應用RNA-Seq技術篩選不同濃度葉酸培養的QSG-7701細胞中的差異表達基因

張銀玲，薛　賡，孫樹漢,張　毅

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·論著·

應用RNA-Seq技術篩選不同濃度葉酸培養的QSG-7701細胞中的差異表達基因

張銀玲，薛賡，孫樹漢,張毅

[摘要]目的在驗證不同濃度葉酸培養影響人正常肝細胞系增殖、周期和遷移能力的基礎上，應用轉錄組測序(RNA-Seq)技術篩選差異表達基因，為進一步探討葉酸缺乏與基因差異表達以及正常肝細胞惡性轉化之間的相關性打下基礎。方法不同濃度葉酸培養(無葉酸組0 mg/L，正常葉酸組40 mg/L)的人正常肝細胞系QSG-7701 6個月，應用CCK-8實驗檢測細胞增殖、流式細胞技術檢測細胞周期、細胞凋亡、Transwell小室檢測細胞遷移；利用RNA-Seq技術對兩組細胞中的mRNA進行檢測，篩選差異mRNA；通過用實時定量PCR對RNA-Seq的結果進行驗證，并結合統計學和生物信息學方法分析差異mRNA。結果無葉酸培養顯著提高QSG-7701細胞的增殖能力，促進細胞由靜止期進入分裂期，促進細胞的遷移能力；RNA-Seq檢測得到含有16 774條差異mRNA的數據集，初步分析顯示其中391條差異mRNA可能與不同濃度葉酸培養相關，其中上調的115條，下調的276條；隨機對其中11條進行實時定量PCR驗證，72.73%的結果與RNA-Seq一致；分析顯示，差異mRNA相對應的基因與細胞周期等生理過程以及多種腫瘤的發生、發展密切相關。結論最終篩選出參與葉酸調控正常肝細胞惡性轉化相關的基因，RNA-Seq技術能有效地用于差異基因地篩選。

[關鍵詞]葉酸；QSG-7701細胞；轉錄組測序技術；基因表達

作者單位：200433上海，第二軍醫大學醫學遺傳學教研室(張銀玲和薛賡為共同第一作者)

引用格式：張銀玲，薛賡，孫樹漢,等.應用RNA-Seq技術篩選不同濃度葉酸培養的QSG-7701細胞中的差異表達基因[J].東南國防醫藥，2016,18(1):1-5，16.

葉酸(Folate，FA)是水溶性B族維生素，因在綠葉蔬菜中含量豐富而得名。葉酸參與了人體眾多重要物質的合成和代謝，尤其是DNA的合成和甲基化修飾，然而人體自身只能合成少量葉酸，各種生理過程中所需要的葉酸主要由食物中攝取。近年來大量的流行病學調查資料及動物模型實驗皆表明，葉酸缺乏可與包括胰腺癌、食管癌、胃癌、結直腸癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌[1-4]等多種腫瘤的發生密切相關,研究顯示，在腫瘤發生的早期，葉酸通過調控DNA甲基化等表觀遺傳修飾進而影響腫瘤相關基因的表達，但是究竟哪些基因能夠受葉酸調控，參與腫瘤的早期發生目前尚有待于研究。

為此我們選擇利用目前較為流行且比較成熟的轉錄組測序(RNA-Seq)技術對不同濃度葉酸培養的人正常肝細胞系QSG-7701中的差異表達基因進行高通量檢測。RNA-Seq技術，是近年發展起來的利用深度測序進行轉錄組分析的技術[5]。基于illumina HIS 2500高通量測序平臺的轉錄組測序技術能夠在單核苷酸水平上對任一物種特定器官或組織在任一狀態下的整體轉錄活動進行檢測，在分析轉錄本的結構和基因表達水平的同時，還能發現未知的低峰度的新轉錄本，精確識別可變剪切位點，非編碼區域功能研究等，提供全面的轉錄組信息。與傳統的表達譜芯片技術相比，轉錄組測序可以對任意物種的轉錄活動進行檢測，不需要預先針對已知序列設計探針，并且提供精確的數字化信號，更高的檢測通量以及更廣泛的檢測范圍，優勢明顯。通過RNA-Seq檢測，我們對比、分析了不同濃度葉酸培養的QSG-7701細胞中的mRNA，發現了一系列的差異信號。在此基礎上結合常規檢測方法以及統計學和生物信息學分析，為篩選參與葉酸調控正常肝細胞惡性轉化過程的相關基因打下了良好的基礎。

