阻斷Sonic Hedgehog信號對不同人肝癌細胞生長的影響*

劉愛梅，　余功旺，　黃莉霞，　孫　艷△，　遲作華

(廣東藥學院1生命科學與生物制藥學院,2臨床醫學院，廣東 廣州 510006)

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阻斷Sonic Hedgehog信號對不同人肝癌細胞生長的影響*

劉愛梅1，余功旺1，黃莉霞1，孫艷1△，遲作華2△

(廣東藥學院1生命科學與生物制藥學院,2臨床醫學院，廣東 廣州 510006)

[摘要]目的： 研究阻斷Sonic Hedgehog (Shh)信號對不同人肝癌細胞生長的影響，探討阻斷Shh信號抑制肝癌細胞生長的機制。方法: RT-PCR法檢測Shh信號分子在3株人肝癌細胞(BEL-7402、Huh7和HepG2)中的表達，并檢測Shh阻斷抗體作用后BEL-7402細胞Shh信號效應分子表達變化；MTT法檢測人肝癌細胞增殖活性；流式細胞術檢測人肝癌細胞凋亡；Western blot 檢測凋亡相關蛋白表達。結果: Shh信號分子在3株人肝癌細胞中均有表達，Shh阻斷抗體可以下調Shh信號效應分子patched (Ptch)、Gli1和Gli2的表達；Shh阻斷抗體可以抑制3株肝癌細胞生長，增加G0/G1期細胞，并誘導細胞凋亡；Shh阻斷抗體作用后，BEL-7402細胞pro-caspase-3、pro-caspase-8和pro-caspase-9蛋白表達水平下降，cleaved caspase-3、cleaved caspase-8和cleaved caspase-9蛋白表達水平升高。結論: 阻斷Shh信號可抑制Shh高表達的人肝癌細胞生長，阻滯細胞周期于G0/G1期，并誘導肝癌細胞凋亡。

[關鍵詞]肝癌細胞； Sonic Hedgehog； 細胞凋亡

肝癌以肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)為主要類型，是全世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一。在中國，肝癌發病率和死亡率逐年上升，已高居惡性腫瘤相關死亡原因第2位[1]。目前雖然發展了多種肝癌治療手段，但其總體生存率仍然較低。研究表明，肝癌與其它癌癥一樣是復雜多樣的疾病，即使具有相同的病理改變，卻可能由完全不同的基因變化(p53、PTEN等)和信號異常(Hedgehog、Wnt/β-catenin等)造成[2-4]。這也是病理類型相同的肝癌患者對常規放化療反應不同的重要原因[5]。因此，針對患者個體的腫瘤相關基因或異常信號分子開展精準治療成為提高肝癌治療效果的重要策略[6]。

Hedgehog信號通路是早期胚胎發育時影響極性形成的關鍵信號通路[7]。大量研究顯示，Hedgehog家族成員Sonic Hedgehog (Shh)異常激活Hedgehog信號參與了包括肝癌在內多種腫瘤的惡性生長和轉移[8-9]。Huang等[10]研究顯示，50%左右HCCs中存在Shh信號異常激活。然而，研究也顯示，Shh信號異常激活水平在不同HCCs中存在差異，以Shh信號為靶點治療時,肝癌患者受益水平和反應可能不同[11]。此外，阻斷Shh信號抑制肝癌生長的機制目前還未闡明。

因此,本研究選取3株HCCs細胞，應用Shh阻斷抗體從源頭靶向阻斷Shh信號通路，觀察其對不同肝癌細胞生長的影響，并通過檢測細胞周期、細胞凋亡以及凋亡相關蛋白初步探討阻斷Shh信號抑制HCCs生長的作用及機制，為臨床開展以Shh信號為靶點的精準治療提供實驗依據。

材料和方法

1材料與試劑

人肝癌細胞株BEL-7402、Huh7和HepG2由廣東藥學院生物制藥研究所提供。RPMI-1640購自Gibco;胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購自杭州四季青公司;抗人Shh阻斷抗體和兔抗人IgG購自Santa Cruz；抗人pro-caspase-3、pro-caspase-8、pro-caspase-9、cleaved caspase-3、cleaved caspase-8和cleaved caspase-9抗體購自CST；MTT、二甲亞砜和PI購自Sigma；RT-PCR試劑盒購自TaKaRa；Westen blot相關生化試劑和ECL化學發光液購自Milipore。

