FAM46A、EBF1基因多態性與河南漢族肺結核相關性分析

王騎鳳，肖　海，楊洪毅，雷冬梅

1)鄭州大學基礎醫學院細胞生物學與醫學遺傳學教研室 鄭州 450001　2)河南省人民醫院醫學遺傳研究所 鄭州 450003

3)鄭州大學第一附屬醫院生殖醫學中心 鄭州 450052　4)鄭州大學第三附屬醫院病理科 鄭州 450052

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FAM46A、EBF1基因多態性與河南漢族肺結核相關性分析

王騎鳳1)，肖海2)，楊洪毅3)，雷冬梅4)#

1)鄭州大學基礎醫學院細胞生物學與醫學遺傳學教研室 鄭州 4500012)河南省人民醫院醫學遺傳研究所 鄭州 450003

3)鄭州大學第一附屬醫院生殖醫學中心 鄭州 4500524)鄭州大學第三附屬醫院病理科 鄭州 450052

關鍵詞肺結核；FAM46A基因；EBF1基因；多態性；河南漢族

摘要目的：探討FAM46A基因VNTR位點和EBF1基因rs10515787位點多態性與河南漢族人群肺結核易感性的關系。方法：抽取河南漢族200例肺結核患者和200名健康人的外周血，采用短串聯重復PCR擴增結合毛細管電泳方法檢測FAM46A基因VNTR位點多態性，PCR-RFLP方法檢測EBF1基因rs10515787位點多態性。結果：在河南漢族人群中發現FAM46A基因VNTR位點存在4種等位基因、9種基因型。EBF1基因rs10515787位點存在2種等位基因、3種基因型。2組比較，VNTR位點2、3等位基因頻率差異有統計學意義(P均<0.001)，2/2、2/3基因型頻率差異有統計學意義(P均<0.05);rs10515787位點等位基因頻率差異有統計學意義(P=0.001)，AA基因型頻率差異有統計學意義(P=0.004)。結論：FAM46A基因VNTR位點和EBF1基因rs10515787位點多態性與河南漢族肺結核的易感性有關。

AbstractAim: To explore the associations between VNTR loci in the FAM46A gene and rs10515787 loci in the EBF1 gene and susceptibility of pulmonary tuberculosis in Henan Han population.Methods: The methods of STR-PCR-CE was used to detect the polymorphism of VNTR loci in the FAM46A gene, and PCR-RFLP to detect polymorphism of rs10515787 loci in the EBF1 gene in 200 cases of pulmonary tuberculosis and 200 cases of healthy people of Henan Han population.Results: Four kinds of alleles and nine kinds of genotypes of VNTR loci in the FAM46A gene were detected. Comparison between pulmonary tuberculosis group and control group respectively，the differences of allele 2 and 3 of VNTR were significant(P<0.001),the differences of 2/2 and 2/3 genotypes were significant(P<0.05),the difference of alleles in rs10515787 was significant(P=0.001), and the difference of AA genotype was significant(P=0.004).Conclusion: The VNTR loci in FAM46A gene and rs10515787 loci in EBF1 gene polymorphisms are associated with the susceptibility of pulmonary tuberculosis in Henan Han population.

蛋白序列相似度為46的類細胞因子A(family with sequence similarity 46, member A,FAM46A)基因位于6q14.1，其第2外顯子處存在一個VNTR序列[1]，VNTR序列變異可能引起多種疾病[1-2]。研究[1]發現，該位點多態性與肺結核的易感性相關，并可能通過調控基因轉錄導致人類多種疾病[3-4]。早期B細胞因子1(early B cell factor 1，EBF1)是B細胞發育必要的轉錄因子，據報道[5]，EBF1基因的rs10515787位點多態性與印第安人肺結核易感性相關。作者分析了FAM46A基因的VNTR位點、EBF1基因的rs10515787位點多態性與河南漢族人群肺結核易感性的相關性，為探討肺結核的發病機制，制定有效的預防、診斷和治療方法提供理論依據。