1材料與方法

1.1材料人正常肝細胞株QSG-7701購自上海中國科學院細胞庫。

1.2芯片來源及主要實驗儀器RNA-Seq委托上海伯豪生物技術有限公司進行。測序所用Flow cell 為Illumina PE Flow Cell v3-HS。按照HiSeq 2500 User Guide準備測序試劑，將攜有cluster 的flow cell 上機(儀器型號：HiSeq 2500，Illumina)。選用paired-end 程序，進行測序。測序過程由Illumina 提供的數據采集軟件進行控制，進行實時數據分析。

1.3實驗方法

1.3.1細胞培養本實驗中設定的細胞葉酸培養濃度：無葉酸組為0 mg/L，正常葉酸組為40 mg/L；細胞開展RNA-Seq以及其他后續試驗前須經過6個月不同濃度葉酸培養，培養條件為37 ℃、5%CO2。細胞培養使用不含葉酸的特殊DMEM培養基(D2429，Sigma-Aldrich)，使用前添加10%胎牛血清、584 μg/mL谷氨酸鈉，3.7 mg/mL的NaHCO3。

1.3.2細胞增殖能力檢測取對數生長期的細胞接種于96孔細胞培養板，每孔接種1×103個細胞，每個實驗組設置5個復孔，待細胞貼壁后加入CCK-8試劑(CCK-8, Dojindo Molecular Technologies,Inc,Shanghai,China)，2 h后在酶標儀上測定各孔的吸光度(吸收波長為450 nm)。

1.3.3細胞凋亡水平檢測通過流式細胞技術結合膜聯蛋白A5法檢測不同組細胞的凋亡水平。收取對數生長期的細胞，1000 rpm離心10 min，棄上清，加入預先配制好的膜聯蛋白A5結合緩沖液，制成終濃度為1×106cell/mL的細胞懸液，取100 μL的細胞懸液，向其中加入5 μL膜聯蛋白A5-FITC 結合物，再加入5 μL的PI溶液；室溫下避光15 min后再加入400 μL 膜聯蛋白A5結合緩沖液，在流式細胞儀上采集并分析。

1.3.4細胞遷移能力檢測收取對數生長期的細胞，調整終濃度為2×105cell/mL，將200 μL細胞懸液移入小室內，小室放入24孔板，在小室外加入500 μL 含有10% 胎牛血清的培養基，培養箱中孵育24 h，取出小室擦拭掉上室面細胞，甲醛固定，結晶紫染色，顯微鏡下計數穿膜的細胞數，每組細胞重復3次，每次計數5個視野。

1.3.5細胞總RNA的抽提使用Trizol試劑(Invitrogen)抽提QSG-7701細胞的總RNA，所得總RNA經NanoDrop ND-1000分光光度計及Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, US)電泳質檢合格后用于后續研究。

1.3.6實時熒光定量PCR本研究使用SYBR Green 檢測法，以GAPDH為內參照進行熒光實時定量 PCR。實驗所用的實時定量 PCR 引物序列如表1所示。實時定量PCR 結果以Ct值的形式直觀的展現，所有樣本對目的基因和內參照同時擴增，每個樣本重復3次。

表1　本研究中所驗證的mRNA實時定量引物序列

基因名引物序列退火溫度(℃)RTEL1上游:5'CAGGACTACAAGGGTTCCGATGA3'62下游:5'CAGACCTCCTCAAACTGCTTAT3'GAPDH上游:5'GGTCTCCTCTGACTTCAACA3'60下游:5'GTGAGGGTCTCTCTCTTCCT3'CCNG1上游:5'TAGTCTAACTCAGTTCTTTGGCTTTG3'58下游:5'ATGGGACATTCCTTTCCTCTTC3'SESN1上游:5'TCCACCATTTCGTGTCCAGG3'58下游:5'TAGTTCCAAATTGCCCGTCT3'GAMT上游:5'CCCACCCTGCCTGACGGTCACTTT3'62下游:5'GGGCACCTGCGTCTCCTCAAACAT3'TP53INP1上游:5'CACGGGCACAGAAGTGGAAG3'58下游:5'GGTGGCAATCCCTGGTAAGA3'CDC20上游:5'CGCCAGAGGGTTATCAGAACAGA3'60下游:5'TTCCCACTCCAATCCACAAGG3'CDC45上游:5'AGAAAGGAAGGCTGGGAACTAAG3'60下游:5'CACGTCCGAGGCCACGAAGA3'CDKN1A上游:5'TCCTGTGGGCGGATTAG3'58下游:5'CACTGTCTTGTACCCTTGTGC3'BTG2上游:5'GGCACTCACAGAGCACTACAAAC3'56下游:5'CCTCCTCGTACAAGACGCAGAT3'DHFR上游:5'AGACCTGGTTCTCCATTCCT3'56下游:5'GAACTGCCACCAACTATCCA3'

