犬瘟熱分子生物學(xué)診斷技術(shù)研究進(jìn)展

左　楠

(哈爾濱市動(dòng)物衛(wèi)生防疫站，哈爾濱 150016)

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犬瘟熱分子生物學(xué)診斷技術(shù)研究進(jìn)展

左楠

(哈爾濱市動(dòng)物衛(wèi)生防疫站，哈爾濱 150016)

摘要：犬瘟熱是目前危害犬、毛皮動(dòng)物和野生動(dòng)物最嚴(yán)重的傳染病之一。其臨床癥狀復(fù)雜，大多存在混合感染，確診尤其是早期診斷較為困難。早期診斷對(duì)于犬瘟熱的綜合防控和患病動(dòng)物的救治具有重要的作用，近年來(lái)分子生物學(xué)診斷技術(shù)的不斷發(fā)展，對(duì)犬瘟熱的診斷具有重要意義。現(xiàn)對(duì)犬瘟熱的分子生物學(xué)診斷方法等作一綜述。

關(guān)鍵詞：犬瘟熱；早期診斷；分子生物學(xué)

犬瘟熱是由犬瘟熱病毒(CDV)引起的犬科、鼬科和浣熊科等多種肉食性動(dòng)物的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病。犬瘟熱最早發(fā)現(xiàn)于18世紀(jì)后葉，1905年有人發(fā)現(xiàn)其病原為一種病毒。我國(guó)于1980年從患病犬體內(nèi)分離到此病毒[1]。犬瘟熱的臨床表現(xiàn)多樣，特征性的示病癥狀很少出現(xiàn)，大多存在混合感染，因此準(zhǔn)確、快速、特異性強(qiáng)的早期診斷方法在獸醫(yī)臨床中越來(lái)越重要。

1病原與癥狀

CDV屬于副黏病毒科麻疹病毒屬，為有囊膜的單股、負(fù)鏈RNA病毒，病毒粒子呈多形性，直徑一般在100～300nm之間。其抵抗力不強(qiáng)，對(duì)熱、干燥、紫外線和有機(jī)溶劑敏感[2]。

犬瘟熱的臨床癥狀依所處環(huán)境、感染毒株、感染動(dòng)物年齡和免疫狀態(tài)的不同而呈現(xiàn)多樣性。病犬主要表現(xiàn)為雙相熱，呼吸道癥狀如呼吸道卡他性炎癥，神經(jīng)癥狀如肌肉痙攣和癲癇等，消化道癥狀如腹瀉、嘔吐和脫水等。病程一般為2周或稍長(zhǎng)，發(fā)生卡他性肺炎和腸炎時(shí)病程可能較長(zhǎng)，出現(xiàn)神經(jīng)癥狀的病程最長(zhǎng)。

2常規(guī)檢測(cè)與診斷

依據(jù)臨床癥狀和流行病學(xué)特點(diǎn)，可作出初步診斷，但犬瘟熱病毒常與其他病毒混合感染，或引起細(xì)菌的繼發(fā)感染，因此犬瘟熱的臨床癥狀表現(xiàn)復(fù)雜，只有將臨床癥狀與實(shí)驗(yàn)室診斷相結(jié)合才能進(jìn)行確診。常見(jiàn)的實(shí)驗(yàn)室診斷方法有CDV的分離培養(yǎng)及鑒定、電子顯微鏡直觀觀察診斷和血清學(xué)檢測(cè)與診斷等。其中血清學(xué)診斷在犬瘟熱的實(shí)驗(yàn)室診斷中是較為可靠的診斷方法。相繼建立起了補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)、微量血清中和實(shí)驗(yàn)、免疫熒光試驗(yàn)等檢測(cè)和診斷方法，其中免疫熒光技術(shù)是目前國(guó)際通用的犬瘟熱診斷方法[3]。

3分子生物學(xué)檢測(cè)與診斷

犬瘟熱的確診較為困難，尤其是早期診斷。但是隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，國(guó)內(nèi)外先后建立了犬瘟熱的核酸雜交等溫?cái)U(kuò)增等分子生物學(xué)診斷技術(shù)，其方法比免疫學(xué)方法的敏感性和特異性更高，尤其在CDV的感染早期，尚未產(chǎn)生免疫應(yīng)答的情況下分子生物學(xué)方法能夠作出早期診斷。

3.1核酸雜交

核酸雜交是一種分子生物學(xué)的檢測(cè)技術(shù)，用放射性或非放射性物質(zhì)標(biāo)記的已知序列的單鏈DNA或RNA片段(探針)，檢測(cè)樣品中的DNA或RNA分子的特定序列(靶序列)，經(jīng)放射自顯影或顯色反應(yīng)將與探針特異性結(jié)合的靶序列顯示出來(lái)，其敏感性高、特異性強(qiáng)。在應(yīng)用核酸雜交技術(shù)對(duì)犬瘟熱進(jìn)行診斷方面，國(guó)內(nèi)報(bào)道較少，國(guó)外研究較多。Appel[4]用DNA探針和單股RNA探針檢測(cè)了CDV基因組和mRNA，獲得了很高的靈敏度和特異性。Zurbriggen等[5]用地高辛標(biāo)記犬瘟熱病毒NP基因互補(bǔ)的RNA作為探針，可檢測(cè)到單個(gè)細(xì)胞中存在的犬瘟熱核苷酸序列。王宏俊等[6]在CDV基因序列中編碼核衣殼蛋白的保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)合成一對(duì)特異性引物，通過(guò)RT-PCR從CDV基因中擴(kuò)增出一段430bp的cDNA，并制備出地高辛標(biāo)記的核酸探針，經(jīng)檢測(cè)結(jié)果表明該探針可用于CDV的臨床檢測(cè)。

