EdCC通過MEK-ERK信號通路減輕小鼠心肌缺血再灌注損傷*

蔣　智，　賈中申，　吳玥婷，　韋　方，△

(1貴州省人民醫院心內科，貴州省心血管病研究所，貴州 貴陽 550002；2貴州醫科大學，貴州 貴陽 550004)

?

EdCC通過MEK-ERK信號通路減輕小鼠心肌缺血再灌注損傷*

蔣智1，賈中申2，吳玥婷1，韋方1，2△

(1貴州省人民醫院心內科，貴州省心血管病研究所，貴州 貴陽 550002；2貴州醫科大學，貴州 貴陽 550004)

[摘要]目的： 研究子宮內膜干細胞(endometrial stem cells，EnSCs)來源細胞因子“雞尾酒”(EnSC-derived cytokine cocktail，EdCC)對心肌缺血再灌注損傷的影響及MEK-ERK信號通路的作用。方法: 建立小鼠心肌缺血再灌注損傷模型，用TTC/Evans blue染色評估心梗面積，TUNEL染色檢測細胞凋亡，Western blot檢測ERK1/2磷酸化水平和cleaved caspase-3表達。結果: EnSCs具有間充質干細胞特性，表達CD90，不表達CD34和CD45。EdCC的表皮生長因子(EGF)含量為(6 811±312)ng/g蛋白。經尾靜脈注射EdCC可顯著升高心肌ERK1/2磷酸化水平，明顯降低梗死面積，減少梗死周邊區凋亡細胞數目，抑制capase-3活化。MEK1特異性阻斷劑PD98059(5 mg/kg)抑制EdCC介導的ERK1/2磷酸化，并抵消上述心肌保護效應。EGF受體特異性阻斷劑AG-1487(6 mg/kg)只能部分抵消EdCC的心肌保護作用，而單純注射EGF不能縮小梗死面積。結論: EdCC通過激活MEK1-ERK1/2信號通路減輕心肌缺血再灌注損傷，EGF受體是該通路重要組成部分。該結果對目前成體干細胞移植治療模式——從細胞轉移到細胞因子，具有重要的理論意義。

[關鍵詞]子宮內膜干細胞來源細胞因子“雞尾酒”； MEK-ERK信號通路； 心肌梗死； 缺血再灌注損傷

急性心肌梗死已成為我國最主要的致死原因[1]，心梗面積的大小和患者的臨床預后息息相關[2]。盡管早期再灌注治療是降低心梗面積最有效的方法，但再灌注后缺血心肌的功能障礙和結構損傷不能立即恢復反而進一步加重，該現象被稱為缺血再灌注損傷[3]，嚴重削弱了再灌注治療的獲益。隨著介入技術的發展及再灌注治療的廣泛應用，如何保護缺血心肌已成為急性心肌梗死再灌注治療亟待解決的問題[4]。

臨床研究證明干細胞移植治療心肌梗死安全有效[5]。成體干細胞移植通過釋放多種細胞因子保護細胞凋亡、促進組織修復及再生，即“旁分泌效應”[6]。子宮內膜干細胞(endometrial stem cells，EnSCs)具有無創獲取、增殖速度快、傳代穩定、低免疫源性、無倫理道德問題等優勢，適宜異體移植，是目前"現貨"干細胞治療策略極具潛力的種子細胞[7]。我們的前期研究發現EnSCs移植可通過旁分泌效應保護大鼠心肌細胞，減少心梗面積，改善心梗后心功能[8]。EnSCs表達表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)。EGF與EGF受體(EGF recetotor,EGFR)特異性結合可激活ERK信號通路，是保護心肌缺血再灌注損傷的重要信號通路[9]。有研究報道EGF可減輕大鼠小腸缺血再灌注損傷[10]，多種細胞因子與EGFR有交叉反應，共同激活ERK信號通路[11]。因此，我們提取EnSCs分泌的多種抗凋亡及促血管新生細胞因子，稱之為EnSC來源細胞因子“雞尾酒”(EnSC-derived cytokine cocktail，EdCC)。我們推測EdCC可激活ERK信號通路減輕心肌缺血再灌注損傷。為驗證這一假說，我們建立小鼠心肌缺血再灌注損傷模型，研究EdCC對心肌梗死面積、細胞凋亡及ERK信號通路的影響。

