低濃度補(bǔ)腎中藥血清聯(lián)合骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2對人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)作用

王建偉　楊俊鋒　張亞峰　郭　楊　顧曉林　馬　勇

(無錫市中醫(yī)醫(yī)院　南京中醫(yī)藥大學(xué)骨傷研究所，江蘇　無錫　214000)

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低濃度補(bǔ)腎中藥血清聯(lián)合骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2對人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)作用

王建偉楊俊鋒張亞峰郭楊1顧曉林1馬勇1

(無錫市中醫(yī)醫(yī)院南京中醫(yī)藥大學(xué)骨傷研究所，江蘇無錫214000)

摘要〔〕目的觀察低濃度補(bǔ)腎中藥血清聯(lián)合骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)-2對人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)體外增殖、成骨分化的生物學(xué)作用。方法取正常孕婦臍靜脈血培養(yǎng)第3代人臍血MSCs，制備補(bǔ)腎中藥大鼠血清，按誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基不同，隨機(jī)分為空白對照組、中藥血清組、BMP-2組、中藥血清+BMP-2組(聯(lián)合組)。以MTT比色法檢測臍血MSCs增殖活性，觀察堿性磷酸酶(ALP)活性、礦化結(jié)節(jié)及Ⅰ型膠原染色以檢測細(xì)胞成骨分化能力。結(jié)果與空白對照組比較，聯(lián)合組、BMP-2組在誘導(dǎo)第3、5天細(xì)胞增殖活性明顯提高，在誘導(dǎo)第3、6、9、12天ALP活性明顯提高(P<0.05)。與BMP-2組比較，中藥血清+BMP-2組在誘導(dǎo)第5天增殖活性明顯提高，在誘導(dǎo)第6天ALP活性明顯提高(P<0.05)。成骨誘導(dǎo)第14天，除空白對照組外各組von Kossa染色均可見細(xì)胞間散在黑色顆粒，尤以聯(lián)合組為明顯；而Ⅰ型膠原纖維表達(dá)，BMP-2組、聯(lián)合組與空白對照組相比均明顯增強(qiáng)。結(jié)論低濃度補(bǔ)腎中藥血清聯(lián)合BMP-2后能誘導(dǎo)人臍血MSCs增殖及定向成骨分化，是復(fù)合型誘導(dǎo)因子的一種理想選擇。

關(guān)鍵詞〔〕補(bǔ)腎中藥；骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2；臍血間充質(zhì)干細(xì)胞；成骨分化；增殖

1南京中醫(yī)藥大學(xué)

第一作者：王建偉(1963-)，男，主任醫(yī)師，教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事骨折創(chuàng)傷研究。

人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)作為來源于中胚層的成體干細(xì)胞，由于具有取材方便，免疫源性較低，不易被病毒感染等優(yōu)點(diǎn)，目前作為組織工程的新型種子細(xì)胞在骨創(chuàng)傷缺損的修復(fù)方面具有廣闊的前景〔1，2〕。然而，在體外培養(yǎng)時(shí)由于臍血中MSCs含量較低，其增殖、成骨分化很大程度上依賴于誘導(dǎo)因子的活性。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)-2是骨形成蛋白家族中誘導(dǎo)成骨分化最強(qiáng)的細(xì)胞因子，但由于其費(fèi)用昂貴，臨床運(yùn)用受到一定限制。目前已有臨床研究報(bào)道〔3〕，補(bǔ)腎中藥血清能明顯促進(jìn)骨髓MSCs增殖及成骨分化，而人臍血MSCs在形態(tài)及生物學(xué)特性等方面均與骨髓MSCs相似。本實(shí)驗(yàn)選取骨碎補(bǔ)、狗脊等14味補(bǔ)腎中藥，觀察低濃度補(bǔ)腎中藥血清能否促進(jìn)BMP-2誘導(dǎo)人臍血MSCs體外增殖及成骨分化。