2細胞培養

人肝癌細胞株BEL-7402、Huh7和HepG2以含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基，放置于37 ℃、飽和濕度、5% CO2的溫箱中孵育，細胞融合度達到80%～90%時以1∶3或1∶4的比例傳代。取對數生長期的細胞進行實驗。

3實驗方法

3.1RT-PCR檢測Shh信號分子的表達收集對數生長期細胞，用完全培養基(含10%FBS的RPMI-1640培養基)重懸，按每孔4×105接種于6孔板。37 ℃、5% CO2培養過夜，加入Shh阻斷抗體，使其終濃度為1、2 mg/L。設置對照組，加入2 mg/L IgG。培養24 h，TRIzol法提取總RNA，逆轉錄生成cDNA。PCR擴增細胞跨膜蛋白Patched (Ptch)、Smoothened (Smo)及鋅指家族轉錄因子Gli1、Gli2。擴增條件為：95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，循環30次； 72 ℃ 2 min。所用的引物序列見表1。

表1　引物序列

3.2MTT法檢測HCC細胞的存活率收集對數生長期細胞，用完全培養基重懸，按每孔8×103接種于96孔板。37℃、5% CO2培養過夜，實驗組加入Shh阻斷抗體，使其終濃度為1、2 mg/L。設置空白對照組與陰性對照組，陰性對照組加入2 mg/L IgG。培養24 h，每孔加入10 μL MTT溶液(10 g/L)，孵育4 h，酶標儀測定450 nm波長處的吸光度(A)值。計算存活率：陰性對照組存活率(%)=A(陰性對照組)/A(空白對照組)×100%；實驗組存活率(%)=A(實驗組)/A(陰性對照組)×100%。

3.3流式細胞術檢測細胞周期與細胞凋亡收集對數生長期細胞，用完全培養基重懸，按每孔4×105接種于6孔板。分組(同3.1)處理后，37 ℃、5% CO2培養24 h或48 h后胰酶消化，收集細胞。75%乙醇固定12 h以上。PBS洗2次，PI染液避光染色10 min。流式細胞術檢測。應用ModFit軟件進行細胞周期分析。

3.4Western blot檢測凋亡蛋白收集對數生長期細胞，用完全培養基(含10% FBS的1640培養基)重懸，按每孔4×105/孔接種于6孔板。分組(同3.1)處理后，37 ℃、5% CO2培養24 h，收集細胞，PBS漂洗后加入預冷的蛋白裂解液中，冰上裂解30 min，4 ℃ 10 000×g離心15 min，去除細胞碎片，吸取上清液，提取總蛋白用Bradford法定量，進行Westen blot實驗。取20 μL總蛋白行聚丙烯酰胺凝膠電泳(4%濃縮膠，12%分離膠)。隨后將蛋白質轉印至PVDF膜上，用含10%脫脂奶粉的TBST緩沖液于4 ℃封閉1 h，分別加入1∶1 000稀釋的pro-caspase-3、pro-caspase-8、pro-caspase-9、cleaved caspase-3、cleaved caspase-8、cleaved caspase-9多克隆抗體和GADPH抗體于搖床中孵育1 h，TBST洗膜4次，每次10 min，然后加入1∶4 000稀釋的辣根過氧化酶標記的Ⅱ抗于搖床中孵育1 h，TBST 洗膜5次后經ECL化學發光，顯影、定影后分析。

4統計學處理

各項指標結果用均數±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS 17.0軟件進行t檢驗或單因素方差分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1Shh信號分子在3株HCCs細胞中的表達

配體Shh、受體Ptch、Smo以及轉錄因子Gli1、Gli2在BEL-7402、Huh7和HepG2細胞中均有表達，但表達水平不同。其中配體Shh、Shh信號通路活化靶基因Ptch、Gli1以及激活型轉錄因子Gli2在BEL-7402細胞中表達水平最高，在HepG2細胞中表達水平最低，見圖1。

2Shh阻斷抗體抑制HCCs細胞中Shh信號活化

為了解Shh阻斷抗體對HCCs細胞中Shh信號活化的影響，我們以Shh信號激活程度最高的HCC細胞株BEL-7402細胞為例，采用RT-PCR方法檢測Shh阻斷抗體作用后Ptch、Gli1和Gli2表達水平變化，結果發現1 mg/L Shh阻斷抗體作用24 h，BEL-7402細胞Ptch、Gli1和Gli2表達水平降低，與對照IgG組相比差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

Figure 1.Expression of Shh signaling molecules in HCCs cells.

