PCR反應體系的設計及優化

◆紀朋艷

PCR反應體系的設計及優化

◆紀朋艷

PCR是分子生物學中常用的實驗技術手段，在揭示生命現象規律方面發揮了至關重要的作用。目前在進行PCR實驗操作時，因為PCR反應體系設計不合理而導致實驗失敗的事例較多。因此，從優化PCR反應體系的角度出發，對提高PCR反應效率進行探討。

PCR；反應體系；實驗

1 標準PCR反應體系

標準的PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈式反應）反應體系由緩沖液、脫氧核苷三磷酸、DNA聚合酶、引物、DNA模板等構成[1]，每個部分在PCR反應中都有重要的作用，并且在合適的濃度范圍內才能促進PCR反應的正常進行。

2 PCR反應體系設計

模板核酸DNA模板是PCR反應復制的原始基礎，模板質量的優劣，直接決定了整個PCR反應的成敗。目前DNA提取方法主要有酚氯仿、高鹽法及各試劑公司的試劑盒。酚氯仿作為傳統經典的方法，一直受到科研工作者的青睞，其DNA提取質量與純度較高，但是缺點是程序繁瑣、提取效率低。目前在一些樣品比較大的實驗中，主要采用高鹽法提取DNA。試劑盒提取DNA效率與質量都較好，但是費用較高。在PCR反應體系中，一般加入模板的質量為50～100 ng，加入模板的量過多，或產生較多的雜質，出現很多非特異性產物；如果加入的模板較少，產生的特異性產物較少，在檢測過程中不易檢測。

DNA聚合酶DNA聚合酶是PCR反應中將游離的散亂的堿基按照模板中堿基的順序，連接于DNA雙鏈中的粘合劑。目前DNA聚合酶主要有兩種類型：一種是從水生桿菌中提取的天然聚合酶；另一種是利用大腸桿菌人工合成的基因工程酶。由于當前分子生物學的迅速發展，人工合成的基因工程酶越來越多地得到應用，在20 μl PCR反應體系中，所需要的DNA聚合酶一般為2.5個單位。加入的NDA聚合酶過多，會引起很多非特異性擴增，產生沒有用途的非特異性產物；相反，如果加入的DNA酶過少，則會減少特異性產物的產量。

脫氧核苷三磷酸（dNTP）dNTP是合成DNA的原料，主要是4種堿基。dNTP是以干粉狀態保存的，在進行分子實驗時，需要利用緩沖液溶液和調節pH值，并且小量分裝，保存在-20 ℃冰箱中。盡量減少反復凍融的次數，在PCR反應中dNTP的濃度一般在50～200 μmol/L范圍內。注意4種dNTP的濃度要相等，如果任何一種dNTP的濃度過低，產生錯配的幾率將會大大增大；如果dNTP的整體濃度過低，則會降低PCR反應中特異性產物的量；如果dNTP量過高，則會與Mg2+結合，降低Mg2+的濃度。

引物引物中堿基與模板DNA互補的程度，決定了PCR產物的特異性，這也是PCR特異性擴增反應的關鍵環節。在設計引物序列時，一般遵循以下幾個原則：

1）引物的長度一般在15～30 bp之間，20 bp為最優，過短或者過長都不利于PCR的特異性反應；

2）引物的擴增跨度在200～500 bp為好，在特定情況下也可以將擴增片段增至10 kbp；

3）引物的4種堿基中，3′端含有G或者C可以提高引物的特異性，G、C的含量在40%～60%為好，太少或者太多都不利于擴增；

4）引物之間要避免堿基的互補，否則會出現發夾結構，這種二級結構阻止引物與模板的復性結合；特別要注意的是，引物之間不能有連續4個以上的堿基互補，否則產生的非特異性擴增條帶會增多；

5）引物的最末及倒數第二個堿基要嚴格配對，避免引物末端堿基不配對而導致PCR的失敗；

6）引物的序列與數據庫中其他序列應無明顯同源性，在引物中可以加上合適的酶切位點，有利于酶切分析和分子克隆。

Mg2+濃度Mg2+對PCR擴增的產量和特異性有顯著的影響。在一般的PCR反應中，各種dNTP濃度為200 μmol/L時，Mg2+濃度為1.5～2.0 mmol/L為宜。Mg2+濃度過高，反應特異性降低，出現非特異擴增；濃度過低，會降低DNA聚合酶的活性，使反應產物減少。

