牛骨咸味肽氨基酸分析及在模擬加工條件下功能穩定性分析

李迎楠+劉文營+張順亮+喬曉玲+陳文華+曲超+成曉瑜

摘 要：以牛骨為原料酶解制備咸味肽，牛骨咸味肽中重金屬含量均處于國家標準的安全范圍之內，其氨基酸含量為56.25 mg/100 mg，其中甘氨酸含量最高。以咸味質量濃度值為指標，考察不同處理條件對咸味肽穩定性的影響，結果表明：咸味肽加熱溫度在50 ℃以下、加熱時間在20 min以內穩定性較好，添加可食用糖對咸味肽穩定性影響不明顯，添加有機酸則會降低咸味肽的穩定性。

關鍵詞：牛骨;咸味肽;重金屬;氨基酸;穩定性

Amino Acid Composition and Stability Analysis of Salty Peptides Derived from Bovine Bone under

Simulated Processing Conditions

LI Yingnan， liu Wenying， ZHANG Shunliang， QIAO Xiaoling， cHEN Wenhua， qu Chao， CHENG Xiaoyu*

（China Meat Processing and Engineering Center， China Meat Research Center， Beijing 100068， China）

Abstract： Salty peptides containing heavy metals within the safe range according to the Chinese National Standards and 56.25 mg/100 mg amino acids with glycine being the most abundant amino acid were prepared by the enzymatic hydrolysis of bovine bone. The effects of heating conditions and the addition of individual sugars or organic acids on the stability of salty peptides were assessed by determining changes in sensory evaluation of ?salty taste using NaCl as the reference. The peptides remained stable when exposed to a temperature below 50 ℃ for less than 20 min. The stability was not significantly affected by the addition of sugar but reduced by the addition of organic acid.

Key words： bovine bone; salty peptides; heavy metal; amino acid; stability

中圖分類號：TS251.94 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2016）01-0011-04

DOI：10.15922/j.cnki.rlyj.2016.01.003

引文格式：

李迎楠， 劉文營， 張順亮， 等. 牛骨咸味肽氨基酸分析及在模擬加工條件下功能穩定性分析[J]. 肉類研究， 2016， 30（1）： 11-14. DOI：10.15922/j.cnki.rlyj.2016.01.003. ? ?http：//rlyj.cbpt.cnki.net

LI Yingnan， LIU Wenying， ZHANG Shunliang， et al. Amino acid composition and stability analysis of salty peptides derived from bovine bone under simulated processing conditions[J]. Meat Research， 2016， 30（1）： 11-14. （in Chinese with English abstract） DOI：10.15922/j.cnki.rlyj.2016.01.003. ? ?http：//rlyj.cbpt.cnki.net

隨著生活水平的提高，人們對低鹽飲食愈加重視，高血壓、心臟病等諸多疾病均與過多攝入食鹽有關[1-2]。這使得能夠降低鈉離子攝入量同時保證食物咸度的食鹽替代物的開發具有一定的必要性[3]，咸味肽作為呈咸味的多肽，能夠在一定程度上替代食鹽用于食物烹調中，且可以較好地被人體吸收利用，其開發與應用前景廣闊。

咸味肽最早是Tada等[4]偶然發現的，研究表明Orn-β-Ala

HCl和Orn-Tau HCl具有與NaCl相同的咸味強度;Seki等[5]在此基礎上研究發現多肽呈咸味的特性與其溶液pH值有很大關系;Zhu Xiaolin等[6]在對無鹽醬油研究過程中發現3 種具有咸味的二肽;彭增起等[7]從大豆蛋白中分離純化得到咸味肽，經分析得到咸味多肽的氨基酸序列為Gly-Lys;張順亮等[8]對分離制備的咸味肽分析顯示，該咸味肽分子質量為849.38 D。目前，針對咸味肽的研究多集中于咸味肽的合成、提取及結構分析等，對咸味肽在應用方面的研究，尤其是針對咸味肽在加工應用過程中穩定性的研究具有重要意義。

本研究利用食品級生物酶試劑對牛骨進行酶解制備咸味肽，對牛骨咸味肽中重金屬含量及氨基酸成分進行了測定分析，考察加熱溫度、加熱時間及添加不同種類的可食性糖、酸對牛骨咸味肽穩定性的影響，為咸味肽開發利用提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛骨購于北京市豐臺區牛街清真市場。

復合動物蛋白酶（食品級，酶活力8.9×104 U/g）、風味蛋白酶（食品級，酶活力4.2×104 U/g） 諾維信（中國）投資有限公司;檸檬酸、醋酸、蘋果酸、乳酸、琥珀酸、乳糖、麥芽糖、果糖等均為食品級。

