呼吸道合胞病毒基因分型的研究進(jìn)展*

梁有才，陸學(xué)東(.廣東醫(yī)學(xué)院，廣東湛江 54000；.廣東醫(yī)學(xué)院附屬福田醫(yī)院，廣東深圳 58033)

人類呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus，RSV)是引起嬰幼兒嚴(yán)重呼吸道感染的主要病原體之一[1]。RSV的流行受地理位置、季節(jié)、氣候因素影響；在溫帶地區(qū)，無論南北半球，以冬春季節(jié)流行為主；靠近赤道地區(qū)常年流行[2]。RSV感染者一般是兩歲以內(nèi)的嬰幼兒，或者是老年人與免疫缺陷者；隨著兒童年齡增長，感染概率降低。RSV所導(dǎo)致的癥狀包括呼吸道感染、發(fā)燒、中耳炎、哮喘、嚴(yán)重的細(xì)支氣管炎和肺炎等[3～6]。世界衛(wèi)生組織在全球疫苗計劃中優(yōu)先發(fā)展RSV疫苗，RSV融合蛋白是國外僅有的被批準(zhǔn)用于預(yù)防高危嬰幼兒感染RSV的單克隆抗體，但在中國尚未被批準(zhǔn)使用，中國還沒有預(yù)防RSV感染的有效疫苗[4]。

因此，研究準(zhǔn)備更多RSV基因與疾病關(guān)系的資料，將在RSV感染的疫苗研制、診治和衛(wèi)生保健方面發(fā)揮重要作用。本文擬對RSV的基因分型，及其與疾病的相關(guān)性做討論。

1 RSV的基因結(jié)構(gòu)

呼吸道合胞病毒是一種有包膜的RNA病毒，屬于副黏病毒科，肺炎病毒屬，基因有15 222個核苷酸(nt)，共含有10個基因，其側(cè)翼序列有44nt的前導(dǎo)序列(leader)與155nt的拖尾區(qū)(trail)，順序為：3’-Leader-NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L-Trailer-5’，在L基因起始與M2基因結(jié)尾序列之間有68nt的重疊基因。除L基因外的其它基因都有保守的起始序列，這些基因包含有病毒復(fù)制轉(zhuǎn)錄的啟動子，L基因的起始序列為3’-CCCCGUUUA……5’，它包含了能讓病毒直接轉(zhuǎn)錄所需的啟動信息。10個基因能編碼至少11種已知蛋白：NS1和NS2為非結(jié)構(gòu)蛋白，是干擾素系統(tǒng)的拮抗物；N是核殼蛋白；P是磷酸蛋白，是聚合酶復(fù)合物的重要成分；M是基質(zhì)蛋白；SH是一種小疏水橫跨膜表面糖蛋白；G是一種N端和O端糖基化的Ⅱ型橫跨膜黏附糖蛋白；F是N端糖基化的Ⅰ型橫跨膜糖蛋白，與細(xì)胞質(zhì)膜融合，在物質(zhì)通過胞膜時產(chǎn)生作用；M2基因至少編碼了兩種產(chǎn)物(其中的M2-1是一種獨特的轉(zhuǎn)錄因子，而M2-2是一種調(diào)節(jié)因子)；L基因編碼RNA依賴性RNA聚合酶的催化亞基。除了NS1，NS2和M2-2以外，所有的蛋白都是病毒顆粒的結(jié)構(gòu)成分。G和F蛋白是主要的保護(hù)與中和抗原。N，F(xiàn)，M2-1和SH蛋白是細(xì)胞毒性T細(xì)胞的靶位[1]。

2 RSV的基因分型

目前RSV基因檢測相關(guān)技術(shù)有：各種PCR技術(shù)，包括巢式PCR，RT-PCR，實時熒光定量PCR等；還包括DNA測序、核酸雜交技術(shù)、基因芯片技術(shù)、多重基因表達(dá)遺傳分析系統(tǒng)(GeXP)等。分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展使RSV基因檢測分型更加快捷準(zhǔn)確，越來越多新的RSV基因型被發(fā)現(xiàn)與研究。