3 PCR反應體系的優化

反應體積的優化PCR反應體積一般采用的范圍為20～100 μl，常采用的為20 μl、30 μl、50 μl、100 μl。具體在實驗中采用哪種反應體系，要根據實驗的目的和實驗條件來決定。參考已公開的PCR反應體積，進行不同體積的PCR反應，各組分的質量和濃度不能單純地擴大或者減小，一定要根據實驗PCR擴增效果進行摸索，減少或者增加個別組分的質量濃度，最終得到合適的PCR反應體系[2]。

引物擴增效率的優化引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度存在問題，是PCR失敗或擴增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對此提出以下對策：

1）選定一個好的引物合成單位；

2）引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現，而且兩引物帶的亮度應大體一致（如果一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應和引物合成單位協商解決；如果一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度）；

3）引物應高濃度小量分裝保存，防止多次凍融，或因長期放冰箱冷藏而導致引物變質，降解失效；

4）避免引物設計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。

PCR反應條件的優化PCR的反應條件主要是溫度、時間及循環次數。溫度主要是按照PCR的三個步驟“變性—退火—延伸”設置的。一般的PCR反應，DNA變性溫度為90～95 ℃，退火溫度為40～60 ℃，延伸溫度為70～75 ℃；但是在實際PCR反應中，溫度與時間的設置是統一在一起進行的。一般來講，在93～94 ℃時，1 min便可以使DNA變性；若低于93 ℃，設置的時間需要長一些；但是過高的溫度會影響DNA聚合酶的活性。因此，退火溫度與時間的設置一般在93～94 ℃時1 min。

退火溫度、時間的設置決定于引物的長度、堿基、濃度及其目的片段的長度。可參考以下公式選擇合適的溫度[3]：

Tm值（解鏈溫度）=4(G+C)+2(A+T)

復性溫度=Tm值-(5～10 ℃)

一般來講，在解鏈溫度允許的范圍內，較高的復性溫度可以提高PCR反應的特異性，復性時間一般在30～60 s，足可以保證引物的模板的充分結合。

PCR的延伸溫度一般設置在70～75 ℃，常用為72 ℃，過高或者過低的溫度都不利于引物與模板的結合。PCR的延伸時間是由擴增片段的大小決定的，1 kb以內的DNA片段，延伸時間在1 min左右；3～4 kb的擴增片段，延伸時間在3～4 min；10 kb則需要延伸10 min以上。

循環次數決定了整個PCR的擴增程度，一般設計在30～40次之間為好。設計次數過少，目的片段產物過低，不容易檢測；擴增次數過多，產生的非特異性產物也增多，對目的片段的檢測產生干擾。

PCR反應各組分濃度的優化PCR中Mg2+、引物及dNTP三種組分的濃度對擴增反應的影響較大。在對PCR反應進行優化的情況下，可根據數據庫上的相關文獻，參考已經發表的其他反應體系組分，對Mg2+、引物及dNTP的組分設置一系列的濃度，必要時可根據設置濃度的多少，進行正交試驗設計[4]，利用同一個DNA樣品進行相同程序下的擴增，根據目的片段的量的多少，確定哪種組分組合是最優的PCR反應組合。

PCR產物的檢測對PCR產物的檢測效果可以對整個PCR反應體系進行優化，如在PCR擴增產物中檢測出涂抹帶或地毯樣帶，其主要原因為加入的酶的質量過多、dNTP濃度過高、Mg2+濃度過高、退火溫度過低、循環次數過多等。根據這個原因，對PCR反應的各個組分的濃度進行調整，可以提高PCR的反應效率。

[1]田艷伶,李志輝,楊振華,等.鉤粟ISSR-PCR反應體系的建立與優化[J].中南林業科技大學學報,2015(4):11-15.

[2]王小燕,葉祖云,等.正交設計優化太子參ISSR-PCR反應體系[J].邵陽學院學報:自然科學版,2015(6):23-25.

[3]陳升侃,項東云,鄧紫宇,等.粗皮桉ISSR-PCR反應體系優化[J].桉樹科技,2015(3):45-48.

[4]蘇輝,李志剛,宋書宏.正交設計優化大豆SSR-PCR反應體系及引物篩選[J].華北農學報,2009(4):23-27.

Design and Optimization of PCR Reaction System

JI Pengyan

Polymerase Chain Reaction (PCR) technology is commonly used in molecular biology experiments,which played a vital role in terms of reveals life phenomenon law. Now in the PCR laboratory procedures,more and more PCR experiment were failure examples because the not reasonable design PCR reaction system. Therefore,this article discussed the perspective of the PCR reaction system to improve the eff ciency of the PCR reaction.

Polymerase Chain Reaction;reaction system;experiment

G642.423

B

1671-489X(2016)02-0160-02

作者：紀朋艷，吉林醫藥學院醫學實驗中心（132013）。

10.3969 /j.issn.1671-489X.2016.02.160