SYBR Green試劑購自Takara公司(中國大連)，PCR條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，40個循環比較各組mRNA相對表達量的變化。本研究采用2-ΔΔCt的相對定量法對實時定量 PCR 的結果進行比較和分析。

1.3.7RNA-Seq檢測數據的處理①基因差異表達分析： 采用Fold-change(表達差異倍數)以及Fisher精確檢驗統計學方法對基因差異程度進行篩選。數據經過總體歸一化和對數轉化后，篩選差異表達基因。篩選條件規定為 FDR控制在5%以內，差異倍數不低于2.0。篩選出受葉酸調控明顯的差異表達基因。②GO 分析：首先把所有差異表達基因向Gene Ontology數據庫的各個term映射，計算每個term的基因數目，然后應用超幾何檢驗，找出與整個基因組背景相比，在差異表達基因中顯著富集的GO條目，其計算公式為

其中，N為所有基因中具有GO注釋的基因數目；n為N中差異表達基因的數目；M為所有基因中注釋為某特定GO term的基因數目；m為注釋為某特定GO term的差異表達基因數目。計算得到的P值經過Bonferroni校正之后，以校正的P值(FDR)≤0.05為閾值，滿足此條件的GO term定義為在差異表達基因中顯著富集的GO term。GO分析對實驗結果有提示作用，通過差異基因的GO分析可找到受不同濃度葉酸調控的基因可能與哪些基因的功能的改變有關。③ KEGG 分析：應用GO富集原理同樣可以得出具有富集功能的KEGG途徑。通過KEGG分析可能會找到受不同濃度葉酸調控的差異基因與哪些細胞通路的改變有關。與GO分析不同，KEGG是蛋白質之間的相互作用，KEGG的變化可能是由參與這條通路的蛋白的表達量或者是蛋白的活性的改變引起。

2結果

2.1葉酸缺乏影響人正常肝細胞的生理特征無葉酸培養的細胞CCK-8的吸收值(1.65±0.40)顯著高于正常葉酸培養的細胞(0.89±0.11，P<0.01,圖1A)。流式細胞技術檢測顯示，葉酸培養的細胞中處于靜止期的比例(G0/G1，0.80±0.01)顯著高于無葉酸培養的細胞(0.60±0.03，P<0.01，圖1B)。無葉酸培養的細胞的凋亡比例(5.23%±0.26%)顯著低于正常葉酸培養的細胞(11.32%±1.47%，P<0.01，圖1C)。Transwell實驗顯示，24 h后，無葉酸培養的細胞穿過基底膜的數目(19.80±7.48)顯著多于正常葉酸培養的細胞(3.50±2.92，P<0.01，圖1D、E)。

與無葉酸組比較,*P<0.01圖1　葉酸缺乏對人正常肝細胞增殖、凋亡、細胞周期以及遷移能力的影響

2.1.1葉酸缺乏促進細胞的增殖，抑制細胞的凋亡無葉酸條件下培養的細胞的增殖能力顯著高于正常葉酸條件下培養的細胞(圖1A，P<0.01)；流式細胞檢測顯示，無葉酸條件下的細胞的凋亡水平顯著低于正常葉酸條件下培養的細胞(圖1C，P<0.01)。

2.1.2葉酸缺乏促進細胞由靜止期向分裂期的轉化葉酸條件下的細胞中處于細胞周期靜止期的比例(G0/G1)顯著高于無葉酸條件下培養的細胞(圖1B，P<0.01)，處于分裂期的比例(G2/M)顯著低于無葉酸條件下培養的細胞(圖1B，P<0.01)。