已經(jīng)報道的RSV基因型包括RSV-A與RSV-B。RSV-A包括：SAA1，GA1，GA2… GA6，GA7，NA1，NA2，ON1，CB-A。RSV-B包括：URU1，URU2，GB1，GB2，GB3，GB4，SAB1，SAB2，SAB3，SAB4，BA1，BA 2… BA11，BA12，AB4，CB-B，GB5(CB1)[1，3～5，7～9]。

RSV的兩種主要的基因型A(RSV-A)和B(RSV-B)，分型依據(jù)為RSV的G蛋白與單克隆抗體反應(yīng)的不同，以及G蛋白基因的不同(也有報道，RSV基因分型是基于單克隆抗體對G蛋白、F蛋白的反應(yīng)，以及這兩種蛋白的基因分析[8]，更細(xì)的基因分型基于G蛋白基因C末端結(jié)尾第二高度可變區(qū)核苷酸序列分析[3，9]。G蛋白總體構(gòu)架類似于黏蛋白，但缺少了其它副黏病毒黏附蛋白中所具有的血細(xì)胞凝集素和神經(jīng)氨酸酶的活性[1]。G蛋白極易發(fā)生基因突變，典型的RSV-A和RSV-B之間，G蛋白氨基酸序列的50%可以改變，不同基因型間G蛋白氨基酸的同源性可僅有53%，抗原相關(guān)性可僅為5%[10]。

RSV-A和RSV-B各自的型內(nèi)也存在主要源于G蛋白的抗原與基因的較大差異(可存在20%的氨基酸改變)，還有SH和N蛋白的有限變異。氨基酸序列的變異處于G蛋白的兩個胞外區(qū)，橫跨膜區(qū)與胞內(nèi)中心富含半胱氨酸區(qū)則高度保守，但位于保守區(qū)旁邊的兩個區(qū)域是高度可變區(qū)。分析這兩個區(qū)域的變化提示有三個突變的機(jī)制：①替換；②三個可讀框移碼突變；③終止密碼子的改變，導(dǎo)致不同長度的蛋白的產(chǎn)生[1]。基因型內(nèi)差異為進(jìn)行更細(xì)基因分型提供了依據(jù)，也提供了型內(nèi)進(jìn)化的基礎(chǔ)。對RSV毒株進(jìn)行種系遺傳學(xué)分析顯示，RSV-A基因進(jìn)化率估計在6.72×10-4替代/位點/年(95%HPD：5.61×10-4，7.6×10-4)，而RSV-B的進(jìn)化率估計在7.69×10-4替代/位點/年(95%HPD：6.81×10-4，8.62×10-4)[5]。

此外，有學(xué)者提出，不僅僅RSV的基因編碼序列可以變異，控制基因表達(dá)的信號也可以改變，所以調(diào)整關(guān)鍵蛋白的表達(dá)進(jìn)而影響基因表達(dá)是導(dǎo)致抗原變異的第二個原因[1]。推測這可能已經(jīng)影響到了之前的基因分型結(jié)果，或可能會成為基因分型的又一個依據(jù)。

3 RSV-A與RSV-B的感染優(yōu)勢對比

RSV的兩種主要基因型RSV-A和RSV-B以各種混合形式傳播[4]，它的流行受地理位置和季節(jié)因素的影響，兩種主要基因型的交替流行可能跟人體免疫導(dǎo)致的選擇壓力有關(guān)[2，10]。