1對象與方法

1.1研究對象病例組：選擇200例初診肺結核患者，年齡20～56(38.9±17.6)歲，其中男146例，女54例，肺結核的診斷參考2008年我國衛生部制定的WS 288-2008診斷標準；排除其他免疫性疾病、感染性疾病(如糖尿病、HIV感染等)患者以及使用免疫抑制劑的患者。對照組：選取200名同期體檢的健康個體，年齡20～52(36.0±15.7)歲，其中男178例，女22例；排除標準同病例組。

所有病例組和對照組的研究對象均來自2012年至2013年河南省安陽和新鄉傳染病醫院，研究對象之間無血緣關系，均為漢族。所有研究對象對該研究均知情同意。

1.2PCR擴增與電泳抽取研究對象2 mL外周血，酚-氯仿法提取基因組DNA。引物序列根據GenBank用Primer Premier 5.0設計(表1)。

表1　VNTR、 rs10515787

VNTR位點的PCR反應體系為26 μL：DNA 1 μL，上、下游引物各1 μL，dNTP 0.5 μL，Taq Buffer 2.5 μL，25 mmol/L的MgCl2 2 μL，5 U/μL 的Taq 酶0.2 μL，去離子水17.8 μL。rs10515787位點的PCR 反應體系為20 μL：2×Taq PCR Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，模板DNA 1 μL，去離子水7 μL。PCR反應條件見表2。PCR產物毛細管電泳由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。兩位點均取擴增產物10 μL，加入10×Buffer 2 μL、TasⅠ內切酶1 μL、去離子水18 μL，65 ℃水浴鍋中酶切1 h，20 g/L瓊脂糖凝膠電泳1 h，紫外凝膠成像分析儀下觀察并記錄電泳結果。以上兩位點電泳結果均經測序進行驗證。

表2　兩位點PCR反應條件

1.3基因型判定內側引物擴增VNTR位點產物經電泳后得到4種片段，分別為171、156、141、126 bp，與GenBank比對，根據其熒光值，171 bp片段為4次重復(即等位基因4)，156 bp片段為3次重復(即等位基因3)，141 bp片段為2次重復(即等位基因2)，126 bp片段為1次重復(即等位基因1)。

EBF1基因rs10515787位點擴增產物大小為290 bp，該片段除多態性位點外，還有一個非多態性酶切位點，用限制性內切酶TasⅠ酶切后得到3種片段：AA基因型，189、69、32 bp；GG基因型，221、69 bp；AG基因型，221、189、69、32 bp。

1.4統計學處理采用HWE 1.20檢測對照組是否符合Hardy-Weinberg平衡。采用SPSS 17.0進行統計學處理,采用χ2檢驗或精確概率法比較2組間等位基因頻率和基因型頻率的差異，并計算OR及95%CI[6]來評估所檢測的基因多態性與肺結核的相關性，檢驗水準α=0.05。

2結果

2.1FAM46A基因VNTR位點多態性的檢測結果在所有研究對象中，檢測到FAM46A基因VNTR位點的4種等位基因(1、2、3、4)，9種基因型(1/1、1/2、2/2、1/3、2/3、3/3、2/4、3/4、4/4)，對照組基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡(χ2=0.953，P=0.428)。每種基因型的測序結果與電泳結果一致。VNTR位點等位基因和基因型頻率在2組間的分布見表3。

2.2EBF1基因rs10515787位點多態性的檢測結果EBF1基因rs10515787位點經酶切、電泳后，檢測到2種等位基因G、A，3種基因型GG、GA、AA(圖1)，對照組基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡(χ2=0.724,P=0.394)。每種基因型的測序結果與電泳結果一致。rs10515787位點等位基因和基因型頻率在2組間的分布見表4，不同遺傳模式下該位點在2組間的基因型分布見表5。