圖1Shh信號分子在3株HCCs細胞中的表達

Figure 2.Shh antibody (Shh Ab) inhibited activation of Shh signaling pathway in BEL-7402 cells.Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01vsIgG.

圖2Shh阻斷抗體抑制肝癌細胞BEL-7402中Shh信號通路活化

3阻斷Shh信號抑制人肝癌細胞生長

為研究阻斷Shh信號通路對不同HCC細胞生長的影響，采用MTT法檢測了Shh阻斷抗體作用后3株HCC細胞存活率。結果發現，1 mg/L Shh阻斷抗體作用24 h，BEL-7402和Huh7細胞存活率下降，與對照組相比差異有統計學意義(P<0.05)；2 mg/L Shh阻斷抗體作用24 h，BEL-7402和Huh7細胞存活率下降更明顯，存活率分別為(19.5±2.1)%、(29.6±2.9)%。HepG2細胞在2 mg/L Shh阻斷抗體作用下存活率才下降至(89.3±0.9)%,見圖3。

Figure 3.Blockade of Shh signaling pathway inhibits growth of HCC cells.Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01vsIgG.

圖3阻斷Shh信號抑制HCC細胞生長

4阻斷Shh信號通路對人肝癌細胞周期和細胞凋亡的影響

1 mg/L Shh阻斷抗體作用24 h，BEL-7402和Huh7 G0/G1期細胞增多，與對照組相比差異有統計學意義(P<0.05)，HepG2 G0/G1期細胞百分數隨抗體濃度增加而增加，在Shh阻斷抗體濃度為2 mg/L時，與對照組相比有統計學意義(P<0.05)。BEL-7402和Huh7 G0/G1期細胞百分數跟Shh阻斷抗體水平沒有明顯的量效關系。此外，1 mg/L Shh阻斷抗體作用24 h，BEL-7402、Huh7細胞發生凋亡，與對照組相比差異有統計學意義(P<0.05)，而HepG2細胞沒有發生顯著的凋亡；2 mg/L Shh阻斷抗體作用24 h，BEL-7402、Huh7細胞凋亡水平顯著上升，分別為(58.7±3.4)%和(41.7±2.9)%，HepG2細胞開始出現凋亡，凋亡水平為(6.8±1.4)%,見圖4。

Figure 4.The effects of Shh signaling blockade on cell cycle (A) and apoptosis (B) of HCC cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsIgG.

圖4阻斷Shh信號對HCC細胞細胞周期及凋亡的影響

5阻斷Shh信號通路調控肝癌細胞凋亡相關蛋白表達

1、2 mg/L Shh阻斷抗體作用于BEL-7402細胞24 h，pro-caspase-3和pro-caspase-9蛋白表達降低，其活化形式cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白表達升高，與對照組相比差異有統計學意義(P<0.05)；2 mg/L Shh阻斷抗體作用后，pro-caspase-8蛋白表達水平降低，其活化形式cleaved caspase-8表達升高，與對照組相比差異有統計學意義(P<0.05)，見圖5。

Figure 5.The effects of Shh signaling blockade on the expression of caspase proteins in HCC cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01vsIgG.

圖5阻斷Shh信號對HCC細胞中caspase蛋白表達的影響

討論

Hedgehog家族在高等動物中有3個同源因子Sonic Hedgehog(Shh)、Desert Hedgehog(Dhh)和In-dian Hedgehog(Ihh)，均通過結合細胞膜受體Ptch后釋放Smo并解除Ptch對Smo的抑制，Smo進而活化Gli，活化的Gli轉錄因子家族成員(Gli1、Gli2和Gli3)調控下游基因表達，參與早期胚胎發育時機體對稱性和極性形成[7]。 Hedgehog信號在大部分正常人體組織中處于靜息狀態[12]，但在多種惡性腫瘤中會有Shh分子異常激活[11-13]。因此，Shh信號已成為肝癌等多種腫瘤精準治療的重要靶點[13-14]。然而，研究雖已充分證實了Shh信號在肝癌惡性生長、侵襲和轉移中的重要作用[4,10,15]，但已有的研究均未能顯示在以Shh信號為靶點時不同肝癌細胞的反應性如何，也未能闡明其作用機制。因此本研究探討了從源頭阻斷Shh信號對3株不同的人肝癌細胞株生長的影響，并初步探討了以Shh信號為靶點調控肝癌生長的作用和分子機制。