1材料與方法

1.1主要實(shí)驗(yàn)藥物、試劑及儀器補(bǔ)腎中藥為我院劉氏骨傷治療骨折、骨質(zhì)疏松傳承經(jīng)驗(yàn)方，方劑組成：生黃芪20 g，山萸肉10 g，淫羊藿10 g，骨碎補(bǔ)30 g，狗脊10 g，女貞子10 g，制附子9 g，蛇床子10 g，細(xì)辛6 g，白術(shù)10 g，白芍20 g，雞血藤15 g，鹿銜草15 g，生甘草9 g，以上均為顆粒劑，由南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房提供(江陰中藥廠生產(chǎn))；BMP-2 (PEPROTECH，USA)；低糖DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清(美國Hyclone公司)；MTT試劑盒(凱基生物)；Hepes、二甲基亞砜(DMSO，Sigma公司)；硝酸銀溶液(上海化學(xué)試劑公司)；Ⅰ型膠原免疫化試劑盒(武漢博士德公司)。紫外分光光度儀(德國Eppendorf公司)，ELx800酶標(biāo)儀(美國BioTek公司)，倒置式系統(tǒng)相差顯微鏡(日本 Olympus)。

1.2補(bǔ)腎中藥血清制備取清潔級(jí)成年雄性SD大鼠18只，體重(200±20)g，均由南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào)：SCXK (蘇)2008-0004。將補(bǔ)腎中藥煎制濃縮成含生藥2 g/ml的藥液，根據(jù)人和動(dòng)物體表面積折算法計(jì)算，按250 mg·kg-1·d-1生藥劑量給大鼠灌胃1 w，2次/d，1 w后頸動(dòng)脈取血，制成5%補(bǔ)腎中藥血清，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3人臍血MSCs的體外分離、培養(yǎng)及傳代臍血取自足月或早產(chǎn)正常分娩的產(chǎn)婦，排除惡性腫瘤、各種傳染性疾病，無家族遺傳疾病，嚴(yán)格按照無菌要求操作，取臍血前征得產(chǎn)婦及其家屬同意，均由南京市婦幼保健院提供。無菌條件下，穿刺臍靜脈，抽吸臍靜脈血60 ml左右，肝素抗凝。與Hank液1∶1混勻后按2∶1疊加于淋巴細(xì)胞分離液面上。離心后吸取環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層，以1×106/ml的密度接種于T25培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后換液，以后每3天換液1次。當(dāng)瓶底細(xì)胞生長達(dá)到80%～90%融合時(shí)，按照1∶2進(jìn)行原代細(xì)胞傳代培養(yǎng)，傳至第3代后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)檢測。

1.4實(shí)驗(yàn)分組選用生長狀況良好的第3代細(xì)胞，以1×106/孔的密度接種于96孔板，分為四組，每組5個(gè)復(fù)孔。具體分組：空白對照組：含15%胎牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基。中藥血清組：向DMEM完全培養(yǎng)基中加入5%補(bǔ)腎中藥血清。BMP-2組(聯(lián)合組)：向DMEM完全培養(yǎng)基中加入50 ng/ml BMP-2。中藥血清+BMP-2組：向DMEM完全培養(yǎng)基中加入5%補(bǔ)腎中藥血清和50 ng/ml BMP-2。

1.5MTT比色法檢測增殖活性于誘導(dǎo)后的第1、3、5天，按照MTT試劑盒說明書，每孔加入1×MTT溶液50 μl，放置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，平板搖床振蕩10 min后選取490 nm的波長，以酶標(biāo)儀測定各孔光吸收值(OD值)。

1.6堿性磷酸酶(ALP)活性檢測于誘導(dǎo)后第3、6、9、12天，標(biāo)記3支EP管依次為空白管、標(biāo)準(zhǔn)管和測定管，各管分別加入去離子水、酚標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液和細(xì)胞上清液各50 μl，然后依次加入緩沖液和基質(zhì)液各0.5 ml，37℃水浴后依次加入顯色劑1.5 ml，最后以520 nm、0.5 cm光徑紫光分光儀比色，檢測比較各管的吸光度。