很多研究對比了RSV兩種主要基因型的疾病感染優(yōu)勢：De-Pairs等[6]發(fā)現(xiàn)，南巴西的RSV-A占疾病感染優(yōu)勢。Bose等[5]發(fā)現(xiàn)，烏拉圭蒙得維的亞地區(qū)通常RSV-A占疾病感染優(yōu)勢，但某些感染中，RSV-B會更頻繁地被檢測到。Obodai等[11]發(fā)現(xiàn)，加納的RSV-B占疾病感染優(yōu)勢。Biswas等[8]發(fā)現(xiàn)，東北印度阿薩姆邦地區(qū)2009～2012年間只檢測到RSV-A(NA1，GA5)感染，未能檢測到RSV-B。Choudhary等[4]總結(jié)發(fā)現(xiàn)，西印度2009～2012年RSV-B總體上占疾病感染優(yōu)勢。但2009～2010年期間RSV-B占疾病感染優(yōu)勢，2011年RSV-A占疾病感染優(yōu)勢，在2012年RSV-A占疾病感染優(yōu)勢。Geis等[12]發(fā)現(xiàn)，德國海德爾堡地區(qū)RSV-A占疾病感染優(yōu)勢。杜麗娜等[10]發(fā)現(xiàn)，中國重慶地區(qū)2008～2009年度RSV-B占疾病感染優(yōu)勢。Ren等[7]發(fā)現(xiàn)，中國重慶兒童醫(yī)院檢出的RSV-A總體上占疾病感染優(yōu)勢。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在2009年夏季到2010年的春季RSV-B占疾病感染優(yōu)勢；而在2010年夏季到2012年春季RSV-A占疾病感染優(yōu)勢；在2012年夏季到2013年春季，RSV-B占疾病感染優(yōu)勢。

綜上世界各地資料，總體上看起來RSV-A在更多地方占疾病感染的優(yōu)勢地位，但并不是在所有地方都占據(jù)優(yōu)勢，而且同一個地方的不同時間段優(yōu)勢流行的基因型可不同。目前研究資料提示，相對于RSV-B來說，更多地方RSV-A占據(jù)了感染優(yōu)勢，但沒有某一基因型能穩(wěn)定地占據(jù)流行的主導(dǎo)地位。在某一地區(qū)或者某一時間段的疾病感染中，可能出現(xiàn)兩種基因型同時流行的情況，或者其中的某種基因型占優(yōu)勢的情況[10]。

4 RSV各基因型與呼吸道疾病的嚴(yán)重性

RSV的G和F蛋白是病毒中和反應(yīng)，抗原性和毒力的主要抗原。G蛋白是RSV感染后人體免疫反應(yīng)的主要靶位(包括F糖蛋白)。G蛋白抗原和基因變異比F蛋白更加頻繁，如此高的變異可能導(dǎo)致G蛋白在促進(jìn)RSV感染的過程發(fā)揮重要作用[13]。

RSV亞型的改變與RSV的反復(fù)感染有關(guān)。G蛋白相關(guān)免疫是基于其對應(yīng)亞型的特征產(chǎn)生的，不同亞型的G蛋白，不能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生不同亞型間交叉保護(hù)作用的有效抗體，毒株之間的基因變異可以改變其致病性和逃避免疫防御而復(fù)發(fā)感染和暴發(fā)流行[1，6，10]。

G蛋白胞外區(qū)經(jīng)歷了強(qiáng)烈的陽性選擇，RSV-A的G蛋白就有29個陽性氨基酸選擇位點，比如在GA2與GA3的G蛋白氨基酸序列對比中發(fā)現(xiàn)了一些陽性選擇位點(Pro226Leu，Ser269Thr，Pro289Ser和Pro290Leu)。其中的Pro226Leu是用來辨別GA3的位點，而某些位點(226和290)是RSV-A的抗原表位。在嚴(yán)重疾病比如細(xì)支氣管炎中，氨基酸這些位點的變化可能發(fā)揮了重要作用[13]。