首先通過檢測信號分子表達情況了解Shh信號在BEL-7402、Huh7和HepG2細胞中的活化水平。結果發現Hh信號配體Shh及受體Ptch、Smo、Gli1和Gli2在3株HCC細胞中均有表達，說明HCCs細胞均表達Shh分子，并可結合自身細胞膜受體Ptch激活Shh信號通路。然而，Ptch、Gli1和Gli2在3株HCC細胞中表達水平不一致，以BEL-7402細胞中表達水平最高，HepG2細胞中表達水平最低。鑒于Ptch和Gli1本身即Shh信號調控的靶基因，表達水平可以反映該信號通路激活情況，Gli2又是該通路的激活型轉錄因子[16]，本研究結果說明Shh信號通路在BEL-7402細胞中激活水平最高，而在HepG2細胞中最低。這與Huang等[10]檢測Huh7細胞表達Shh信號分子水平高于HepG2細胞的結果類似。

Shh信號與腫瘤惡性增殖的關系最為密切。應用Smo特異性阻斷劑Cyclopamin、Shh阻斷抗體可以有效地抑制胰腺癌、神經母細胞瘤、胃癌細胞生長[13]。本研究應用不同濃度的Shh阻斷抗體作用于Shh信號通路激活水平最高的BEL-7402細胞，結果發現1 mg/L Shh阻斷抗體即可顯著下調Ptch與Gli1表達水平，說明Shh阻斷抗體可有效阻斷HCC細胞中Shh信號通路的激活，而且阻斷效應隨抗體濃度增加而增強。進一步檢測Shh阻斷抗體對3株HCC細胞生長的影響，結果發現Shh阻斷抗體可以顯著抑制BEL-7402和Huh7細胞生長，Shh阻斷抗體為2 mg/L時上述兩種細胞存活率僅為20%～30%；而HepG2細胞在低濃度Shh阻斷抗體作用下未出現生長抑制，僅在高濃度抗體作用下存活率下降10%左右。這提示Shh信號在HCC細胞中激活的基礎水平決定了以Shh為靶點抑制肝癌細胞生長的水平。

研究顯示，阻斷Shh信號可以通過上調基因p21誘導卵巢癌細胞凋亡[17]，還可激活JNK/P38 MAPK信號通路誘導胃癌細胞凋亡[18]。應用Hh信號小分子抑制劑vismodegib還可阻滯細胞周期從而抑制神經母細胞瘤分裂[19]。本研究結果顯示應用Shh阻斷抗體阻斷Shh信號可以使3株HCCs細胞周期阻滯于G0/G1期，而且誘導肝癌細胞凋亡。其中，Shh信號活化水平較高的BEL-7402和Huh7細胞凋亡顯著。而基礎Shh信號激活水平較低的HepG2細胞在阻斷Shh信號后出現濃度依賴的G0/G1細胞周期阻滯，但僅有少數細胞在高濃度阻斷抗體作用下發生凋亡。進一步以BEL-7402細胞為代表初步探討阻斷Shh信號誘導HCC細胞凋亡的分子機制，結果發現不同濃度Shh阻斷抗體下調pro-caspase-3、pro-caspase-8和pro-caspase-9蛋白水平，并上調其活化形式cleaved caspase-3、cleaved caspase-8和cleaved caspase-9的蛋白水平。報道顯示，caspase-8是Fas等死亡受體活化的下游分子，caspase-9則參與死亡受體與線粒體凋亡兩條信號途徑，二者活化后均能激活caspase-3，最終引起細胞凋亡[20]。結果提示阻斷Shh信號可通過外源性和內源性凋亡途徑誘導肝癌細胞凋亡。