1.7礦化結(jié)節(jié)von Kossa染色于誘導(dǎo)后的第14天，以PBS潤洗細(xì)胞爬片，4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞30 min后用5%硫代硫酸鈉溶液置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育30 min，吸棄上清液，然后用1%硝酸銀溶液紫外線下染色30 min，蒸餾水漂洗后繼續(xù)用5%硫代硫酸鈉染色2 min，然后以1%中性紅復(fù)染10 min，去離子水再次漂洗后鏡下觀察。

1.8Ⅰ型膠原免疫組化染色于誘導(dǎo)后的第12天，按武漢博士德公司免疫組化試劑盒說明書，PBS潤洗細(xì)胞爬片，4%多聚甲醛溶液固定，將細(xì)胞爬片放入3%過氧化氫溶液中10 min，然后再次以PBS潤洗細(xì)胞爬片，依次加入山羊血清工作液、1∶50稀釋的鼠抗人Ⅰ型膠原抗體、生物素化IgG抗體、鏈親和素標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，DAB溶液顯色，蘇木精復(fù)染后鏡下觀察。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，進(jìn)行單因素方差分析，不滿足方差分析條件時(shí)采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1MTT法檢測臍血MSCs的增殖活性與空白對照組比較，聯(lián)合組、BMP-2組在誘導(dǎo)第3、5天時(shí)，細(xì)胞增殖活性明顯提高(P<0.05)；在誘導(dǎo)第5天時(shí)，5%中藥血清+ BMP-2組細(xì)胞增殖活性優(yōu)于BMP-2組(P<0.05)。見表1。

表1　MTT比色法檢測人臍血MSCs增殖情況

與空白對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與BMP-2組比較：3)P<0.05，下表同

2.2ALP活性檢測與空白對照組比較，聯(lián)合組、BMP-2組在誘導(dǎo)第3、6、9、12天均能明顯提高ALP活性(P<0.05)。與BMP-2組比較，聯(lián)合組在誘導(dǎo)第6天時(shí)ALP活性明顯提高(P<0.05)。見表2。

表2　各誘導(dǎo)組不同時(shí)間點(diǎn)ALP活性比較

2.3礦化結(jié)節(jié)染色成骨誘導(dǎo)第14天后，von Kossa染色可見細(xì)胞間散在黑色顆粒，顆粒大小不均一，提示有礦化基質(zhì)沉積，空白對照組細(xì)胞von Kossa染色未見黑色礦化物沉積，其中聯(lián)合組較其他各組明顯。見圖1。

2.4Ⅰ型膠原染色成骨誘導(dǎo)第14天后，細(xì)胞外基質(zhì)Ⅰ型膠原陽性表達(dá)為棕黃色顆粒，與空白對照組相比，BMP-2組、聯(lián)合組Ⅰ型膠原表達(dá)明顯增強(qiáng)。見圖2。

空白對照組

中藥血清組

BMP-2組

聯(lián)合組

空白對照組

中藥血清組

BMP-2組

聯(lián)合組

3討論

BMP-2作為轉(zhuǎn)化生長因子β超家族的成員之一目前已廣泛運(yùn)用于骨組織工程，其主要機(jī)制是促進(jìn)未分化的干細(xì)胞的募集和分化，在骨發(fā)生、誘導(dǎo)、修復(fù)及骨量保持等方面均起著重要的作用〔4〕。實(shí)驗(yàn)研究表明，BMP-2能促進(jìn)骨髓MSCs增殖、分化及定向誘導(dǎo)成骨，但骨髓MSCs易被病毒污染，且隨著年齡增長其增殖、分化能力逐漸下降〔5〕。而人臍血MSCs作為新的種子細(xì)胞，具有良好的自我更新能力及多向分化潛能，有效彌補(bǔ)了骨髓MSCs的缺陷，且具有取材創(chuàng)傷小、免疫活性低等優(yōu)點(diǎn)，目前正成為研究新熱點(diǎn)〔6〕。但由于人臍血中MSCs含量較低，BMP-2等作為誘導(dǎo)因子不僅來源有限、費(fèi)用昂貴，而且其增殖及定向骨化存在一定困難。因此，探討一種新穎、復(fù)合誘導(dǎo)因子有著重要的臨床價(jià)值。