表3　FAM46A基因VNTR位點

*：精確概率法。

1～3：分別為GA、GG和AA基因型；4：空白對照；M：Marker。圖1　EBF1基因rs10515787各基因型電泳圖

表4　EBF1基因rs10515787位點

表5　3種遺傳模式下rs10515787

3討論

肺結核是一種人畜共患的慢性傳染病，嚴重損害肺組織的結構和功能[7-9]。該病的發病機制非常復雜，除了受病原體毒力和環境因素的影響外，其發生還與宿主遺傳因素有關[10]。

FAM46A基因位于6q14.1，全長約6 982 bp，包含3個外顯子。FAM46A基因編碼的序列是一個突變體，全長約5 609 bp，編碼442個氨基酸，VNTR位點位于FAM46A基因編碼區的第2外顯子處。該研究在所有研究對象中均檢測到VNTR位點的4種等位基因及9種基因型，發現病例組2等位基因、2/2基因型頻率高于對照組，表明2等位基因、2/2基因型可能會增加肺結核的發病風險，是一種肺結核發生的風險因子；對照組3等位基因、2/3基因型頻率高于病例組，表明3等位基因、2/3基因型可能會降低肺結核的發病風險，是肺結核發生的保護因子；2組間3/3基因型頻率比較，差異無統計學意義，還有待于進一步的研究。該研究結果與以往的研究[1，11]結果不一致。Etokebe等[1]在克羅地亞人群的257例肺結核患者和450名健康人中，共檢測出了6種等位基因和19種基因型，其中3/3基因型可能是肺結核發生的遺傳危險因子。Cui等[11]在浙江杭州122例結直腸癌患者和266名健康人FAM46A基因VNTR位點中檢測出了3種等位基因和6種基因型。以上結果表明，FAM46A基因VNTR位點表現出明顯的地域和種族差異，提示該位點對肺結核易感性的影響亦可能具有種族和地域性差異，因此對肺結核的預防和治療方案應針對具體的人群來制定。

EBF1基因在B細胞分化成熟中發揮著重要作用。rs10515787位點位于EBF1基因的內含子區域，參與多種調控作用。該研究結果顯示，EBF1基因rs10515787位點多態性與肺結核的易感性有關，且AA基因型及A等位基因可能是河南漢族肺結核發生的危險因子，該結果與以往研究[5]結果一致。該研究結果提示，EBF1基因可能是肺結核易感性的候選基因，其調控機制以及地域和種族差異有待進一步研究。

參考文獻

[1]ETOKEBE GE,BULAT-KARDUM L,MUNTHE LA,et al.Association of variable number of tandem repeats in the coding region of the FAM46A gene, FAM46A rs11040 SNP and BAG6 rs3117582 SNP with susceptibility to tuberculosis[J].PLoS One,2014,9(3):e91385

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[10]肖海,楊洪毅,張照婧,等.河南漢族肺結核患者PTPN22基因多態性檢測[J].鄭州大學學報(醫學版),2013,48(2):207

[11]CUI J,WANG W,LAI MD,et al.Identification of a novel VNTR polymorphism in C6orf37 and its association with colorectal cancer risk in Chinese population[J].Clin Chim Acta,2006,368(1/2):155

*國家自然科學基金資助項目81160157

Analysis of associations between FAM46A and EBF1 gene polymorphisms and pulmonary tuberculosis in Henan Han population

WANGQifeng1),XIAOHai2),YANGHongyi3),LEIDongmei4)

1)DepartmentofCellBiologyandMedicalGenetics,CollegeofBasicMedicalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500012)MedicalGeneticsInstitute,HenanProvincialPeople′sHospital,Zhengzhou4500033)ReproductiveMedicalCenter,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

4)DepartmentofPathology,theThirdAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

Key wordspulmonary tuberculosis;FAM46A gene;EBF1 gene;polymorphism;Henan Han population

中圖分類號R394

通信作者#，女，1972年2月生，碩士，副教授，研究方向：遺傳病理學，E-mail:leidongmei26@163.com

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.01.014 10.13705/j.issn.1671-6825.2016.01.015