材料和方法

1細胞、動物、實驗試劑及耗材

人EnSCs細胞株購自杭州易文賽生物技術有限公司。8～12周齡雄性昆明小鼠，體重25～30 g，由貴州醫科大學實驗動物中心提供。胎牛血清、DMEM/F12細胞培養液和PBS(HyClone)；25 cm2細胞培養瓶(Corning)；PD98059和AG-1487(Selleck)；Captisol(MedChem Express)；重組人EGF(Peprotech)；超濾離心管(Millipore)；異氟烷(上海玉研科學儀器有限公司)；冠狀動脈結扎線(Sharpoint)；TTC(Sigma)；Evans blue和多聚甲醛(凱信)；EGF ELISA試劑盒(Elabscience)；TUNEL試劑盒(Invitrogen)；OCT包埋劑(TaKaRa)；蛋白定量試劑盒、ECL顯色液(Pierce)；兔抗小鼠p-ERK1/2(Thr202/Tyr204)、兔抗小鼠ERK1/2和兔抗小鼠cleaved caspase-3抗體(CST)；兔抗小鼠β-actin和HRP偶聯羊抗兔IgG(中杉金橋)。

2主要方法

2.1EnSCs的培養液氮凍存的細胞株用37 ℃水浴快速溶解后用含10%胎牛血清的DMEM/F12細胞培養液洗去凍存液，接種于25 cm2培養瓶，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，24 h后更換培養液，以后每3 d換液，生長融合達70%左右時進行傳代培養。

2.2EdCC的制備和儲存將8×105EnSCs種入25 cm2培養瓶，24 h后用PBS反復洗去含血清培養基，加入3 mL無血清DMEM/F12培養液，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，24 h后吸出無血清培養液，5 000 r/min離心15 min，棄沉淀取上清，用Millipore超濾離心管截留上清液中分子量>10 kd的蛋白，于-80 ℃冰箱儲存。

2.4小鼠心肌缺血再灌注損傷模型小鼠用異氟烷吸入麻醉，用6-0圓針絲線于肺動脈下方2～3 mm處用活結結扎左冠狀動脈前降支，即開始缺血，將活結線頭預留3～5 mm在胸腔外，5 min后經尾靜脈注射藥物，30 min后適當用力拉活結線頭將活結松開，即開始再灌注，實驗流程見圖1。對照組注射200 μL無血清DMEM/F12；EdCC組注射100 μg EdCC(用無血清DMEM/F12稀釋成200 μL)；EdCC+PD98059組注射100 μg EdCC和5 mg/kg PD98059(用無血清DMEM/F12稀釋成200 μL，含12.5%丙二醇)；EdCC+丙二醇組注射100 μg EdCC(用無血清DMEM/F12稀釋成200 μL，含丙二醇12.5%)；丙二醇組注射200 μL無血清DMEM/F12(含丙二醇12.5%)；EdCC+AG-1487組注射100 μg EdCC和6 mg/kg AG-1487(溶于100 mmol/L captisol)；EGF組注射1 ng EGF(用DMEM/F12稀釋成200 μL)。

Figure 1.The experimental schedule.

圖1實驗流程

2.5TTC/Evans blue染色脫頸椎法處死小鼠，將原先松開的冠狀動脈前降支線結再次結扎，從升主動脈逆行注入2% Evans blue染液，然后剪下心臟用PBS洗去多余染液，保鮮膜包裹后放入-20 ℃冰箱冷凍15 min，取出后垂直左室長軸將心臟切成1 mm薄片，然后2% TTC避光染色20 min，4%多聚甲醛溶液固定20 min，壓平，蘸干，拍照。

2.6梗死面積的計算用Image-Pro軟件計算梗死面積。心臟左室橫截面為左室面積(left ventricle，LV)，非Evan’s blue藍染區域為危險區(area at risk，AAR)，白色區域為梗死區(infarct area，IA)。梗死面積用IA/AAR表示，危險區面積用AAR/LV表示。

2.7冰凍切片脫頸椎法處死小鼠，經主動脈逆行灌注10 mL冰PBS，剪下心臟用濾紙吸去多余水分、分離多余結締組織，用10%、20%、30%蔗糖溶液脫水，OCT包埋，液氮速凍，以7 μm切片留樣。

2.8TUNEL染色冰凍切片于常溫放置解凍，晾干，4%多聚甲醛溶液固定10 min，PBS洗3次，0.2% Triton X-100穿膜5 min，PBS洗3次，加混合好的TUNEL染液在37 ℃下孵育60 min，PBS洗3次，浸入含1 mg/L Hoechst的PBS溶液中5 min，PBS洗3次，封片。用熒光顯微鏡觀察，每個切面取梗死周邊區5個高倍鏡視野，用Image Pro軟件計數TUNEL陽性細胞數。

