛋白2次,將脫蛋白后的多糖溶液按體積比1∶3加入95﹪乙醇溶液,沉淀得紫萁多糖(m)。

1.2.2 水溶性紫萁多糖檢測方法

1.2.2.1 葡萄糖標準曲線的制作 采用苯酚-硫酸法測定樣品中的多糖[18]。準確稱取10 mg經烘干的葡萄糖,用蒸餾水溶解并定容至100 mL(濃度為100 μg/mL)。分別吸取上述溶液0、0.1、0.5、0.9、1.3、1.8 mL加入試管中,每管用蒸餾水定容至2 mL,配制成系列標準葡萄糖溶液,各管加1.0 mL 6%苯酚溶液,再加入濃硫酸5.0 mL,靜置10 min,30 ℃水浴15 min,于490 nm處測定各管OD值,以糖含量(μg/mL)為橫坐標,OD值為縱坐標繪制標準曲線,得到葡萄糖含量x與吸光度y的回歸方程為y=13.088x+0.01885(R2=0.999),表明葡萄糖在10～100 μg/mL質量范圍濃度內線性關系良好。

1.2.2.2 紫萁多糖的測定 將脫蛋白后的紫萁多糖用去離子水溶解定容至100 mL,搖勻,從中移取2.5 mL于25 mL容量瓶,加去離子水至刻度。取樣液2.0 mL于具塞試管中,加入6%苯酚溶液1.0 mL,再加入濃硫酸5.0 mL,按標準曲線制作相同的方法進行多糖測定,按下式計算樣品中紫萁多糖的提取率:

式中:m為提取到的紫萁多糖質量,g;M為紫萁葉粉末的質量,g。

1.2.3 單因素實驗 在開啟超聲波(50 W/40 KHz)的條件下,固定微波功率150 W,料液比1∶20,考察不同提取時間60、120、180、240、300、360 s對紫萁多糖提取率的影響;固定提取時間180 s,料液比1∶20,考察不同微波功率100、150、200、250、300、350 W對紫萁多糖提取率的影響;固定提取時間180 s,微波功率150 W,考察不同料液比1∶20,1∶30,1∶35,1∶40,1∶45,1∶50 g/mL對紫萁多糖提取率的影響。

1.2.4 Box-Benhnken中心組合實驗設計 在單因素實驗的基礎上,采用Box-Benhnken實驗設計,以提取時間、微波功率、料液比為自變量,紫萁多糖提取率為響應值,建立紫萁多糖提取工藝條件的二次模型。因素水平見表1:

表1 紫萁多糖提取工藝響應曲面因素和水平

1.2.5 紫萁水溶性多糖抑癌實驗

1.2.5.1 紫萁多糖溶液的配置 精密稱取250 mg已精制的多糖,溶于10 mL的5%的葡萄糖等滲溶液,渦旋10 min左右,加入10 mL含有胎牛血清和雙抗的1640培養(yǎng)液,再加入40 μL(0.2%,v/v)的二甲基亞砜,繼續(xù)渦旋10 min左右,充分溶解后過0.45 μm水膜,用1640培養(yǎng)液定容到25 mL,即為含10 mg/mL紫萁多糖母液。用1640培養(yǎng)液稀釋成0.001、0.01、0.05、0.1、0.25、0.5、1、2、5、10 mg/mL的系列紫萁多糖溶液(使用時配制)。

1.2.5.2 細胞培養(yǎng) 人肝癌HepG-2細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中,在5% CO2培養(yǎng)箱內37 ℃培養(yǎng)傳代,取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.2.5.3 MTT法測細胞增殖抑制率 取傳代3～4代的對數(shù)生長期HepG-2細胞用胰酶消化,洗滌、離心后將其制備成細胞懸液(5.0×104個/mL),取200 μL接種于96孔板中(1.0×104個/孔)。將細胞培養(yǎng)板置于37 ℃細胞培養(yǎng)箱中,在5% CO2條件下孵育24 h,顯微鏡下觀察可見細胞貼壁生長,吸掉培養(yǎng)液,加入濃度分別為0.001、0.01、0.05、0.1、0.25、0.5、1、2、5、10 mg/mL的紫萁多糖溶液200 μL,以細胞空白和溶劑空白為對照。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,換無血清的培養(yǎng)液,每孔加入5 mg/mL的MTT 30 μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,吸去原培養(yǎng)液,毎孔加入200 μL的DMSO溶解結晶,用酶標儀于570 nm處測定其吸光度,計算不同濃度下的細胞存活率。上述實驗,每個濃度設8個復孔,每組重復3次。

