熒光法測定懸浮培養藻體葉綠素含量的研究

崔建升　樊琳琳　段莉麗　高柳堂　高　思　周　盼　張乃琦　潘少偉

(1.河北科技大學環境科學與工程學院，石家莊　050000；2.河北省交通規劃設計院，石家莊　050000；

3.河北升泰環境檢測有限責任公司，石家莊　050000)

?

熒光法測定懸浮培養藻體葉綠素含量的研究

崔建升1樊琳琳1段莉麗1高柳堂1高思1周盼1張乃琦2潘少偉3

(1.河北科技大學環境科學與工程學院，石家莊050000；2.河北省交通規劃設計院，石家莊050000；

3.河北升泰環境檢測有限責任公司，石家莊050000)

【摘要】實驗室常采用熒光檢測技術實現對藻的定量檢測。藻細胞沉降，導致其熒光值受靜置時間影響較大，靜置1min時，熒光值的衰減率達ΔF/F0=-9.96%，無法獲得準確的藻濃度。因此，本文提出一種藻體樣品制備方法，培養過程中添加瓊脂粉(0.08～0.10g/100mL)作為藻液懸浮穩定劑。用該方法培養的藻液其懸浮性、穩定性均有明顯提高，且靜置1h后，ΔF/F0=-4.82%≤±5%。減少了藻體沉降對測定結果的影響，確保了熒光光度法測定葉綠素含量的準確性。

【關鍵詞】藻液葉綠素熒光測定；熒光光度法；懸浮穩定劑

水體中葉綠素a含量在一定程度上反應水體中藻類數量和水質狀況，是水體水質環境監測中的常規監測項目、是水體富營養化指標之一。

紫外分光光度法[1-2]、熒光分光光度法[3]是實驗室測定葉綠素a實現對浮游植物的定量測定的最為常用的方法。傳統測定葉綠素a的方法是分光光度法，存在靈敏度不高，不適用于低濃度的葉綠素a之分析[4]，且無法獲得水體富營養化第一階段的實時數據等缺點。近年來，由于熒光分光光度法靈敏度比分光光度法高10倍，不需要對樣品進行預處理，操作簡單[5]，可連續實時、監測，國內外運用熒光方法測量葉綠素得到了快速發展，而且隨著熒光法葉綠素在線分析儀的開發與研究[6]，實現了水體中葉綠素的實時原位分析。

實驗過程中發現現有技術熒光檢測法直接測定藻液時，藻細胞沉降明顯、測量值隨時間變化較大得到的數據不準確，無法正確判斷出水質環境。準確、完整的監測數據是環境管理工作的基礎和依托，一個錯誤的數據可能導致錯誤的決策與行動，因此正確測量水質環境至關重要。

針對這一現狀，本文擬采用淡水湖泊中最常見且實驗室極易培養的蛋白核小球藻作為研究對象，藻體培養過程中添加對藻體熒光值測量無干擾的一種藻體培養添加劑，增加藻液的懸浮性、穩定性，進而確保了利用熒光法測定葉綠素含量的結果的準確性。

1實驗材料、儀器與方法

1.1儀器與試劑

儀器：光照培養箱(E-30B0美國Percival)；可見分光光度計(722型上海光譜儀器有限公司)；紫外分光光度計(UV-2600上海天美科學儀器有限公司)；熒光分光光度計(RF-5301日本島津公司)；循環水式多用真空泵(SHB-Ⅲ鄭州長城科工貿有限公司)。

試劑：鹽酸(分析純 石家莊市華迪化工工貿有限公司)；氫氧化鈉(分析純 天津市大陸化學試劑廠)；葉綠素a標準品(日本wako公司，10mg裝)；蛋白核小球藻 (藻種購自中國科學院武漢水生生物研究所，培養基為滅菌BG-11培養液)；瓊脂(Japan MW：3000-9000)。

1.2實驗方法

1.2.1樣品的采集

實驗選取的蛋白核小球藻購買自中國科學院野生生物質庫——淡水藻種庫。藻種在E-30B0光照培養箱中培養，培養條件：培養溫度25℃，光照條件2000lx，時間設置為12h晝/12h夜，濕度條件75% RH。藻種靜置培養，每日搖動培養瓶2次同時更改錐形瓶位置，以免引起光照不足。十日后同時取出作為供試藻種。

1.2.2藻體制備方法

選取6個規格為250mL的錐形瓶，每個錐形瓶中配置100mL BG-11培養基，并向每個錐形瓶中添加不同量的瓊脂粉。其中：1號培養基：添加瓊脂粉0g/100mL。2號培養基：添加瓊脂粉0.02g/100mL。3號培養基：添加瓊脂粉0.04g/100mL。4號培養基：添加瓊脂粉0.06g/100mL。5號培養基：添加瓊脂粉0.08g/100mL。6號培養基：添加瓊脂粉0.10g/100mL。