3.2聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)作為一種體外擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)已廣泛用于DNA病毒特異性核酸的檢測(cè)，具有省時(shí)、省力、敏感性和特異性高等優(yōu)點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外已有許多通過(guò)RT-PCR檢測(cè)CDV的報(bào)道。肖定福[7]等根據(jù)CDV的NP基因設(shè)計(jì)一對(duì)引物，使用RT-PCR方法，從臨床疑似CDV感染犬的淋巴細(xì)胞中檢測(cè)到目的條帶(287bp)，表明該引物與反應(yīng)條件適合于檢測(cè)犬CDV感染。張洪亮等[8]根據(jù)CDV疫苗株和野毒株H基因序列Nde Ⅰ酶切位點(diǎn)的不同，建立了RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(RELP)鑒別檢測(cè)方法，為臨床上犬瘟熱病毒的鑒別檢測(cè)和診斷提供了依據(jù)。

3.3實(shí)時(shí)定量PCR

實(shí)時(shí)定量PCR(Real-time PCR)是在PCR的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新的核酸檢測(cè)技術(shù)，比普通PCR更迅速、靈敏、特異性強(qiáng)。目前實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法主要有SYBR Green熒光染料摻入法和TaqMan探針?lè)āaqMan探針?lè)ㄌ禺愋院茫莾r(jià)格比較昂貴，染料法價(jià)格較為低廉，敏感性、特異性等也較好。黃國(guó)君等[9]根據(jù)犬瘟熱病毒NP基因序列，設(shè)計(jì)合成引物，建立了基于SYBR Green Ⅰ的Real-time RT-PCR檢測(cè)CDV的方法，與常規(guī)RT-PCR及膠體金檢測(cè)技術(shù)(GIA)進(jìn)行了比較，結(jié)果表明敏感性比常規(guī)RT-PCR高103，比GIA高105。檢測(cè)11例臨床病例，檢出率100%，為CDV的早期快速診斷提供了新的定量檢測(cè)方法。全傳松等[10]建立的TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法，其敏感性是常規(guī)RT-PCR的100倍，與其他犬類病毒不發(fā)生交叉反應(yīng)。對(duì)67份臨床樣品檢測(cè)，陽(yáng)性檢出率為64.2%，高于常規(guī)RT-PCR陽(yáng)性檢出率20%，具有良好的敏感性、特異性和穩(wěn)定性。

3.4環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)是2000年日本學(xué)者Notomi等報(bào)道的一種新的恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條特異性引物，在鏈置換DNA聚合酶的作用下，在等溫條件下(60～65℃)，1h完成核酸擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生焦磷酸鎂白色沉淀，可通過(guò)肉眼來(lái)判斷是否發(fā)生擴(kuò)增。LAMP技術(shù)已在食品檢測(cè)、臨床疾病診斷等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。何麗麗等[11]根據(jù)犬瘟熱病毒N基因設(shè)計(jì)2對(duì)LAMP引物，建立CDV環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法。經(jīng)檢測(cè)，結(jié)果顯示，該方法敏感性比RT-PCR高10倍，僅CDV產(chǎn)生陽(yáng)性擴(kuò)增，狂犬病毒、犬細(xì)小病毒和犬腺病毒Ⅱ型擴(kuò)增結(jié)果均為陰性，臨床樣品檢測(cè)結(jié)果與RT-PCR一致。楊天闊等[12]建立了鑒別CDV野毒株與疫苗株的反轉(zhuǎn)錄-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法(RT-LAMP)，對(duì)反應(yīng)體系和條件進(jìn)行了優(yōu)化，方法特異性高，敏感度是常規(guī)RT-PCR的100倍。

4小結(jié)

犬瘟熱作為對(duì)毛皮動(dòng)物、犬和野生動(dòng)物危害最嚴(yán)重的疾病之一，每年都會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。由于其診斷復(fù)雜和困難，需要實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)來(lái)進(jìn)行確診。雖然已有多種診斷方法成功應(yīng)用于診斷，但在實(shí)際推廣應(yīng)用上仍存在一些問(wèn)題。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，分子生物學(xué)的研究逐漸深入，新的分子生物學(xué)技術(shù)不斷推出和完善，準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便的對(duì)犬瘟熱進(jìn)行診斷和監(jiān)測(cè)將逐步實(shí)現(xiàn)，對(duì)于犬瘟熱的綜合防控和有效治療，保護(hù)毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)、保障寵物犬和野生動(dòng)物的健康具有重大意義。

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低產(chǎn)品種下降9%～10%；最初數(shù)月下降速度較慢，到泌乳末期，泌乳量迅速下降。初乳期內(nèi)的乳脂率很高，第2～8周乳脂率最低。第三個(gè)泌乳月開始，乳脂率又逐漸上升。

文章編號(hào)：2095-9737(2016)01-050-02

中圖分類號(hào)：S858.292

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

作者簡(jiǎn)介：左楠(1981-)，男，黑龍江佳木斯人，碩士，獸醫(yī)師，主要從事動(dòng)物疫病防控、畜牧獸醫(yī)技術(shù)推廣及科研工作。

收稿日期：2015-09-21