2.9Western blot實驗小鼠脫頸椎處死后立即經主動脈逆行灌注10 mL冰PBS，僅保留冠脈結扎線以下左室心肌組織。心肌組織用錫箔紙包裹，液氮速凍，砸碎后加蛋白裂解液及蛋白酶抑制劑，冰上裂解30 min，期間反復震蕩混勻，離心后取上清行BCA法蛋白定量，準備蛋白樣品。用10%SDS-PAGE分離蛋白后，轉膜，用5%的脫脂牛奶封閉1 h，加 I 抗4 ℃孵育過夜，PBS-T洗3次，加HRP偶聯 II 抗于室溫孵育2 h，PBS-T洗3次，加ECL液曝光、顯影、定影。用掃描儀掃描曝光膠片，用Bandscan軟件分析條帶像素灰度值。

3統計學處理

由式(2)可知,log2(fk(r)/ek(r))相當于是對規則覆蓋樣例個數fk(r)加的權值,它均衡了不同類之間的樣例個數差異對規則的影響。較大的R值說明該規則作出正確預測數顯著地大于隨機猜測的結果。例如,由于r1覆蓋45個樣例,則正類的期望頻數為e+(r1)=45×(80/180)=20,而負類的期望頻數為e_(r1)=45×(100/180)=25。因此,r1的似然比為

用SPSS 16.0統計學軟件進行統計學分析，所有數據用均數±標準差(mean±SD)表示。2組數據比較用t檢驗，3組以上數據用單因素方差分析，兩兩比較用Bonferroni檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1體外培養EnSCs的形態

體外培養的EnSCs貼壁生長，呈紡錘形，融合后形成旋渦樣結構。經流式細胞術分析，EnSCs表達間充質干細胞表面標志CD90，不表達CD34和CD45等造血細胞來源表面標志，見圖2。

Figure 2.The EnSCs presented mesenchymal characteristics. A: phase-contrast microscopic view of normal cultured EnSCs with 30% confluent (×200); B: phase-contrast microscopic view of normal cultured EnSCs with 100% confluent (×100); C: flow cytometric analysis of the cell surface marker of EnSCs.

圖2EnSCs具有間充質干細胞特性

2體外培養EnSCs的EGF表達水平

ELISA檢測EnSCs上清液中EGF的濃度為(573.8±21.8) ng/L，經計算EdCC理論上EGF含量為每100 μg EdCC含EGF (782.5±29.7) pg，實際檢測100 μg EdCC中EGF含量為(681.1±31.2) pg，說明Millipore蛋白超濾技術可截留近90%EnSCs上清液中的EGF蛋白。

3EdCC促進心肌ERK1/2磷酸化

EGF通過與EGFR結合激活下游信號通路促進ERK1/2磷酸化[12]，是減輕心肌缺血再灌注損傷的重要信號通路，我們推測富含EGF的EdCC可促進心肌ERK1/2磷酸化。為驗證該猜想，我們把小鼠分為對照組和EdCC組，于缺血前5 min、缺血30 min和再灌注15 min時提取心臟組織蛋白，用Western blot檢測ERK1/2磷酸化(圖3)。結果顯示， EdCC組缺血30 min及再灌注15 min時ERK1/2磷酸化水平較對照組升高，提示EdCC激活心臟ERK1/2信號通路。

4EdCC介導的ERK1/2磷酸化可被PD98059阻斷

EGF介導的ERK1/2磷酸化的上游信號因子為ERK激酶1(MEK1)[12]，于是我們用MEK1的特異性阻斷劑PD98059阻斷ERK1/2的上游信號。EdCC組ERK1/2磷酸化水平在再灌注15 min時較對照組和EdCC+PD98059組均升高(P<0.01)，提示EdCC通過MEK1激活ERK1/2，見圖4。

Figure 3.EdCC increased myocardial ERK1/2 phosphorylation. A representative image of Western blot for determining phosphorylated ERK1/2 and total ERK1/2.