將上述1-6號培養基放入滅菌鍋于121℃下滅菌30min，取出后放入超凈臺冷卻。在接種之前，置于紫外燈下照射30min以上，于無菌條件下進行藻種接種，接種完成，置于恒溫光照培養箱中培養。

1.2.3確定已制備培養基特征吸收

使用UV-2600型紫外可見分光光度計于室溫下，對5、6號培養基進行光譜掃描。掃描波長范圍為220～900nm。

1.2.4確定葉綠素a的最佳激發和發射波長

使用島津RF5301熒光分光光度計分別對葉綠素a儲備液進行光譜掃描。掃描條件：設定激發波長掃描范圍為400～500nm，發射波長掃描范圍為600～750nm，狹縫寬度：EX：5.0nm，EM：5.0nm；靈敏度：High；響應時間：Auto。確定葉綠素a的最佳激發發射波長。

1.2.5靜置10h后新藻體測定樣品的狀態

同時取出1～6號培養基中培養的供試藻10ml于1-6號比色管中；靜置10h后觀察瓊脂在藻體培養過程中對藻體的懸浮效果藻液狀況。

1.2.6測量間隔時間對熒光值測量結果的影響實驗

(1)測量間隔時間對不制備藻體熒光值測量的影響實驗。取1號供試藻(即，不制備藻體)，使用島津RF5301熒光分光光度計在確定的熒光測定參數下每隔1min測定一次樣品的熒光強度。

(2)測量間隔時間對制備藻體熒光值相對變化率的影響實驗。取1～6號供試藻，使用島津RF5301熒光分光光度計在確定的熒光測定參數下每隔1min測定一次樣品的熒光強度。繪制熒光值相對變化率(△F/F0)對測量間隔時間(T)變化曲線。

1.2.7靜置時間對光密度測量結果的影響

取1～6號供試藻，用滅菌的蒸餾水進行稀釋四倍，滅菌的蒸餾水作為空白參比，使用722型可見分光光度于663nm波長處，每隔1min測定一次蛋白核小球藻的光密度值D(663nm)。繪制光密度值相對變化率(ΔD(663nm)/D0)對測量間隔時間(T)變化曲線。

2結果與討論

2.1確定葉綠素a的最佳激發和發射波長

圖1為掃描的葉綠素a提取液的激發光譜和發射光譜，由圖可知，葉綠素a的激發波長約在436nm左右，發射波長約在672nm左右。

圖1　葉綠素a的激發光譜和發射光譜

熒光測定參數設定：激發波長為436.0nm；發射波長為672.0nm；激發和發射狹縫寬度均為5.0nm；靈敏度：high；響應時間：Auto。

2.2靜置時間對不制備藻體熒光值測量結果的影響實驗

取1號供試藻，用滅菌的蒸餾水稀釋四倍，滅菌的蒸餾水作為空白參比，使用島津RF5301熒光分光光度計在2.1中確定的熒光測定參數下，每隔1min測定一次樣品的熒光強度。建立測量間隔時間(T)與熒光值(F)間的關系曲線，如圖2所示。

圖2　藻體測量間隔時間與熒光值間的關系曲線

由圖2可知，熒光值隨測量間隔時間變化較大，T=1min時，熒光值的衰減率達ΔF/F0=-9.96%，測量值存在較大誤差，不容忽略。這是因為藻細胞在靜置1min內沉降嚴重熒光值下降較大，5min后基本熒光值趨于穩定，因此要求測定樣品前必須搖勻、測量時要求快速，以減小因藻細胞因沉降造成的誤差，但測量結果存在的誤差不可避免。

2.3確定已制備培養基特征吸收

使用UV—2600型紫外可見分光光度計于室溫下掃描添加5、6號BG-11培養基在220～900nm波長范圍內的吸光度值。確定制備的培養基無特征吸收。因此瓊脂的添加對藻體光密度測定結果無影響。

2.4靜置10h后供試藻體狀態

瓊脂粉在藻體的培養中作為懸浮穩定劑，瓊脂粉的添加量決定藻體的懸浮狀況，添加量過少會使藻體懸浮不均勻，添加量過大導致培養基凝固。取10mL處于對數生長期的1-6號供試藻，分別置于1～6號比色管中靜置10h后觀察其效果。

可得，1號藻細胞快速沉淀；2、3、4號藻細胞分層現象嚴重；5、6號藻細胞均勻、不下沉、不分層；即，制備培養基培養的對數生長期的蛋白核小球藻靜置10h后，瓊脂粉添加量在0.08～0.10g/100mL培養基培養的藻體懸浮均勻、不下沉、不分層，且溶液穩定。

2.5靜置時間對供試藻熒光值測量結果的影響實驗

取1～6號供試藻，滅菌的蒸餾水作為空白參比，使用島津RF5301熒光分光光度計在確定的熒光測定參數下每隔1min測定一次樣品的熒光強度。繪制測量間隔時間(T)與熒光值相對變化率(ΔF/F0)變化曲線，如圖3所示。

