小鼠生精細胞的體外雙室無血清培養

龔　淼，張　雷，趙　昱，尹　青，郭淺妤，任廣偉(.河北醫科大學基礎醫學院組織胚胎學教研室，河北 石家莊 05007；2.河北醫科大學第一醫院腎內科，河北 石家莊 05003)

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·論著·

小鼠生精細胞的體外雙室無血清培養

龔淼1，張雷1，趙昱1，尹青1，郭淺妤1，任廣偉2*(1.河北醫科大學基礎醫學院組織胚胎學教研室，河北 石家莊 050017；2.河北醫科大學第一醫院腎內科，河北 石家莊 050031)

[摘要]目的探討無血清條件下應用插入式細胞培養皿(Transwell小室)對小鼠睪丸間質細胞-支持細胞-生精細胞的雙室培養技術。方法取60日齡C57BL/6雄性小鼠睪丸間質細胞和15日齡雄性小鼠睪丸支持細胞與生精細胞混合細胞團雙室共培養,不添加血清。每日在倒置顯微鏡下觀察生精細胞的形態和生長情況，蘇木精染色觀察生精細胞形態，染色體倍性分析檢測細胞分化情況。結果在培養1周后,可見圓形精子細胞出現，2周后可見長形精子細胞,3周后可見較短鞭毛，生精細胞可存活8周；培養1周時，流式細胞術可檢測出單倍體細胞，單倍體細胞百分比隨培養時間延長而增加。結論應用雙室無血清培養體系體外培養小鼠生精細胞可獲得精子且生精細胞存活時間較長。

[關鍵詞]精細胞；細胞培養技術；小鼠

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2016.01.001

由于精子發生與睪丸結構的復雜性，很難針對整個有機體精子發生及相關基因的作用機制進行深入研究。同時，外源化學物質對精子發生的影響逐漸引起更多學者的關注，主要以動物實驗和體外研究為主[1-2]。因此，生精細胞的體外培養成為深入研究精子發生過程,闡明精子發生相關基因功能與作用機制的手段[3-4]。長期且穩定的體外培養生精細胞成為基因功能研究、靶向基因治療和藥物研發新模型的基礎條件[5]。目前，生精細胞的培養方法主要有單細胞培養、支持細胞-生精細胞共培養和睪丸組織塊培養三類，培養時間較短，細胞存活率低，不能獲得令人滿意的單倍體精子細胞轉化率[6]。本研究在不添加外源血清的條件下應用Transwell小室對小鼠睪丸間質細胞-支持細胞-生精細胞進行雙室培養，模擬生精細胞體內生長微環境，以期建立一個長期穩定的小鼠生精細胞體外培養體系，旨在為小鼠生精細胞的體外分化研究提供細胞模型。

1材料與方法

1.1動物與主要試劑15日齡和60日齡清潔級C57BL/6雄性小鼠(合格證號：SCXK京2009-0004)，購買于北京華阜康生物科技股份有限公司。DMEM-F12培養液購自Hyelone公司，胰島素-轉鐵蛋白-硒酸鈉(insulin-transferrin-selenium，ITS)、脫氧核糖核酸酶Ⅰ(deoxyribonuclease Ⅰ，DNaseⅠ)、膠原酶Ⅰ、表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)、睪酮、視黃酸、重組人促卵泡激素(recombination-follicle stimulating hormone,rFSH)購自Sigma公司。

1.2睪丸間質細胞的分離、純化與培養無菌取出60日齡小鼠雙側睪丸，眼科剪剪碎后用0.03%膠原酶37 ℃水浴振蕩消化15 min(150 r/min)，取上清液離心后再次加入0.03%膠原酶，勻速振蕩15 min(130 r/min)，取上清液離心重懸后第3次加入0.03%膠原酶，慢速消化15 min(100 r/min)，吸取上清液離心，重懸后應用配制好的55%Percoll 連續密度梯度離心液，室溫離心 15 min(3 000 r/min)，收集37%~60%的細胞用間質細胞培養液(100 mL DMEM/F-12培養液中，含有10 000 U青霉素、100 mg鏈霉素、100 μL ITS)制成細胞懸液，經3β-羥基類固醇脫氫酶(3β-hydroxysteroid dehydrogenase,3β-HSD)染色鑒定后接種于6孔板的各孔內。