1.2 儀器與設備

數顯恒溫水浴鍋 北京中興偉業有限公司;CL-25型蠕動泵中空纖維超濾膜組件 北京旭邦膜設備有限責任公司;L-8900氨基酸自動分析儀 日本日立集團。

1.3 方法

1.3.1 牛骨咸味肽制備

參考文獻[8]方法，取新鮮牛骨，去肉破碎后加熱至110 ℃，并保溫15 min;除去油脂后取下層骨渣進行酶解，酶解溫度為60 ℃，料液比為1∶1（m/V），添加復合動物蛋白酶15 mg/g，酶解2 h;添加風味蛋白酶10 mg/g，

酶解4 h后終止反應;將酶解液真空抽濾，用截留分子質量為10 kD的超濾膜過濾，凍干后即為牛骨咸味肽。

1.3.2 牛骨咸味肽重金屬含量分析

參考國家標準方法測定產物中鉛[9]、汞[10]、鎘[11]、鉻[12]和總砷含量[13]。

1.3.3 牛骨咸味肽氨基酸成分分析

準確稱取咸味肽100 mg，依次加入15 mL鹽酸（6.0 mol/L）、1 mL巰基乙酸（體積分數1%），真空條件下置于110 ℃反應22 h，將水解液過濾并定容至50 mL。準確吸取濾液1 mL，置于燒杯中真空蒸干，用1 mL鹽酸（0.02 mol/L）溶解殘留物，過濾后上機分析[14]。

氨基酸自動分析儀測試條件為：磺酸型陽離子樹脂離子交換柱（4.6 mm×60 mm，3 μm）;反應溫度：135 ℃;柱溫：57 ℃;茚三酮反應液流速：0.35 mL/min;

分離緩沖液流速：0.40 mL/min;進樣量：20 μL;波長：570、440 nm;分析時間：30 min。

1.3.4 感官評價

由15 人組成感官評定小組，訓練時以質量濃度為0、1、2、3、4、5 mg/mL的NaCl溶液為參照物，訓練完畢后評定咸味肽溶液，并作出咸度判斷[15]，以咸味肽溶液所對應的NaCl溶液質量濃度作為咸味質量濃度值。為減小心理因素對測試結果的影響，實驗中采用盲評方式。

1.4 不同處理條件對牛骨咸味肽穩定性的影響

1.4.1 加熱溫度對牛骨咸味肽穩定性的影響

分別取20 mL咸味肽溶液（10 mg/mL）于燒杯中，分別于40、50、60、70、80 ℃條件下水浴加熱15 min，然后冰水浴迅速冷卻，室溫下對溶液進行感官評價。

1.4.2 加熱時間對咸味肽穩定性的影響

分別取20 mL咸味肽溶液（10 mg/mL）于燒杯中，于40 ℃水浴分別加熱10、15、20、25、30 min，然后冰水浴迅速冷卻，室溫下對溶液進行感官評價。

1.4.3 添加可食性糖對咸味肽穩定性的影響

分別取20 mL咸味肽溶液（10 mg/mL）于燒杯中，分別添加質量濃度為2 mg/mL的乳糖、麥芽糖、果糖、葡萄糖和蔗糖，充分振蕩混勻后，室溫下對溶液進行感官評價。

1.4.4 添加有機酸對咸味肽穩定性的影響

分別取20 mL咸味肽溶液（10 mg/mL）于燒杯中，分別添加質量濃度為2 mg/mL的蘋果酸、乳酸、琥珀酸、醋酸和檸檬酸，充分振蕩混勻后，室溫下對溶液進行感官評價。

2 結果與分析

2.1 牛骨咸味肽成分分析

2.1.1 咸味肽重金屬含量分析

表 1 咸味肽中重金屬含量

Table 1 Heavy metal contents of salty peptides

mg/kg

金屬 鉛 總砷 汞 鉻 鎘

咸味肽 0.044 <0.01 <0.001 <0.000 2 0.016

由表1可知，咸味肽中所檢測的重金屬含量均低于國家標準中污染物含量的限量[16]，其含量依次為：鉛>鎘>

總砷>汞>鉻。咸味肽中的重金屬可能來自于牛飼料中的殘留，也可能是骨本身對重金屬的蓄積作用[17-18]。

2.1.2 咸味肽氨基酸成分含量測定結果

氨基酸與生物的生命活動關系非常密切，氨基酸在合成大腦蛋白及神經遞質方面起著重要作用，衡量多肽風味的一個重要指標是產品中氨基酸的含量[19]。

多肽的呈味特性與其氨基酸組成有很大關系，對食品的風味有一定的影響。由表2可知，咸味肽含有較豐富的氨基酸種類，其氨基酸總量為56.25 mg/100 mg，其中甘氨酸含量最高，其次是谷氨酸、脯氨酸、丙氨酸;未檢出胱氨酸和色氨酸。從現代醫學角度來看，部分氨基酸在抑菌消炎、促進脂肪代謝、增強人體免疫功能、延緩機體疲勞、促進人體發育和提高中樞神經組織功能等方面具有一定作用[20-23]。