很多研究發(fā)現(xiàn)，RSV不同基因亞型導(dǎo)致的疾病嚴(yán)重程度不同：Goto-sugai等[13]認(rèn)為，某些RSV基因型和疾病嚴(yán)重性的關(guān)系存在輕微不同。Goto-sugai等[13]對G蛋白的基因分析時發(fā)現(xiàn)，GA3與很嚴(yán)重的疾病相關(guān)，例如細(xì)支氣管炎、肺炎。有報道認(rèn)為[14]，相對于B7和B9，NA1與嚴(yán)重的住院病情更緊密相關(guān)。Panayiotou等[3]指出，先前有報道認(rèn)為RSV-A導(dǎo)致疾病的嚴(yán)重性大于RSV-B，而他們的研究提示RSV-BA(屬于RSV-B)導(dǎo)致疾病的嚴(yán)重性大于RSV-A。他們還發(fā)現(xiàn)，相對于GA2與BA基因亞型，ON1亞型所致疾病較輕。另外，與其它人不同，Goto-sugai等[13]發(fā)現(xiàn)，GA2和BA與細(xì)支氣管炎相關(guān)，而RSV-A所引起疾病的嚴(yán)重性與RSV-B所引起疾病的嚴(yán)重性沒有明顯不同。

綜上所述，G蛋白的高度變異在RSV病毒感染與復(fù)發(fā)感染中發(fā)揮了重要作用。G蛋白的基因改變是RSV分型的基礎(chǔ)，因此它的變異也是RSV不同亞型導(dǎo)致疾病輕重不同的關(guān)鍵。目前對RSV基因型與疾病的相關(guān)性研究，已經(jīng)從討論RSV-A及RSV-B向討論更細(xì)的基因亞型過渡，比如BA，ON1，GA2，GA3，GA5等。RSV-A與RSV-B兩者都有可能導(dǎo)致相對嚴(yán)重的臨床癥狀，就本文所知，總體上RSV-A比RSV-B導(dǎo)致了更多的嚴(yán)重疾病，但其相關(guān)性尚未完全明確。RSV-A與RSV-B究竟哪一種更能導(dǎo)致更嚴(yán)重的疾病，尚未定論，有待后續(xù)更多系統(tǒng)性研究來證實。另外，有報道認(rèn)為，相對基因型來說，呼吸道所感染的病毒量跟疾病輕重相關(guān)性更為明顯[3，13]。

5 展望

我們知道，RSV的基因分型與疾病嚴(yán)重性的關(guān)鍵，主要源于G蛋白的基因和抗原的改變。但RSV各基因型與疾病的相關(guān)性尚未完全明了。RSV各基因型的流行病學(xué)資料還不夠齊全，系統(tǒng)闡述尚需進(jìn)一步的調(diào)查研究。

今后應(yīng)從以下幾個方面努力：①系統(tǒng)地、有計劃地在世界各地進(jìn)行RSV基因檢測及分型，統(tǒng)計好各地RSV各基因型流行病學(xué)資料，建立其全世界范圍的RSV基因型流行病學(xué)資料庫。②系統(tǒng)地研究RSV各基因型與所致疾病的關(guān)系，統(tǒng)計其與疾病輕重及臨床癥狀的相關(guān)性，建立針對特定基因型的預(yù)防診療方案。③尋找藥物可以有效作用的RSV基因靶位及其表達(dá)抗原，尋找可用于疫苗研制的基因序列。④重視分子診斷技術(shù)與醫(yī)學(xué)交叉結(jié)合的學(xué)科，開發(fā)更先進(jìn)適用的分子生物學(xué)分析技術(shù)并應(yīng)用于臨床診斷治療。

總之，新的分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展給RSV基因及其分型的研究帶來了極大便利和機(jī)遇。繼續(xù)推進(jìn)RSV基因及其分型的研究，會推動RSV疫苗研制和感染風(fēng)險模型的建立，會給RSV感染的預(yù)防、診治、衛(wèi)生保健等帶來重大幫助。

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