1.3睪丸支持細胞-生精細胞的分離與培養 無菌取出15~18日齡小鼠睪丸，輕柔快速去除睪丸周圍脂肪組織與附睪，用含青霉素、鏈霉素和兩性霉素的D-Hank's緩沖液沖洗。冰上去除睪丸被膜，用眼科剪剪碎游離的生精小管，于上述緩沖液中孵育 2 min，加入0.1%膠原酶Ⅳ，37 ℃水浴振蕩30 min(80 r/min)，離心棄上清，重復使用用0.1%膠原酶Ⅳ消化5 min(80 r/min)，取沉淀物加入0.25%胰蛋白酶和0.1%透明質酸酶，混勻后37 ℃、5%CO2培養箱靜置5 min，200目篩網過濾，棄去上清液，加入含0.1% 膠原酶Ⅳ、0.1%透明質酸酶和1.0 μg/mL DNaseⅠ的 DMEM-F12培養液，37 ℃水浴振蕩 5 min(80 r/min)，室溫靜置5 min，應用共培養體系培養液(100 mL DMEM-F12培養液中，含有10 000 U青霉素、100 mg鏈霉素、100 μg EGF、100 μL ITS、0.5 μmol/L視黃酸、0.1 μmol/L睪酮、2.5 U rFSH重懸細胞)。

1.4睪丸間質細胞-支持細胞-生精細胞雙室培養體系的建立將6孔培養板的6個孔內接種間質細胞，支持細胞-生精細胞團接種到Transwell小室內，小室內加入上述共培養體系培養液，6孔板孔內加入間質細胞培養液，使小室外液面略高于小室底部。隔日進行不完全換液，每次換掉2/3舊液。

1.5蘇木精染色 取Transwell小室內懸浮的生精細胞團，用4%多聚甲醛固定 12 h后離心，常規石蠟包埋細胞團塊，切片機連續切4 μm厚蠟帶制成石蠟切片，常規HE與蘇木精染色，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察并攝片。

1.6流式細胞術檢測生精細胞中單倍體細胞比例分別于培養第1、7、14、21、28和42天取生精細胞加入70%乙醇，-20 ℃固定12 h，洗滌后加入碘化丙碇(propidium iodide，PI)染液，室溫靜置15 min后上機檢測PI熒光強度，四倍體(4N)細胞表示初級精母細胞，二倍體(2N)細胞表示精原細胞、次級精母細胞，單倍體(1N)細胞表示精子細胞。每次計數104個細胞，計算單倍體細胞百分比。

2結果

2.1倒置相差顯微鏡觀察培養第2天，Transwell小室底部薄膜上的支持細胞開始貼壁生長；以精原細胞和精母細胞為主的生精細胞團懸浮生長于支持細胞上。培養第1周，生精細胞團內可見體積較大的細胞為精母細胞和體積較小的圓形精子細胞(圖1A)。培養第2周，生精細胞成團附著于支持細胞表層，但未見貼壁；生精細胞團中出現處于形態改變過程中的長形精子細胞(圖1B)。培養第3周，游離于培養液中的圓形細胞數量增多；可見正在分裂的細胞，細胞飽滿，折光性較強；偶見胞體呈橢圓形改變的精子細胞一端出現鞭毛(圖1C)。

2.2蘇木精染色觀察培養第1周，生精細胞團中初級精母細胞數量增多，精原細胞體較小,呈圓形或橢圓形,胞核呈卵圓形,染色質粗細不一，胞質染色淺；初級精母細胞體積較大，呈圓形，細胞核大而圓，呈絨球狀；可見少量圓形精子細胞，體積小，核呈圓形，染色質細密，核質比大(圖2A)。培養第2周，可見處于形態改變過程中的精子細胞，由圓形變為長形，細胞核偏向一側，染色加深(圖2B)。培養第3周，可見一端長出鞭毛的精子細胞，細胞核深染，呈錐體形，胞質未完全脫落(圖2C)。