圖3　靜置時間與制備藻體熒光值相對變化率間的關系曲線

由圖3可知，5、6號供試藻熒光值相對變化率受測量間隔時間影響較小在±5%內，最終確定制備藻體所用培養基為BG-11培養基、微量元素溶液A5是BG-11培養基微量元素的重要組成部分、懸浮穩定劑瓊脂粉0.08～0.10g/100mL。

2.6確定已制備培養基特征吸收

使用UV—2600型紫外可見分光光度計于室溫下掃描添加5、6號BG-11培養基在220～900nm波長范圍內的吸光度值。確定制備的培養基無特征吸收。因此瓊脂的添加對藻體光密度測量結果無影響。

2.7靜置時間對光密度測量結果的影響

取1、5、6號供試藻，分別用滅菌的1、5、6號培養基稀釋至四倍，1、5、6號培養基作為空白參比，使用722型可見分光光度于663nm波長處每隔1min測定一次蛋白核小球藻的光密度值D(663nm)。繪制光密度值相對變化率(ΔD(663nm)/D0)對測量間隔時間(T)變化曲線，如圖4所示。

由圖4可知，5、6號供試藻光密度值相對變化率受測量間隔時間影響較小在±5%內，且添加瓊脂粉0.08～0.10g/100mL藻體懸浮基本均勻、稍有下沉、不分層光密度值略有上升，最終確定制備藻體所用培養基為BG-11培養基、微量元素溶液A5是BG-11培養基微量元

素的重要組成部分、懸浮穩定劑瓊脂粉0.08～0.10g/100mL。

圖4　測量間隔時間與制備藻體光密度值相對變化率間的關系曲線

3結論

本文根據瓊脂粉的凝膠性、穩定性提出了一種藻提樣品制備方法、向BG-11培養基中添加瓊脂粉(0.08～0.10g/100mL)作為助懸劑培養蛋白核小球藻，培養的蛋白核小球藻作為制備藻液。運用制備的培養基培養的蛋白核小球藻藻液，其懸浮性、穩定性均有顯著提高，進而確保了利用熒光法測定葉綠素含量的結果的準確性，在環境檢測等領域具有一定的可行性，可推廣使用。

參考文獻：

[1]潘玲玲，徐曉潔，譚晶晶，等.分光光度法快速測定玉米葉片中的葉綠素[J].化學分析研究簡報，2007，35(3)：413-415.

[2]孔魯裔.果酒中葉綠素銅鈉的測定分光光度法[J].生命科學儀器，2008，6(1)：48-53.

[3]唐堯基，游文瑋，陳瑩，等.同步熒光法測定海水中葉綠素a的含量[J].分析儀器，2004，(3)：24-26.

[4]楊紅麗，黃汝錦，王翊如，等.固相微萃取-紫外可見光譜聯用技術在葉綠素測定中的應用[J].廈門大學學報：自然科學版，2006，45(4)：522-524.

[5]胡海珠，劉君華，安勝波，等.熒光法葉綠素在線分析儀 分析性能評價[J].分析儀器，2011，(4)：76-79.

[6]J.Gregor.Freshwater phytoplankton quantification by chlorophyll a：a comparative study of in vitro，in vivo and in situ methods.Water Research，2004，38：517-522.

Study about Chlorophyll Fluorescence Determination

with the Aalgae Suspension Culture

CUI Jiansheng1FAN Linlin1DUAN Lili1GAO Liutang1GAO Si1ZHOU Pan1ZHANG Naiqi2PAN Shaowei3

(1.College of Environmental Science and Engineering，Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang 050000；

2.Hebei Traffic Planning Design Institute，Shijiazhuang 050000；3.Hebei Shengtai Environmental Testing Co.，Ltd，Shijiazhuang 050000)

Abstract：Laboratory always obtain the content of algae volume by measuring the chlorophyll a fluorescence intensity.According to the settlement of algae cells，fluorescence value are greatly influenced by static duration，when the static duration is 1min，attenuation rate of fluorescence was ΔF/F0=-9.96% and the determination of algae density is not exact.In the article，a method of algae culture preparation was established by adding agar powder(0.08～0.10g/100mL) to the culture.The suspensibility and stability of the culture was enhanced dramatically by this method，after standing 1 hour，attenuation rate of fluorescence was ΔF/F0=-4.82%≤±5%.The method enhance the accuracy of chlorophyll contents measurement by chlorophyll spectrofluorimetry and reduces the effect of culture sedimentation to the measurement.

Keywords：Algal chlorophyll fluorescence determination；spectrofluorimetry；Suspending stabilizer

中圖分類號：X21

文獻標識碼：A

文章編號：1673-288X(2016)01-0158-03

作者簡介：崔建升，博士，教授，院長，碩士研究生導師，主要研究領域為環境科學與工程

引用文獻格式：崔建升等.熒光法測定懸浮培養藻體葉綠素含量的研究[J].環境與可持續發展，2016，41(1)：158-160.