圖3EdCC提高心肌ERK1/2磷酸化水平

5EdCC通過MEK1-ERK信號通路減輕心肌缺血再灌注損傷

我們進一步研究MEK1-ERK信號通路在EdCC心肌保護效應中的作用。再灌注24 h,各組危險區面積無統計學顯著性。EdCC組梗死面積為35.9%±7.5%，較對照組縮小24%(P<0.01)，提示EdCC減輕心肌缺血再灌注損傷；EdCC+PD98059組梗死面積為44.2%±7.5%，較EdCC組明顯擴大(P<0.05)，提示阻斷MEK1-ERK信號通路抵消EdCC的心肌保護效應，見圖5。

Figure 4.EdCC activated myocardial MEK1-ERK signaling pathway. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsEdCC group.

圖4EdCC激活心肌MEK1-ERK信號通路

6EdCC通過MEK1-ERK信號通路抑制細胞凋亡

為進一步說明MEK1-ERK信號通路對細胞凋亡的影響，我們把小鼠分為對照組、EdCC組、EdCC+PD98059組和EdCC+丙二醇組，再灌注3 h后處死小鼠，做心臟冰凍切片，用TUNEL染色計數凋亡細胞，提取心肌蛋白用Western blot檢測caspase-3活化水平。Ed-CC組梗死周邊區凋亡細胞數量為每個高倍鏡視野15.1±5.3，較對照組減少37%(P<0.01)；EdCC組cleaved caspase-3表達水平為0.160±0.034，較對照組減少86%(P<0.01)，提示EdCC抑制細胞凋亡；PD98059阻斷MEK1-ERK信號通路可抵消上述效應，見圖6。

Figure 5.MEK1-ERK signaling pathway mediated the myocardial protective effect of EdCC. A: the representative images of TTC/Evans blue staining of mouse heart; B: the quantitative analysis of AAR/LV; C: the quantitative analysis of IA/AAR. Mean±SD.n=11～12.**P<0.01vscontrol group;##P<0.05vsEdCC group.

圖5MEK1-ERK信號通路介導EdCC的心肌保護效應

Figure 6.EdCC inhibited cell apoptosis (A) and activation of caspase-3 (B) through MEK1-ERK signaling pathway. Mean±SD.n=6～8.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsEdCC group.

圖6EdCC通過MEK1-ERK信號通路抑制細胞凋亡和caspase-3活化

7EGFR部分參與EdCC的心肌保護作用

再灌注24 h各組危險區面積無統計學顯著性。EdCC+AG-1487組的梗死面積均值較EdCC組大，較對照組小，但差異均無統計學顯著性。AG-1487是EGFR選擇性抑制劑，說明抑制EGFR可部分抵消EdCC的心肌保護效應。1 ng EGF不能縮小梗死面積，提示EdCC所含EGF水平沒有明顯心肌保護作用，見圖7。

討論

心肌缺血再灌注損傷占最終心梗面積的50%[13]，如存活心肌無法代償損傷心肌的收縮力，將發展成充血性心力衰竭。目前學術界已逐漸達成共識，心臟是終末分化器官，無論自然或疾病狀態其自我增殖修復的能力微乎其微[14]。干細胞移植、基因療法等促進心肌再生的治療方法臨床試驗療效甚微[5]，或因多種潛在風險仍處于動物研究階段[15]。因此，致力尋找具有心肌保護效應的藥物并探索其信號轉導途徑，從分子機制理解心肌細胞壞死與存活并設計治療靶點以減少心肌細胞壞死、縮小梗死面積顯然具有十分重要的意義。

心肌對缺血再灌注損傷的反應分為兩階段。在缺血期，部分心肌細胞因急性缺氧壞死，存活心肌細胞出現酸中毒、水腫、鈉鈣離子超載等病理生理改變；在再灌注期，存活的心肌細胞因迅速恢復能供反而出現更加嚴重的損傷[3]。我們的前期研究發現EnSCs移植減少大鼠持續冠脈結扎導致的心肌細胞凋亡并縮小梗死面積[8]，為契合臨床情況，充分利用EdCC的治療效果，我們在結扎小鼠冠脈5 min后即注射EdCC，30 min后再灌注，24 h后TTC/Evans blue結果顯示梗死面積較對照組減少24%。Western blot結果顯示EdCC組心臟ERK1/2磷酸化不僅在再灌注后15 min還在缺血30 min時顯著升高，提示EdCC不僅減輕缺血再灌注損傷，還可能減少缺血期心肌細胞因急性缺血所致壞死。缺血再灌注損傷引起心肌細胞凋亡約占所有心肌細胞死亡的80%[13]，抑制凋亡可以顯著降低梗死面積[16]。我們研究發現EdCC顯著減少梗死周邊區凋亡細胞數量并抑制caspase-3活化，從細胞和蛋白水平說明EdCC的抗凋亡作用。PD98059溶于丙二醇用于靜脈注射，我們通過對比EdCC組、EdCC+PD98059和EdCC+丙二醇組的梗死面積、凋亡細胞數量和cleaved caspase-3的表達水平排除了丙二醇對實驗結果的干擾。

Figure 7.EGFR partially contributed to the myocardial protective effect of EdCC. A: the representative images of TTC/Evans blue staining; B: the quantitative analysis of AAR/LV; C: the quantitative analysis of IA/AAR. Mean±SD.n=9～10.**P<0.01vscontrol group.