表 2 咸味肽中氨基酸含量測定結果

Table 2 Amino acid contents of salty peptides

mg/100 mg

氨基酸 含量 氨基酸 含量

天冬氨酸（Asp） 3.39 亮氨酸（Leu*） 2.80

蘇氨酸（Thr*） 1.43 酪氨酸（Tyr） 1.20

絲氨酸（Ser） 1.78 苯丙氨酸（Phe*） 1.73

谷氨酸（Glu） 5.98 組氨酸（His） 0.68

甘氨酸（Gly） 10.44 精氨酸（Arg） 3.99

丙氨酸（Ala） 5.22 脯氨酸（Pro） 5.87

胱氨酸（Cys） 0.00 賴氨酸（Lys*） 2.43

纈氨酸（Val*） 1.96 色氨酸（Trp） 0.00

蛋氨酸（Met*） 0.51 羥脯氨酸（Hyp） 5.14

異亮氨酸（Ile*） 1.28 其他氨基酸 0.42

氨基酸總量 56.25

注：*.必需氨基酸。

2.2 不同處理條件對牛骨咸味肽穩定性的影響

2.2.1 加熱溫度對牛骨咸味肽穩定性的影響

圖 1 加熱溫度對牛骨咸味肽穩定性的影響

Fig.1 Effect of temperature on the stability of salty peptides

咸味肽中主要的呈味物質為氨基酸，其咸味與其氨基酸的解離程度以及是否有對應陰陽離子有關[24]。由

圖1可知，高溫加熱可能會改變氨基酸的解離程度，使咸味肽的咸味質量濃度降低，咸味質量濃度在加熱溫度大于50 ℃條件下降較為明顯。當加熱溫度小于50 ℃時，咸味肽的咸味質量濃度略高于未處理時對照組，因此，咸味肽加熱溫度在50 ℃以下較為適宜，此時咸味肽的穩定性較好。

2.2.2 加熱時間對牛骨咸味肽穩定性的影響

圖 2 加熱時間對牛骨咸味肽穩定性的影響

Fig.2 Effect of heating time on the stability of salty peptides

由圖2可知，經一定時間的加熱，咸味肽的咸味質量濃度略高于對照組。多肽的活性與其氨基酸組成及空間構型有關[25]，隨著反應時間的延長，多肽的空間構型可能受到一定程度的破壞，咸味肽的咸味質量濃度會受到不同程度的影響。因此，咸味肽加熱時間應控制在20 min左右，此時咸味肽的穩定性較好。

2.2.3 添加可食性糖對牛骨咸味肽穩定性的影響

圖 3 添加可食性糖對牛骨咸味肽穩定性的影響

Fig.3 Effect of sugar addition on the stability of salty peptides

由圖3可知，加入可食性糖后，咸味肽的咸味質量濃度變化不明顯，可能是由于可食性糖的加入，在一定程度上提升了咸味肽的咸味口感，其中乳糖、果糖咸味質量濃度值相對較高。因此，添加可食用糖對咸味肽的咸度質量濃度影響較弱，可以根據需要選擇添加合適的可食用糖。

2.2.4 添加有機酸對牛骨咸味肽穩定性的影響

圖 4 添加有機酸對牛骨咸味肽穩定性的影響

Fig.4 Effect of organic acid addition on the stability of salty peptides

由圖4可知，加入可食性有機酸后，咸味肽的咸味質量濃度較對照組有大幅度的下降（P<0.05）。有機酸的刺激性酸味在某種程度上會掩蓋咸味，使得到的咸味肽咸味質量濃度下降。在所有的有機酸中，乳酸和醋酸的影響程度相對較小，蘋果酸影響最為明顯。因此，可以根據有機酸對咸味肽穩定性的影響選擇合適的有機酸種類。

3 結 論

牛骨咸味肽的氨基酸種類比較齊全，總量高達56.25 mg/100 mg，其中甘氨酸的含量最高。通過考察不同處理條件對咸味肽穩定性的影響，發現各處理條件對咸味肽的咸味質量濃度值均有不同程度的影響。

咸味肽加熱溫度不高于50 ℃、加熱時間不長于20 min較為適宜，添加可食用糖對咸味肽穩定性影響不明顯，可以根據需要適量添加，但添加有機酸則會使得咸味肽的穩定性降低。在咸味肽加工過程中，控制加工條件是維持咸味肽穩定的重要措施，有關多因素對咸味肽的影響及其機理仍需要更深入地研究。

參考文獻：

[1] KIRSTEN B， GLENN M C， PAMELA G C， et al. Projected effect of dietary salt reductions on future cardiovascular disease[J]. The New England Journal of Medicine， 2010， 362（7）： 590-599. DOI：10.1056/NEJMoa0907355.