圖1倒置相差顯微鏡下雙室培養生精細胞的形態(×400)

A.第7天;B.第15天;C.第21天

Figure 1Changes in the microscopic aspect of cocultured Leydig cell-sertoli cell-spermatogenic cells in bicameral chambers(×400)

圖2雙室培養生精細胞的形態(蘇木精染色 ×1 000)

A.第7天; B.第15天; C.第21天

Figure 2Morphological structure of spermatogenic cells (Hematoxylin staining×1 000)

2.3流式細胞術檢測單倍體細胞百分比培養第7天開始出現少量單倍體細胞，占細胞總數的(15.32±1.02)%，隨著培養時間的增加，單倍體細胞的百分比逐漸增高至(24.93±1.65)%。

3討論

精子正常發生的微環境主要取決于2個因素：一是睪丸支持細胞，參與精子發生的啟動與維持，分泌多種蛋白類物質維持生精上皮微環境的穩態，對生精細胞起支持、營養與保護作用[7]；二是睪丸間質細胞，是體內睪酮的主要分泌細胞，雄激素在精子發生過程中不可或缺[8]。同時，間質細胞與支持細胞之間存在相互影響、相互作用的關系。支持細胞通過分泌細胞因子，直接或間接地作用于間質細胞，在二者之間形成短環式結構，促進間質細胞更好地發揮作用[9]。間質細胞通過分泌雄激素等相關物質促進支持細胞的功能發揮。本研究采用間質細胞-支持細胞-生精細胞共培養的方法，借鑒國內外關于間質細胞原代分離的方法[10-12]。首先，采用低濃度膠原酶差速消化與Percoll密度梯度離心法相結合，有效去除睪丸結締組織和其他細胞，差速消化用時短，減輕了消化酶對間質細胞的損傷，提高了間質細胞的獲得率和純度；3β-HSD只存在于睪丸間質細胞的滑面內質網內，應用此酶鑒定間質細胞純度，使結果準確可靠[13]。其次，采用改良方法分離純化支持細胞與生精細胞，膠原酶去除生精小管周圍的結締組織，能較好地分離生精小管，胰蛋白酶與透明質酸酶可有效去除生精小管周圍的肌樣上皮細胞和基膜等；為避免酶類對細胞的損傷，本研究應用多種酶聯合短時消化，保證了細胞的純度和完整性。同時，本研究首次采用間質細胞-支持細胞-生精細胞雙室共培養，在培養皿內放置一個底部由透明的滲透性薄膜構成的套皿，使培養皿分隔為上下兩室，間質細胞在下室的間質培養液中培養，支持細胞與生精細胞置于上室，間質細胞分泌的雄激素和細胞因子通過滲透膜進入上室的共培養體系培養液中，使共培養體系的生理環境接近生精細胞在睪丸中發育的微環境，促進生精細胞培養的穩定性，使生精細胞存活時間超過30 d，初級精母細胞完成精子發生的過程，產生了形態學上的精子，但由于數量很少，沒有進行活力檢測，后續研究將分離精子進行體外受精實驗，檢測精子是否具有功能。

本研究選取15日齡小鼠睪丸組織，使分離的生精細胞團內只有支持細胞、精原細胞和少量初級精母細胞，與非阻塞性無精子癥患者睪丸組織內細胞成分相似。有研究顯示，生精細胞發育障礙與睪丸內支持細胞和間質細胞的功能異常及局部微環境失衡有關[14-15]。本研究在模擬睪丸組織內微環境的條件下，體外培養生精細胞，脫離了患者睪丸組織內不良環境，在體外將初級精母細胞誘導分化為單倍體精子細胞甚至形成長尾的精子。同時，本研究不在培養體系中加入動物源性的血清，為以后人的精子細胞培養與移植的研究提供了無外源動物因子干擾的實驗基礎。

