梓葛凍干粉針對腦缺血/再灌注損傷大鼠腦微血管通透性的影響及其機制研究

尚遠宏,田金鳳,劉 慶,李佩潞,王 敏,徐曉玉

(1.攀枝花學院干熱河谷特色生物資源研發四川省高校重點實驗室,四川攀枝花 617000;2.西南大學藥學院,重慶市藥效評價工程技術研究中心,四川重慶 400716)

梓葛凍干粉針對腦缺血/再灌注損傷大鼠腦微血管通透性的影響及其機制研究

尚遠宏1,2,田金鳳1,劉 慶1,李佩潞1,王 敏1,徐曉玉2,*

(1.攀枝花學院干熱河谷特色生物資源研發四川省高校重點實驗室,四川攀枝花 617000;2.西南大學藥學院,重慶市藥效評價工程技術研究中心,四川重慶 400716)

本文探討梓葛凍干粉針對腦缺血/再灌注損傷大鼠腦微血管通透性的影響及其作用機制。選擇雄性SD大鼠320只,隨機分為假手術組、模型組、葛根素注射液組、尼莫地平組和梓葛凍干粉針3個劑量組。線栓法復制大鼠缺血再灌注模型,分別缺血2 h,于再灌注1、4、7和14 d給藥后,取腦提取微血管,分別用Western blot法測定腦微血管中閉合蛋白(Occludin)、緊密連接蛋白-5(Claudin-5)、閉合小帶蛋白-1(ZO-1)、基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)的蛋白表達。結果表明,與模型組相比,再灌注4、7和14 d,梓葛凍干粉針16.40、32.70和65.40 mg·kg-1能抑制腦缺血/再灌注大鼠缺血側腦皮質層微血管中MMP-9蛋白表達的升高;并促進微血管中Claudin-5、Occludin、ZO-1蛋白表達。說明梓葛凍干粉針影響腦缺血/再灌注損傷大鼠腦微血管通透性的機制可能是通過抑制MMP-9蛋白表達,并促進Claudin-5、Occludin、ZO-1蛋白表達,進而保護和改善腦微血管通透性。

梓葛凍干粉針,腦缺血/再灌注損傷,腦微血管通透性

腦缺血一定時間恢復血液供應后,其功能不但未能恢復,卻出現了更加嚴重的腦功能障礙,稱為腦缺血/再灌注損傷[1],其主要特征是脂質過氧化,產生的大量自由基損傷血管內皮細胞膜,使內皮細胞水腫、通透性增加,影響腦循環,加重腦損傷。而血管通透性是指血管內各種物質通過的能力,血管通透性的變化與臨床靜脈輸液關系甚大,血管通透性高,靜脈輸液時極易發生滲漏,因此,研究血管的通透性及其相關因素至關重要[2]。同時,腦微血管通透性主要取決于內皮細胞之間的緊密連接,緊密連接不僅是細胞間屏障,而且是具有控制細胞生長發育和信號轉導的膜蛋白結構。跨膜蛋白Occludin、Claudin-5和膜相關蛋白ZO-1 是分布于腦微血管內皮細胞間重要的緊密連接相關蛋白,它們的結構、功能異常與微血管通透性破壞密切相關[3-4]。MMP-9主要在內皮細胞、膠質細胞、神經元和白細胞表達,幾乎能降解細胞外基質中的各種蛋白成分,在腦缺血再灌注損傷急性期加重血腦屏障破壞,使腦微血管通透性增強,并參與腦水腫和腦出血的組織損傷過程[5]。同時,腦缺血后MMP-9的表達或活化增加,除了造成基膜的損傷,還能降解緊密連接蛋白Claudins和Occludins[6]。

梓葛凍干粉針為課題組自主研制的治療缺血性腦卒中的中藥單體復方制劑,主要由葛根素和梓醇組成。課題組已對其改善氣虛血瘀證[7]、血腦屏障通透性[8]及腦微循環障礙的作用[9]等進行了研究,但是該制劑對腦微血管內皮細胞通透性的影響尚不清楚。本研究擬通過復制腦缺血/再灌注損傷大鼠模型,觀察梓葛凍干粉針對大鼠腦微血管通透性的影響及保護作用機制,并為梓葛凍干粉針的臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SD大鼠 320只,雄性,體質量(280±25) g,SPF級,由重慶醫科大學實驗動物中心供應(合格證號:SCXK(渝)2007-0001),于西南大學藥學院SPF級實驗動物中心飼養(許可證號:SYXK(渝)2009-0002);梓葛凍干粉針 西南大學中藥研究所;葛根素注射液 成都天臺山制藥有限公司;尼莫地平 德國拜耳醫藥保健有限公司;葡聚糖-40 美國Fisher公司;BCA蛋白測定試劑盒 碧云天生物技術研究所;RIPA(放射免疫沉淀法)組織裂解液 碧云天生物技術研究所;ZO-1多克隆抗體 北京博奧森生物技術公司;Occludin多克隆抗體 北京博奧森生物技術公司;Claudin-5多克隆抗體 北京博奧森生物技術公司;MMP-9多克隆抗體 北京博奧森生物技術公司;辣根酶標記山羊抗兔IgG 北京中杉金橋公司;抗(-actin多克隆抗體 上海生工生物工程有限公司;ECL試劑盒 美國Pierce生物技術公司;其他常規化學試劑 均為分析純,購自于成都科龍化工試劑廠。