2.1.3葉酸缺乏促進細胞的遷移能力Transwell小室實驗顯示，無葉酸條件下的細胞的遷移能力顯著高于正常葉酸條件下培養的細胞(圖1D、E，P<0.01)。

2.2RNA-Seq與實時定量PCR檢測的結果的一致性我們隨機選擇了11條RNA-Seq顯示在無葉酸條件下培養的細胞和正常葉酸條件下培養的細胞中存在顯著性差異的mRNA(圖2)，通過實時定量PCR對其檢測結果進行了驗證。檢測顯示，11條差異mRNA中，8條存在差異且差異趨勢與RNA-Seq檢測結果一致，其余3條無差異，不存在差異趨勢與RNA-Seq相反的mRNA，一致率達到72.73%(圖3)。

圖2　11條差異mRNA的RNA-Seq檢測結果

圖3　11條差異mRNA的實時定量PCR檢測結果

2.3RNA-Seq篩選得到的差異mRNA的生物信息學分析RNA-Seq檢測總共得到含有16 774條差異mRNA的數據集，根據方法中所列的一系列判斷標準，最終篩選到與葉酸缺乏相關的差異mRNA共計391條，其中上調的基因共有115條，下調的共有276條。

根據以上標準判斷，葉酸培養的人正常肝細胞QSG-7701中共有391個差異表達的mRNA，其中上調表達的基因共有115個，下調表達的共有276個基因。

圖4　差異mRNA的生物信息學分析

GO分析顯示差異mRNA所對應的基因主要包括細胞周期蛋白類、細胞信號和傳遞蛋白、細胞受體、葉酸代謝相關的基因與酶類、原癌基因和抑癌基因、核苷酸代謝、RNA剪接及轉錄活性調節、蛋白翻譯合成基因等等(圖4A)。KEGG分析差異mRNA所對應的基因中受葉酸調控比較明顯的細胞信號通路主要是P53信號通路、細胞周期相關信號通路、TNF信號通路等等(圖4B)。以上的生物信息學分析為篩選下一步研究的代謝通路和相關基因奠定了基礎。通過GO分析展示結果，可看出受葉酸影響比較顯著的是細胞周期阻滯，其中上調表達基因為myc，下調表達的基因主要為CDKN1A、INHA、TP53INP1等；其次為磷酸化的負調控，相關下調表達基因主要為CDKN1A、INHA等；還有誘導凋亡相關下調基因INHA、ZMAT3、TP53INP1等。

3討論

通過本實驗，我們進一步明確了葉酸缺乏對人正常肝細胞系生理特征的影響，結果顯示葉酸缺乏顯著刺激了細胞的增殖、細胞由靜止期向分裂期的轉化以及細胞的遷移，抑制了細胞的凋亡，再一次證實了葉酸缺乏能夠導致正常細胞的惡性轉化。但是在這些增殖、凋亡和遷移能力改變的背后，葉酸究竟通過哪些基因影響了發揮作用，目前尚不明確。為此我們選用了目前較為流行的RNA-Seq技術來篩選可能的相關差異mRNA 。對于高通量的篩選處理相關的差異基因，傳統上多采用基因芯片技術，但是基因芯片技術只能檢測已知序列的信息，而本研究選擇的RNA-Seq技術可進行全基因組水平的基因表達差異的研究，具有檢測范圍廣、可重復性高、分析更可靠等特點。除此之外，RNA-Seq技術還能發現新的未知轉錄本、剪接體、SNP等。其動態范圍廣，與實時定量PCR驗證結果符合率高，是目前深入研究轉錄組的強大工具。本研究通過傳統技術實時定量PCR隨機對部分RNA-Seq的檢測結果進行了驗證，結果證明RNA-Seq的可信度較高，重復性較好，適于高通量的篩選處理相關的差異基因。

本研究通過RNA-Seq技術篩選得到了391條差異表達的mRNA，并對其中11條進行了驗證，得到驗證的8條mRNA所對應的基因包括與腫瘤發生相關的原癌基因、抑癌基因、與細胞周期蛋白相關基因、腫瘤壞死因子受體超家族成員、生長分化因子類、脂代謝相關基因相關(圖3)，提示葉酸缺乏與腫瘤發生密切相關。進一步通過統計學和生物信息學手段分析391條差異表達的mRNA，結果顯示部分差異mRNA與腫瘤的發生相關，如c-Myc、Ras等；部分差異mRNA與細胞周期相關，如Cdc20、Cdc45、RRM2等；部分差異mRNA與葉酸代謝通路相關，如FOLR1、GAMT、FPGS等。