式中:A1為實驗組吸光度;A2為細胞空白組吸光度;A0為溶劑空白組吸光度。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 采用Origin7.5軟件作圖,Design-expert 8.0.6軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 提取時間對多糖提取率的影響 微波功率150 W,料液比1∶20時,隨著提取時間的增加,多糖提取率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢,圖1所示。當提取時間超過240 s時,多糖提取率呈下降趨勢,原因可能是時間過長導致多糖水解程度增大,選取提取時間為240 s。

圖1 提取時間對對紫萁多糖提取率的影響Fig.1 Effect of extraction time on the yield of polysaccharides of Osmunda japonica

2.1.2 微波功率對多糖提取率的影響 提取時間180 s,料液比1∶20時,隨著微波功率的增加,多糖提取率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢,圖2所示。當微波功率超過350 W時,多糖提取率會下降,原因可能是過高的功率破壞多糖的結構使其分解,造成多糖的損失。另外,過高的功率可能引起爆沸,也引起一定程度的損失,選取微波功率為350 W。

圖2 微波功率對紫萁多糖提取率的影響Fig.2 Effect of microwave power on the yield of Polysaccharide from Osmunda japonica

2.1.3 料液比對多糖提取率的影響 提取時間180 s,微波功率150 W時,隨著料液比的增加,多糖提取率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢,圖3所示。當料液比(g/mL)超過1∶35時,多糖提取率會下降,原因可能是隨著溶劑用量的增大,出現(xiàn)了暴沸的現(xiàn)象導致不能持續(xù)加熱,同時部分提取液也會沖上冷凝管造成損失,選取料液比為1∶35。

圖3 料液比對紫萁多糖提取率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on the yield of Polysaccharides from Osmunda japonica

2.2 響應曲面實驗結果與分析

2.2.1 響應曲面實驗設計及結果 利用Design-Expert V8.0.6軟件,采用Box-Behnken設計響應曲面實驗方案,以提取時間(A)、微波功率(B)和液料比(C)為自變量,根據(jù)單因素實驗結果,按表1中的因素、水平進行實驗設計,結果見表2。

表2 響應曲面設計與實驗結果

表3 擬合二次多項式模型的方差分析

2.2.2 響應曲面分析與優(yōu)化 響應曲面是優(yōu)化存在多因素影響實驗條件的尋優(yōu)方法,通過固定數(shù)量的實驗次數(shù)可以連續(xù)的對實驗因素進行分析,并得到直觀的3D曲面圖進而評價各因素間的交互作用。根據(jù)回歸分析的結果,做出模型的響應曲面圖,結果如圖4～6所示。根據(jù)二次模型所做的響應曲面可評價實驗因素對紫萁多糖得率的交互作用,以及確定各因素的最佳水平。

圖4 微波功率和提取時間對提取率交互影響的三維曲面圖Fig.4 Response surface diagram and contour plot for yield of crude Polysaccharides as a function of microware power and extraction time

圖5 料液比和提取時間對提取率交互影響的三維曲面圖Fig.5 Response surface diagram and contour plot for yield of crude polysaccharides as a function of solid/liquid ratio and extraction time

圖6 微波功率和料液比對提取率交互影響的三維曲面圖Fig.6 Response surface diagram and contour plot for yield of crude polysaccharides as a function of microware power and solid/liquid ratio

從圖4～6中的響應曲面及其等高線可以看出,紫萁多糖提取率受提取時間、微波功率和料液比的共同影響。圖4～6所示為當固定提取時間、微波功率、料液比任一因素為為零水平時,其余兩個因素間的交互作用及對多糖提取率的影響。紫萁多糖提取率隨其中任意兩個變量的增加均呈上升趨勢,達到某一定值時,曲面稍下降或趨于平緩。其中,提取時間和微波功率的交互作用較大,而微波功率和液料比、液料比和提取時間的交互作用小。