PowerPac Basic垂直蛋白電泳系統 美國Bio-RAD公司;Quantity One化學發光成像系統 美國Bio-RAD公司;BI2000數字圖像分析系統 成都泰盟軟件公司。

1.2 動物分組及給藥

取雄性SD大鼠320只,隨機分為假手術組、模型組、葛根素注射液組、尼莫地平組和梓葛凍干粉針3個劑量組。假手術組32只,其余各組48只動物,線栓法復制大鼠I/R模型[10],再灌注時即刻給藥(再灌注0 h),尾靜脈注射給藥,每天1次(10 mL·kg-1,體質量),造模后有4個考察時間點(缺血2 h再灌注l d、4 d、7 d和14 d),每個時間點各組取材8只造模成功動物,假手術組和模型組給同等體積的生理鹽水。

1.3 樣品采集及操作

1.3.1 腦微血管的提取 參照文獻方法[11],實驗大鼠經麻醉后,斷頭處死,于冰上迅速剝離出大腦,剝去腦膜、脈絡叢、腦干及小腦。將左側病灶處皮質置于裝有1.5 mL預冷的微血管提取緩沖液的玻璃勻漿器中(質體比為1∶5),放在冰上緩慢勻漿,勻漿后,加入2.25 mL預冷的26%葡聚糖-40溶液,混勻,3800 r/min離心10 min,沉淀用3 mL預冷的26%葡聚糖-40混懸后,過濾(150目),濾液中加入2 mL預冷的PBS,混勻,3000 r/min離心6 min,沉淀用2～3 mL預冷的PBS混懸,1000 r/min離心3 min,沉淀即為腦微血管。

1.3.2 Western blot樣本處理 適量的腦微血管沉淀中加入預冷的RIPA組織裂解液(按照20 mg組織加入150 μL裂解液,在使用前加入終濃度為1 mmol/L的苯甲基磺酰氟),并用玻璃勻漿器緩慢勻漿,冰浴中靜置10 min后,組織裂解液于4 ℃,12000 r/min離心15 min后收集上清液,分裝,-80 ℃保存(備用)。

1.4 Western blot法分析

提取各組處理后的組織樣本總蛋白,BCA法蛋白定量。根據蛋白含量測定結果,用PBS將各蛋白樣品調至等濃度,加入5(蛋白上樣緩沖液,聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳,轉膜,將含有蛋白質的PVDF膜用TBST于室溫下封閉1 h;按1∶300加入一抗,4 ℃平緩搖動12 h;TBST洗膜10 min×5次;按1∶10000加入二抗,室溫振搖1 h,TBST洗10 min×5次。ECL法顯影,定影。用Bio-Rad公司圖像分析軟件進行分析,測定各組目的蛋白表達量與內參表達量(β-actin)的比值。

1.5 統計學分析

2 結果與分析

2.1 梓葛凍干粉針抑制腦缺血/再灌注大鼠MMP-9蛋白表達的升高

實驗中,假手術組皮層腦組織中MMP-9蛋白表達水平較低;腦缺血再灌注后,各考察時間點(1、4、7和14 d),與假手術組相比,模型組的大鼠缺血側腦皮質層微血管中MMP-9蛋白表達均呈升高趨勢(p<0.01),且隨著觀察時間延長其升高趨勢逐漸下降,顯示造模成功。各藥物組均能顯著誘導大鼠缺血側腦皮質層微血管中MMP-9蛋白表達降低(p<0.01),見圖1。

圖1 腦缺血/再灌注大鼠的腦微血管中MMP-9蛋白表達Fig.1 The protein expression levels of MMP-9 in cerebral microvessels of focal cerebral ischemia-reperfusion ±s,n=8)注:A、缺血再灌注4 d各實驗組MMP-9蛋白表達;B、缺血再灌注1、4、7和14 d梓葛凍干粉針65.40 mg·kg-1組MMP-9蛋白表達;C、缺血再灌注1、4、7和14 d微血管中MMP-9蛋白相對表達趨勢。