生學信息學分析的結果提示我們，可以從葉酸代謝通路的相關基因出發，如葉酸受體FOLR1或葉酸代謝途徑中的關鍵酶——葉酰多聚谷氨酸合成酶(FPGS)，探討葉酸缺乏如何通過影響葉酸代謝通路，進而引起細胞內的一系列下游基因的變化，參與腫瘤的發生[6]。最新研究也發現，葉酸缺乏可以引起上皮間質轉化(epithelial to mesenchymal transition, EMT)的發生，EMT 不僅促進腫瘤細胞的侵襲和轉移，也可以在腫瘤發生化療耐藥中發揮重要作用[7]，也可以從EMT的角度對葉酸參與腫瘤發生、發展的機制進行研究。

葉酸的適時適量補充可能會抑制癌基因的激活，降低癌前病變的發生，對機體的健康發展起著重要作用。人體自身僅能合成少量的葉酸，其攝入不足或者代謝障礙均可引起機體多系統受損。機體正常組織葉酸的補充可以提供DNA合成和復制的原料，因此可以確保DNA合成的保真性，維持DNA的完整性和DNA的損傷修復，均可以減少機體正常組織的惡性轉變[8]。此外,葉酸提供S-腺苷甲硫氨酸甲基供體參與DNA中胞嘧啶的甲基化修飾[9]，葉酸攝入不足能夠導致全基因組水平的DNA低甲基化和特定位點CPG島啟動子區的高甲基化[10-12]。因此，生物信息學的分析也提示可以通過探討葉酸缺乏對DNA甲基化的影響，揭示葉酸缺乏導致正常細胞惡性轉化的機制。

綜上所述，應用轉錄組測序技術篩選目的基因提供了比傳統的芯片技術更為廣泛、更為可靠的信息。本研究結合RNA-Seq技術以及生物信息學分析所得到的一系列結果將有助于深入探討葉酸缺乏導致正常細胞惡性轉化的機制。

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(本文編輯：齊名；英文編輯：王建東)

Primry study of differential mRNA expression patterns of QSG-7701 cells treated with different doses of folic acid by RNA-Seq

ZHANGYin-ling,XUEGeng,SUNShu-han

,ZHANGYi.BasicMedicalDepartmentoftheSecondMilitaryMedicalUniversityMedicalGeneticsandResearchSection,Shanghai200433,China

[Abstract]ObjectiveTo study the differential mRNA expression patterns of QSG-7701 cells that treated with folic acid which affects cell proliferation, cell cycle, cell apoptosis and transwell in order to investigate the relationship of folic acid deficiency, differential gene expression and malignant transformation of human normal hepatocytes by RNA-Seq. MethodsHuman normal hepatocytes QSG-7701 were treated with folic acid (No folic acid group:0 mg/L, Normal folic acid group:40 mg/L) for 6 months. CCK-8, Flow cytometric and transwell were used to examine cell proliferation, cell cycle, cell apoptosis and cell migration. Real-time PCR was used to analyze and confirm RNA-Seq datas. The differential mRNA expression patterns was analyzed using bioinformatics and statistics. ResultsFolic acid deficiency promoted cell proliferation and cell migration. RNA-Seq results included 16 774 differential gene expression patterns and a total of 391 differential genes expressed in QSG-7701 cells were screened out, of which 115 were up regulated and 276 were down regulated and 11 genes were random selected to confirm by Real-time PCR. As a result, a percent of 72.73% genes were consisted with Real-time PCR. Analysis demonstrated that the abmormal gene had a close relationship with cell cycle, tumor inition and development. ConclusionGenes involved in normal cell malignant transformation can be effectively selected by RNA-Seq.

[Key words]folic acid; QSG 7701 cells; RNA-Seq; gene expression

(收稿日期：2015-09-12；修回日期：2015-10-21)

通訊作者：張毅，E-mail: yizhang@smmu.edu.com

基金項目：國家自然科學基金資助項目(81272331)

[中圖分類號]R735.7

[文獻標志碼]A

doi：10.3969/j.issn.1672-271X.2016.01.001