綜上所述，Shh信號通路在不同HCC細胞中均存在差異性的異常激活，阻斷Shh信號通路可以通過阻滯細胞周期和誘導細胞凋亡抑制HCC細胞生長。但信號通路基礎激活水平的差異是決定腫瘤細胞對以Shh信號為靶點的治療手段反應性的重要因素。此外，HCC細胞的分子病理學研究顯示，多個基因異常或信號通路異常可共同導致肝癌的發生。不同基因或信號之間的相互作用對HCC細胞反應性的影響也有待闡明。

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(責任編輯： 林白霜， 余小慧)

外周組織對Aβ的生理性清除及其對阿爾茨海默病的治療潛力

淀粉樣蛋白(amyloid-beta, Aβ)在阿爾茨海默病(Alzheimer disease, AD)的發病機制中扮演關鍵的角色。為了說明外周組織和器官中對腦源性Aβ的清除作用及治療AD的潛力，中美科學家測量了人和鼠在循環系統的不同部位血中Aβ的濃度，并建立了聯體動物模型來研究外周Aβ的分解代謝對AD發病機制中的影響。他們發現無論在人還是鼠體內，其次級腔靜脈血中的Aβ濃度比上腔靜脈血中的濃度低。另外，把125I標記的Aβ40注射到實驗對象體內后，在肝、腎、消化道和皮膚中檢測到大部分的放射性標記物，而在腦中卻很少，提示腦組織產生的Aβ可以在外周被清除。在Aβ沉積前后進行聯體動物實驗(parabiosis)，在沒有改變淀粉樣前體蛋白、Aβ合成及代謝酶類和Aβ轉運受體的表達水平、也沒有改變腦組織AD樣病理變化(包括tau高度磷酸化、神經炎癥以及神經元變性和丟失)的情況下，聯體AD小鼠的腦組織Aβ負荷均明顯降低。以上結果表明外周系統能有效清除腦源性Aβ，提示清除外周Aβ對治療AD有價值，推測外周組織對Aβ清除不足可能與AD的發生有關。

Acta Neuropathol, 2015, 130(4):487-499(徐卉)

Effect of Sonic Hedgehog signaling blockade on growth of hepatocarcinoma cellsLIU Ai-mei1, YU Gong-wang1, HUANG Li-xia1, SUN Yan1, CHI Zuo-hua2

(1SchoolofBiosciencesandBiopharmaceutics,2MedicalCollege,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China.E-mail:sxmshw77@163.com;E-mail:zhchi33@126.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the effect of Sonic Hedgehog (Shh) signaling blockade on the growth of hematocarcinoma cells and underlying mechanisms. METHODS: The expression of Shh signaling molecules in hematocarcinoma cell lines BEL-7402, Huh7 and HepG2 was detected by RT-PCR. The cell viability was detected by MTT assay. The cell cycle and apoptosis were analyzed by flow cytometry. The expression of apoptosis-related proteins was determined by Western blot. RESULTS: Shh signaling molecules were all expressed in BEL-7402, Huh7 and HepG2 cells. The mRNA expression of Patched (Ptch), Gli1 and Gli2 was down-regulated by anti-Shh antibody. Blockade of Shh signaling pathway inhibited the proliferation of hepatocarcinoma cells with increasing cells in G0/G1phase and induced the apoptosis of hepatocarcinoma cells. Treatment with anti-Shh antibody down-regulated the protein expression of pro-caspase-3, pro-caspase-8 and pro-caspase-9, while up-regulated the protein levels of cleaved caspase-3, cleaved caspase-8 and cleaved caspase-9 in BEL-7402 cells. CONCLUSION: Blockade of Shh signaling pathway inhibits the growth of hepatocarcinoma at different levels by cell cycle arrest and inducing apoptosis of hematocarcinoma cells.

[KEY WORDS]Hepatocarcinoma cells; Sonic Hedgehog; Apoptosis

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.02.003

[中圖分類號]R730.23

[文獻標志碼]A

通訊作者△孫艷 Tel: 020-39352150; E-mail: sxmshw77@163.com； 遲作華 Tel: 020-34055880; E-mail: zhchi33@126.com

*[基金項目]國家自然科學基金資助項目(No.81000923); 廣東省科技計劃(No.2013B021800089)

[收稿日期]2015- 10- 31[修回日期] 2015- 11- 16

[文章編號]1000- 4718(2016)02- 0208- 07