通過對回歸模型求解方程,得出紫萁多糖的最佳提取工藝條件為提取時間250.21 s,微波功率353.31 W,料液比1∶35.23(g/mL)。此條件下紫萁多糖最大提取得率的理論計算值為0.243%。

2.2.3 驗證實驗 為檢驗實驗模型的可靠性,采用上述工藝條件進行紫萁多糖的提取實驗,同時考慮到實際操作的可行性,將實驗條件定為:提取時間250 s,微波功率為353 W,料液比為1∶35(g/mL),在此條件下提取4次,實際測得的平均提取率為0.236%,與理論預測值相比,相對誤差約為0.004%。因此,采用響應曲面法優(yōu)化得到的提取參數(shù)準確可靠,具有實用價值。

2.3 水溶性紫萁多糖抑制癌細胞增殖

統(tǒng)計不同濃度紫萁水溶性多糖溶液培養(yǎng)下的癌細胞存活率及標準差,隨著多糖濃度的上升,癌細胞的存活率迅速下降,計算IC50值為0.474 mg/mL,見圖7。多糖濃度為0.001 mg/mL時,抑制率為18.13%;當濃度為10 mg/mL時,對癌細胞的抑制率達到72.65%。

圖7 紫萁多糖對HepG-2細胞存活率的影響Fig.7 The polysaccharides of Osmunda japonica on HepG-2 effect of cell survival

本實驗初步證實紫萁中提取的水溶性多糖具有較強的抗癌活性,但其抗癌作用的機制和免疫活性的機理有待進一步的探索。

3 結論

在單因素實驗的基礎上,采用Box-Behnken實驗,優(yōu)化得到紫萁水溶性多糖提取的最佳工藝:提取時間250 s、微波功率353 W、料液比1∶35(g/mL)。在此模型下,理論提取率為0.243%,實測提取率為0.236%。與理論預測值相比,相對誤差約為0.004%。細胞毒性實驗結果顯示,隨著紫萁多糖濃度的上升,癌細胞的存活率迅速下降,IC50值為0.474 mg/mL。當多糖濃度為0.001 mg/mL時,對18.13%的癌細胞有抑制能力;當濃度為10 mg/mL時,癌細胞的抑制率達到了72.65%,表明紫萁多糖具有較強的抗癌活性,但其抗癌作用的機制和免疫活性的機理還需進一步的探究。

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Optimization of extraction of polysaccharides fromOsmundejaponicaleaves by response surface methodology and their inhibitory effects on tumor

LIN Wei,LI Qiao-feng,CHEN Ye,ZHAN Shou-fa*

(School of Pharmacology and Life Sciences,Jiujiang University,Jiujiang 332000,China)

The study was to explore the optimum processes of extraction polysaccharides fromOsmundajaponicaleaves and the effect of Polysaccharides on cancer cells. Using the ultrasonic microwave synergistic extraction,solid-liquid ratio,microwave power and extraction time as factors,based on the single factor experiment,the response surface methodology(RSM)Box-Benhnken center combination experimental design was employed to optimize the extraction of polysaccharides ofOsmundajaponica. The results of optimum extraction conditions were as follow:the solid-liquid ratio was 1∶35(g/mL),microwave power 353 W,extraction time was 250 s. Under these conditions,the extraction yield was 0.236%. According to the Cytotoxicity test,the inhibitory effect of polysaccharides fromOsmundajaponicaon the HepG-2 cancer cells had been studied. The results of cytotoxicity test indicated that the concentration of polysaccharides were 0.001 mg/mL,10 mg/mL separately,the inhibition rate was 18.13%,72.65% respectively. The vaule of IC50was 0.474 mg/mL.

Osmundajaponica;water-soluble polysaccharides;response surface methodology(RSM);Inhibition rate

2016-05-06

林薇(1995-)，女，本科，研究方向：天然植物的開發(fā)與利用，E-mail：artemislyn@163.com。

*通訊作者:詹壽發(fā)(1964-)，男，副教授，研究方向：天然植物的開發(fā)與利用，E-mail：zhan9630@126.com。

TS

A

1002-0306(2016)24-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.24.000