中醫(yī)認(rèn)為：“腎藏精，主骨生髓”。腎精、腎氣充足則骨髓化生有源，滋養(yǎng)骨骼，骨骼強(qiáng)健有力；腎精、腎氣虧虛則骨髓生化無源，骨骼失養(yǎng)，痿弱無力。由此可見，腎精、腎氣的盛衰與骨骼生理、病理有著密切的聯(lián)系，補(bǔ)腎法可促進(jìn)骨骼生長、發(fā)育。前期我們相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，與中、高濃度補(bǔ)腎中藥血清比較，低濃度中藥血清聯(lián)合BMP-2作用于人臍血MSCs鈣離子濃度、骨鈣素(BGP)含量更為顯著〔7〕。故本實(shí)驗(yàn)選取骨碎補(bǔ)、狗脊、女貞子、淫羊藿等14味補(bǔ)腎中藥，制備低濃度補(bǔ)腎中藥大鼠血清，聯(lián)合BMP-2，以MTT比色法檢測臍血MSCs增殖活性，觀察ALP活性、礦化結(jié)節(jié)Von Kossa染色及Ⅰ型膠原免疫組織化學(xué)染色。

MTT比色法〔8〕目前常用于細(xì)胞增殖活性的定量檢測，由于活細(xì)胞線粒體中的呼吸鏈存在促進(jìn)MTT還原的琥珀酸脫氫酶，其生成產(chǎn)物藍(lán)色甲臜結(jié)晶能在細(xì)胞內(nèi)被DMSO所溶解，通過酶標(biāo)儀測定OD值的大小來反映細(xì)胞增殖情況。ALP主要參與無機(jī)磷酸鈣的合成，是反映成骨細(xì)胞活性的重要指標(biāo)，而礦化結(jié)節(jié)和Ⅰ型膠原的形成目前被認(rèn)為是成骨細(xì)胞的特有表現(xiàn)，是骨細(xì)胞增殖分化和成骨活性的重要標(biāo)志〔9〕。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)補(bǔ)腎中藥聯(lián)合BMP-2對人臍血MSCs的綜合生物學(xué)作用，且補(bǔ)腎中藥不能單獨(dú)作為誘導(dǎo)因子促進(jìn)干細(xì)胞增殖、成骨分化，但聯(lián)合BMP-2后有明顯增效促進(jìn)作用。

本實(shí)驗(yàn)補(bǔ)腎中藥具有補(bǔ)腎益髓、強(qiáng)筋健骨功效，其聯(lián)合BMP-2促進(jìn)人臍血MSCs增殖及成骨分化，其作用機(jī)制可能主要通過調(diào)成骨細(xì)胞中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達(dá)，激活MAPK家族中的p38蛋白及Smads、BMPs信號(hào)通路，刺激成骨細(xì)胞的不斷增殖和礦化結(jié)節(jié)和Ⅰ型膠原的表達(dá)，最終促進(jìn)成骨細(xì)胞的成骨分化〔10～12〕。

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〔2014-08-17修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

通訊作者：馬勇(1963-)，男，博士，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事創(chuàng)傷骨科研究。

基金項(xiàng)目：江蘇省中醫(yī)藥領(lǐng)軍人才培養(yǎng)對象資助項(xiàng)目(LJ200924)

中圖分類號(hào)〔〕R3〔

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

文章編號(hào)〕1005-9202(2016)01-0030-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.01.013