[2] 張燕， 張新軍， 張俊琦， 等. 老年高血壓病糖代謝異常及合并心血管病危險分析[J]. 四川大學學報（醫學版）， 2010， 41（2）： 307-311.

[3] 張雅瑋， 郭秀云， 彭增起. 食鹽替代物研究進展[J]. 肉類研究， 2011， 25（2）： 36-38.

[4] TADA M， SHINODA I， OKAI H， et al. L-ornithyltaurine， a new salty peptide[J]. Journal Agricultural Food Chemistry， 1984， 32（5）： 992-996. DOI：10.1021/jf00125a009.

[5] SEKI T， KAWASAKI Y， TAMURAM， et al. Furher study on the salty peptide ornithyl-β-alanine. Some effect on saltiness in a food material[J]. Journal Agricultural Food Chemistry， 1996， 44（9）： 2481-2485.

[6] ZHU Xiaolin， WATANABE K， SHIRAISHI K， et al. Identification of ACE-inhibitory peptides in salt-free soy sauce that are transportable across caco-2 cell monolayers[J]. Peptides， 2008， 29（3）： 338-344.

[7] 南京農業大學. 一種多肽食鹽替代物及其制備方法： 中國， 201110131195.1[P]. 2011-05-11.

[8] 張順亮， 成曉瑜， 喬曉玲， 等. 牛骨酶解產物中咸味肽組分的分離純化及成分研究[J]. 食品科學， 2012， 33（6）： 29-32.

[9] 國家質量監督檢驗檢疫總局. GB 5009.12—2010 食品中鉛的測定[S]. 北京： 中國標準出版社， 2010.

[10] 國家質量監督檢驗檢疫總局. GB/T 5009.17—2003 食品中總汞及有機汞的測定[S]. 北京： 中國標準出版社， 2003.

[11] 國家質量監督檢驗檢疫總局. GB/T 5009.15—2003 食品中鎘的測定[S]. 北京： 中國標準出版社， 2003.

[12] 國家質量監督檢驗檢疫總局. GB/T 5009.123—2003 食品中鉻的測定[S]. 北京： 中國標準出版社， 2003.

[13] 國家質量監督檢驗檢疫總局. GB/T 5009.11—2003 食品中總砷及無機砷的測定[S]. 北京： 中國標準出版社， 2003.

[14] 陳穎， 汪樹理， 陳德鋒. 草蓯蓉中氨基酸和營養元素含量的測定[J]. 氨基酸和生物資源， 2008， 30（2）： 74-76.

[15] 周家春. 食品感官分析[M]. 北京： 中國輕工業出版社， 2013.

[16] 國家質量監督檢驗檢疫總局. GB 2762—2012 食品安全國家標準食品中污染物限量[S]. 北京： 中國標準出版社， 2012.

[17] LI Xiangdong， LEE S L， WONG S C. The study of metal contamination in urban soils of Hong Kong using a GIS-based approach[J]. Environmental Pollution， 2004， 129（1）： 113-124. DOI：10.1016/j.envpol.2003.09.030.

[18] 胡文勇， 周波， 馬陶武. 泥鰍中重金屬含量的測定及其食用安全評價[J]. 上海環境科學， 2010， 29（3）： 107-110.

[19] 馬國紅， 張延華， 宋理平. 鱸魚骨營養價值的分析與評價[J]. 大連海洋大學學報， 2014， 29（6）： 646-649.

[20] 周瓊， 陸大祥， 付詠梅， 等. 甘氨酸對小鼠心肌缺血性損傷的防治作用研究[J]. 中國病理生理雜志， 2002， 18（4）： 360-362.

[21] 李愛玲. 氨基酸對心血管功能的影響[J]. 氨基酸和生物資源， 1998， 20（2）： 45-49.

[22] 湯國進. 色氨酸. 亮氨酸對小白鼠運動能力的影響[J]. 科技信息， 2008（6）： 256-257.

[23] NESTER W E. The metabolic roles pharmacology and toxicology of lysine[J]. Journal American College Nutrition， 1997， 16（1）： 7-21.

[24] IWATSUKI K， NOMURA M， SHIBATA A， et al. Generation and characterization of T1R2-LacZ knock-in mouse[J]. Biochemical and Biophyscal research Communications， 2010， 402（3）： 495-499. DOI：10.1016/j.bbrc.2010.10.057.

[25] CHEN H M， MURAMOTO K， YAMAUCHI F. Structural analysis of antioxidative peptides from soybean β-conglycinin[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 1995， 43（3）： 574-578.