2.2 梓葛凍干粉針促進腦缺血/再灌注大鼠Claudin-5、Occludin和ZO-1蛋白表達

實驗中,假手術組皮層腦組織中有Claudin-5蛋白表達。腦缺血再灌注后,各考察時間點(1、4、7和14 d),與假手術組相比,模型組的大鼠缺血側腦皮質層微血管中Claudin-5的蛋白均呈下降趨勢(p<0.01),顯示造模成功。各藥物組均能顯著抑制大鼠缺血側腦皮質層微血管中Claudin-5蛋白表達降低(p<0.05,p<0.01),見圖2。

圖2 腦缺血/再灌注大鼠的腦微血管中Claudin-5蛋白表達Fig.2 The protein expression levels of Claudin-5 in cerebral microvessels of rats注:A、缺血再灌注4 d各實驗組Claudin-5蛋白表達;B、缺血再灌注1、4、7和14 d梓葛凍干粉針65.40 mg·kg-1 組Claudin-5蛋白表達;C、缺血再灌注1、4、7和14 d微血管中Claudin-5蛋白相對表達趨勢。

實驗中,假手術組皮層腦組織中Occludin蛋白高表達。腦缺血再灌注后,各考察時間點(1、4、7和14 d),與假手術組相比,模型組的大鼠缺血側腦皮質層微血管中Occludin蛋白均顯著下降(p<0.01),顯示造模成功。與模型組相比,在再灌注1 d時,僅尼莫地平組(2.00 mg·kg-1)能顯著抑制大鼠缺血側腦皮質層微血管中Occludin蛋白表達降低(p<0.05);在再灌注4、7和14 d時,各藥物組均能顯著抑制大鼠缺血側腦皮質層微血管中Occludin蛋白表達降低(p<0.05,p<0.01),見圖3。

圖3 腦缺血/再灌注大鼠的腦微血管中Occludin蛋白表達Fig.3 The protein expression levels of Occludin in cerebral microvessels of rats注:A、缺血再灌注4 d各實驗組Occludin蛋白表達;B、缺血再灌注1、4、7和14 d梓葛凍干粉針65.40 mg·kg-1 組Occludin蛋白表達;C、缺血再灌注1、4、7和14 d微血管中Occludin蛋白相對表達趨勢。

假手術組皮層腦組織中有ZO-1蛋白表達。腦缺血再灌注后,各考察時間點(1、4、7和14 d),與假手術組相比,模型組的大鼠缺血側腦皮質層微血管中ZO-1蛋白均顯著下降(p<0.01),顯示造模成功。與模型組相比,在再灌注1 d時,僅梓葛凍干粉針65.40 mg·kg-1組能顯著抑制大鼠缺血側腦皮質層微血管中ZO-1蛋白表達降低(p<0.05);在再灌注4、7和14 d,各藥物組均能顯著抑制大鼠缺血側腦皮質層微血管中ZO-1蛋白表達降低(p<0.05,p<0.01),見圖4。

圖4 腦缺血/再灌注大鼠的腦微血管中ZO-1蛋白表達Fig.4 The protein expression levels of ZO-1 in cerebral microvessels of rats注:A、缺血再灌注14 d各實驗組ZO-1蛋白表達;B、缺血再灌注1、4、7和14 d梓葛凍干粉針65.40 mg·kg-1 組ZO-1蛋白表達;C、缺血再灌注1、4、7和14 d微血管中ZO-1蛋白相對表達趨勢。

3 討論

腦缺血及再灌注后將出現MMP表達的增加,其中MMP-9與腦缺血再灌注損傷的關系尤為密切[12]。腦缺血后MMP-9激活主要的病理作用就是通過降解基底膜,主要降解毛細血管基底膜的一些基質蛋白,如膠原、層黏素、黏蛋白以及內皮細胞間的緊密連接蛋白[13],破壞血管的完整性,破壞血腦屏障[14],導致血管源性腦水腫。本研究結果表明,在再灌注1、4、7和14 d,與假手術組比較,模型組的大鼠缺血側腦皮質層微血管中MMP-9蛋白表達呈升高趨勢,而MMP-9含量增多,可進一步加重缺血灶周圍的微血管的損傷程度,且與EB含量和血管源性腦水腫含水量的變化趨勢一致[15],提示MMP-9在繼發性腦損傷和血管源性水腫中起重要作用。尾靜脈注射16.40、32.70和65.40 mg·kg-1的梓葛凍干粉針均能抑制腦缺血再灌注損傷引發的MMP-9蛋白表達水平升高,提示梓葛凍干粉針對腦缺血再灌注損傷起到保護作用可能與其降低腦微血管中MMP-9蛋白表達水平有關。