圖7EGFR部分參與EdCC的心肌保護效應

盡管EdCC所含EGF相對其它細胞因子豐度較高，但EGF(1 ng)并不能縮小梗死面積，而EGFR選擇性抑制劑AG-1487可部分抵消EdCC的心肌保護效應，說明EGFR及其下游MEK1-ERK1/2是關鍵信號通路，EGF并非關鍵效應分子。更高濃度的EGF是否可通過該信號通路保護心肌缺血再灌注損傷尚無報道。EnSCs還表達TGF、HGF、FGF、Ang I、PDGF等多種細胞因子，可能在EGFR水平及受體后信號轉導水平有交叉反應并最終匯聚至MEK1-ERK1/2[11]。我們認為EdCC的保護效應不能完全歸因于單一細胞因子，而是多種細胞因子的“雞尾酒”效應。EdCC對其它信號通路的激活或抑制也可能十分重要。Millipore蛋白超濾技術還可濃縮EnSCs培養液中富含miRNA的外體[17]，miRNA也可能參與了EdCC的心肌保護效應。

EnSCs是極具潛力的“現貨”干細胞產品的種子細胞，我們的前期研究發現EnSCs通過旁分泌效應保護心肌細胞并改善心梗后心功能[8]。我們首次提出用注射EdCC代替EnSCs移植，證明了EdCC可保護小鼠心肌缺血再灌注損傷，MEK1-ERK信號通路是關鍵機制，其中EGFR是重要組成部分。EdCC的應用可避免EnSCs移植潛在的心律失常[18]、腫瘤形成[19]及血栓栓塞[20]等風險，其應用前景較EnSCs可能更為廣闊。該研究結果對目前成體干細胞治療模式從細胞轉移到細胞因子具有重要的理論意義。

[參考文獻]

[1]王文, 朱曼璐, 王擁軍, 等. 《中國心血管病報告2012》概要[J]. 中國循環雜志, 2013, 28(6): 408-412.

[2]Geltman EM. Infarct size as a determinant of acute and long-term prognosis[J]. Cardiol Clin, 1984, 2(1): 95-103.

[3]奚群英, 祝寶華. 細胞膜鈉鈣交換蛋白與心肌缺血/再灌注損傷[J]. 中國病理生理雜志, 2006, 22(12): 2476-2479.

[4]Hausenloy DJ, Yellon DM. Targeting myocardial reperfusion injury:the search continues[J]. N Engl J Med, 2015, 373(11): 1073-1075.

[5]Fisher SA, Brunskill SJ, Doree C, et al. Stem cell therapy for chronic ischaemic heart disease and congestive heart failure[J]. Cochrane Database Syst Rev, 2014, 4: CD007888.

[6]朱峰, 文輝才, 郭光華. 干細胞旁分泌效應在ALI/ARDS治療中的研究進展[J]. 中國病理生理雜志, 2012, 28(4): 755-759.

[7]Massasa EE, Taylor HS. Use of endometrial stem cells in regenerative medicine[J]. Regen Med, 2012, 7(2): 133-135.

[8]Jiang Z, Hu X, Yu H, et al. Human endometrial stem cells confer enhanced myocardial salvage and regeneration by paracrine mechanisms[J]. J Cell Mol Med, 2013, 17(10): 1247-1260.

[9]方軍, 吳黎明, 陳良龍. RISK信號通路在心肌預處理及后處理中的作用[J]. 中國病理生理雜志, 2009, 10(10): 2062-2067.

[10]Arda-Pirincci P, Bolkent S. The role of epidermal growth factor in prevention of oxidative injury and apoptosis induced by intestinal ischemia/reperfusion in rats[J]. Acta Histochem, 2014, 116(1): 167-175.

[11]Ockenga W, Kühne S, Bocksberger S, et al. Epidermal growth factor receptor transactivation is required for mitogen-activated protein kinase activation by muscarinic acetylcholine receptors in HaCaT keratinocytes[J]. Int J Mol Sci, 2014, 15(11): 21433-21454.