由于Transwell小室空間有限，支持細胞在鋪滿小室底部后發生接觸抑制，存活時間大約可維持1個半月左右，同時，睪丸支持細胞分泌雄激素的功能也在3周后逐漸降低。本研究結果顯示，培養4周后生精細胞存活率明顯降低，8周后存活細胞已很少。提示生精細胞存活率降低有可能與支持細胞和間質細胞的功能降低有關。本研究重新分離純化睪丸支持細胞接種于Transwell小室底部薄膜上，將培養8周后存活的生精細胞移至支持細胞表面，培養2周后生精細胞仍有少量存活，但未見精子細胞出現鞭毛，這可能與生精細胞生存環境的改變有直接關系。

本研究流式細胞術檢測結果顯示，培養第7天開始出現少量單倍體細胞，提示圓形精子細胞出現于培養第7天左右，與形態學研究結果一致。隨著培養時間的延長，精子細胞的數量逐漸增加，提示生精細胞發生了分化，形成了精子細胞。

綜上所述，在生精細胞-支持細胞-間質細胞雙室共培養體系中，不外源添加動物血清，也能獲得長形精子細胞甚至精子，并能延長生精細胞的培養時間，為生精細胞的培養與分化提供新的技術方法。此外，生精細胞體外與間質細胞和支持細胞雙室共培養，不僅模擬了睪丸組織內各種細胞的正常功能，還避免了體內不良內分泌環境的干擾，在維持睪丸內各細胞間聯系的基礎上，真實地反映精子發生過程中各類生精細胞的發育情況，不僅可用于研究外源化學物質對精子發生的影響，也有利于闡明精子發生的調控機制。本研究計劃后續實驗嘗試使用該培養體系獲得的單倍體精子進行卵胞漿內單精子注射，深入檢測培養體系能否培養具有受精能力的正常精子，進一步完善培養體系。

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(本文編輯：趙麗潔)

Establishment of culture system of mouse spermatogenic cells in vitro without serum

GONG Miao1,ZHANG Lei1,ZHAO Yu1,YIN Qing1,GUO Qian-yu1,REN Guang-wei2*

(1.Department of Histology and Embryology,the School of Basic Medical Science,Hebei Medical

University,Shijiazhuang 050017,China;2.Department of Nephrology,the First Hospital of

Hebei Medical University,Shijiazhuang 050017,China)

[Abstract]ObjectiveTo establish a mouse Leydig cell-Sertoli cell-germ cell double-chamber coculture system in vitro without serum.MethodsThe Leydig cells were isolated from the testes of postnatal day 60 male C57BL/6 mice.Total germ cells and Sertoli cells were isolated from the testes of postnatal day 15 male C57BL/6 mice.The cells in bicameral chambers culture system were grown in media without serum.The morphology and growth of culture cells were monitored daily under contrast phase microscope,and were identified by Hematoxylin staining.Ploidy analysis of cells was observed by flow cytometry.ResultsIn bicameral culture system,sporadic round spermatids were detected after one week,and elongating spermatids or spermatids with flagella were observed after three weeks.The spermatogenic cells survived as long as eight weeks.The haploid peak was detected after one week; the percentage of monoploid increased with culture time.ConclusionThe spermatogenic cells in bicameral culture system matured into morphologically normal spermatozoa and survived longer.

[Key words]spermatids；cell culture techniques；mice

[中圖分類號]R321.1

[文獻標志碼]A

[文章編號]1007-3205(2016)01-0001-04

*通訊作者

[作者簡介]龔淼(1983-)，女，河北石家莊人，河北醫科大學基礎醫學院實驗師，醫學碩士，從事組織胚胎學研究。

[基金項目]河北省自然科學基金項目(H2013201139)

[收稿日期]2015-09-14；[修回日期]2015-10-26