腦水腫是中風急性期死亡的主要原因,血管源性腦水腫的發生和發展與損傷區微血管通透性和血腦屏障的完整性密切相關。腦缺血和再灌注導致腦微循環和微血管的許多變化,其中微血管通透性的改變是病變過程中最重要的變化之一[16]。微血管通透性的改變受多個環節、多種因素的影響,能夠阻斷其中任何環節的手段和方法,均可能防止通透性的進一步增高,緩解缺血后腦水腫形成的作用。本研究表明,在考察相對應的時間點(1、4、7和14 d),與假手術組比較,模型組的大鼠缺血側腦皮質層微血管中Occludin、Claudin-5和ZO-1蛋白表達均顯著下降,破壞了腦微血管細胞間緊密連接,進而破壞血腦屏障結構的完整性和功能正常發揮,使血管通透性增加,加重再灌注后腦水腫,使腦缺血/再灌注的損傷程度加重,與文獻報道一致[17]。尾靜脈注射16.40、32.70和65.40 mg·kg-1的梓葛凍干粉針均能抑制Occludin、Claudin-5和ZO-1蛋白表達降低,且3個劑量組對于3種結構蛋白具有正向調節作用,此結果說明梓葛凍干粉針對腦缺血起到保護作用可能與升高腦微血管中Occludin、Claudin-5和ZO-1蛋白表達有關。

4 結論

本文研究結果表明梓葛凍干粉針影響腦缺血/再灌注損傷大鼠腦微血管通透性的機制可能與抑制MMP-9蛋白表達,并促進Claudin-5、Occludin和ZO-1蛋白表達有關,進而保護和改善腦微血管通透性,為梓葛凍干粉針的臨床應用奠定了實驗基礎。

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Study on the effects and underling mechanism of Zige lyophilized powder for injection against the microvascular permeability after cerebral ischemia-reperfusion injury of rats in the celebral microcirculation

SHANG Yuan-hong1,2,TIAN Jin-feng1,LIU Qing1,LI Pei-lu1,WANG Min1,XU Xiao-yu2,*

(1. Key Laboratory of Dry-hot Valley Characteristic Bio-Resources Development at university of Sichuan Province,Panzhihua University,Panzhihua 617000,China; 2.College of Pharmacetical Sciences,Southwest University,Chongqing Engineering Research Center for Pharmacodynamics Evaluation,Chongqing 400716,China;)

This paper investigated the possible mechanism underlying the protective effect of Zige lyophilized powder for injection against the microvascular permeability after cerebral ischemia-reperfusion injury of rats in the celebral microcirculation. 320 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham group,model group,puerarin injection group,nimodipine injection group,three groups of Zige lyophilized powder. Middle cerebral artery occlusion(MCAO)model was produced by using an intraluminal filament technique in rats. Drugs were administered intravenously(i.v.)2 h after MCAO and reperfusion for l d,4 d,7 d and 14 d. The expression levels of MMP-9,ZO-1,Occludin and Claudin-5 protein of the brain microvessel in the lateral ischemic cerebral cortex were detected by Western blot. In reperfusion for 4,7 and 14 d,compared with model group,Zige lyophilized powder groups(16.40 mg·kg-1,32.70 mg·kg-1and 65.40 mg·kg-1)could reduce MMP-9 protein expression in microvessel of the lateral ischemic cerebral cortex,and could increase ZO-1,Occludin and Claudin-5 protein expression in the corresponding time. These results suggested that the protective effect of Zige lyophilized powder for injection on the microvascular permeability after cerebral ischemia-reperfusion injury was mediated by reducing MMP-9 and increasing ZO-1,Occludin,Claudin-5 protein expression.

Zige lyophilized powder for injection;Cerebral ischemia-reperfusion injury;Microvascular permeability

2016-04-28

尚遠宏(1980-)，男，博士，研究方向：中藥藥理和食品研究，E-mail：shyh611@126.com。

*通訊作者:徐曉玉(1958-)，女，碩士，教授，研究方向：中藥藥理，E-mail：xuxiaoyu@swu.edu.cn。

國家青年基金項目(31402237);四川省教育廳重點基金項目(14ZA0345, 15ZA0370);四川省高校重點實驗室開放基金項目(GR-2013-E-02,GR-2015-E-01);攀枝花市社會發展科技計劃項目(2014TX-10-3,2016CY-S-10);攀枝花學院博士科研啟動經費項目(bkqj2015026, bkqj2015023)。

TS201.2

A

1002-0306(2016)24-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.24.000