[12]Endres NF, Barros T, Cantor AJ, et al. Emerging concepts in the regulation of the EGF receptor and other receptor tyrosine kinases[J]. Trends Biochem Sci, 2014, 39(10): 437-446.

[13]Anversa P, Cheng W, Liu Y, et al. Apoptosis and myocardial infarction[J]. Basic Res Cardiol, 1998, 93(Suppl 3): 8-12.

[14]van Berlo JH, Molkentin JD. An emerging consensus on cardiac regeneration[J]. Nat Med, 2014, 20(12): 1386-1393.

[15]郭曉令, 劉慶, 王嬋, 等. 重編程誘導多功能干細胞的研究進展[J]. 中國病理生理雜志, 2014, 7(7): 1218-1222.

[16]王茜, 鄧鳳君, 林煥冰, 等. cAMP信號分子在缺血后適應心肌保護機制中的作用[J]. 中國病理生理雜志, 2011, 8(8): 1496-1501.

[17]Das S, Halushka MK. Extracellular vesicle microRNA transfer in cardiovascular disease[J]. Cardiovasc Pathol, 2015, 24(4): 199-206.

[18]Chang MG, Tung L, Sekar RB, et al. Proarrhythmic potential of mesenchymal stem cell transplantation revealed in aninvitrococulture model[J]. Circulation, 2006, 113(15): 1832-1841.

[19]Fong CY, Gauthaman K, Bongso A. Teratomas from pluripotent stem cells: A clinical hurdle[J]. J Cell Biochem, 2010, 111(4): 769-781.

[20]Gleeson BM, Martin K, Ali MT, et al. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells have innate procoagulant activity and cause microvascular obstruction following intracoronary delivery:amelioration by antithrombin therapy[J]. Stem Cells, 2015, 33(9): 2726-2737.

(責任編輯： 林白霜， 余小慧)

EdCC reduces myocardial ischemia-reperfusion injury via MEK-ERK signaling pathwayJIANG Zhi1, JIA Zhong-shen2, WU Yue-ting1, WEI Fang1, 2

(1DepartmentofCardiology,GuizhouProvincialPeople'sHospital,GuizhouProvincialCardiovascularDiseaseInstitute,Guiyang550002,China;2GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China.E-mail:weifanggzsy@qq.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the myocardial protective effect of endometrial stem cell (EnSC)-derived cytokine cocktail (EdCC) on myocardial ischemic reperfusion injury and the MEK-ERK signaling pathway. METHODS: A mouse model of myocardial ischemic reperfusion injury was established. Infarct area, cell apoptosis, and expression of cleaved caspase-3 and phosphorylatied ERK1/2 were determined by TTC/Evans blue staining, TUNEL assay and Western blot, respectively. RESULTS: The mesenchymal characteristics were observed in the EnSCs with expressing CD90 and in absence of CD34 and CD45. EdCC contained (6 811±312) ng/g epidermal growth factor (EGF) protein. The phosphorylation of ERK1/2 markedly increased after injection of EdCC, but was abolished by MEK1 inhibitor PD98059 (5 mg/kg). EdCC decreased the infarct area and apoptotic cell number in the border zone and inhibited caspase-3 activation. However, the effects were abolished by MEK1 specific inhibitor PD98059. EGF did not decrease the infarct area, but the EGF receptor antagonist AG-1487 (6 mg/kg) partly abolished the myocardial protective effect of EdCC. CONCLUSION: EdCC protects the myocardium from ischemic reperfusion injury via activating MEK1-ERK signaling pathway, indicating an essential role in the transmission of stem cell therapy from the cell transplantation to cytokine based strategy.

[KEY WORDS]Endometrial stem cell-derived cytokine cocktail; MEK-ERK signaling pathway; Myocardial infarction; Ischemia-eperfusion injury

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.02.005

[中圖分類號]R363；R542.2+2；Q255

[文獻標志碼]A

通訊作者△Tel： 0851-85603809； E-mail： weifanggzsy@qq.com

*[基金項目]國家自然科學基金地區科學基金資助項目(No. 81460050); 貴州省科技廳科學技術基金(黔科合J字[2014]2112號); 貴州省衛生廳科學技術基金資助項目 (No.gzwkj2013-1-006)

[收稿日期]2015- 09- 14[修回日期] 2015- 11- 16

[文章編號]1000- 4718(2016)02- 0221- 07