細胞外鉀對HERG基因無義突變L539fs/47表達的調控*

呂　穎，　張軍波，　劉仲偉，　張愛峰，　潘軍強，　王軍奎，　潘　碩，　韓穩琦，　孫超峰△

(1陜西省人民醫院心內一科，陜西 西安 710068；2西安交通大學第一附屬醫院心內科，陜西 西安 710061；3西安交通大學第二附屬醫院心內科，陜西 西安 710004)

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細胞外鉀對HERG基因無義突變L539fs/47表達的調控*

呂穎1，張軍波2，劉仲偉1，張愛峰3，潘軍強1，王軍奎1，潘碩1，韓穩琦2，孫超峰2△

(1陜西省人民醫院心內一科，陜西 西安 710068；2西安交通大學第一附屬醫院心內科，陜西 西安 710061；3西安交通大學第二附屬醫院心內科，陜西 西安 710004)

[摘要]目的： 研究持續細胞外鉀對野生型HERG與其突變體L539fs/47蛋白表達的影響。方法: 用脂質體轉染法將野生型HERG(WT)及其突變體HERG-L539fs/47(MT)分別轉染HEK293細胞36 h后，0.8、4.3及10 mmol/L的鉀干預6 h，流式細胞術檢測HERG蛋白表達量；干預12 h用激光共聚焦成像和免疫印跡法進行HERG蛋白定位及表達量檢測。結果: 用激光共聚焦成像檢測發現野生型HERG蛋白主要分布在細胞膜上；而HERG突變體L539fs/47蛋白大部分滯留胞漿；并且HERG蛋白的表達均隨細胞外鉀濃度升高而增多。流式細胞術結果顯示細胞外高鉀組熒光增多(P<0.01)，WT組熒光陽性細胞百分比和熒光強度均高于MT組(P< 0.05)。免疫印跡顯示，不同于野生型 HERG 135 kD及155 kD 2個條帶，突變體僅60 kD 1個條帶，3個條帶均受細胞外鉀影響(P< 0.05)。結論: 細胞外高鉀增強細胞膜上野生型和突變型HERG通道蛋白的穩定性，持續低鉀干預時間依賴性地減少HERG通道蛋白的表達。

[關鍵詞]HERG基因； 無義突變； 細胞外鉀； HEK293細胞

心臟離子通道病先天性長QT綜合征(long QT syndrome，LQTS)是一種由于編碼心肌離子通道蛋白的基因突變導致心肌細胞復極異常而引起的臨床綜合征，常見年輕人的家族性惡性室性心律失常，表現為尖端扭轉型室性心動過速(torsades de pointes，TdP)、暈厥和猝死。受關注藥物引起的LQTS其發生亦具有遺傳背景[1]。LQTS的患病率為1/2 500至1/2 000，分為LQT1～LQT13亞型。我國以LQT2為主，占已知LQTS的45 %[2]。

快速激活延遲整流鉀通道(rapid delayed rectifier potassium channel， IKr)在心臟動作電位復極化過程中發揮重要作用，其突變導致LQT2。HERG基因編碼IKr的α亞基形成四聚體后，與β亞基共同組成IKr。HERG蛋白在粗面內質網中核心糖基化成135 kD大小，再經過高爾基體進一步復合糖基化為155 kD成熟蛋白，組裝成四聚體后轉運到細胞膜，發揮生理功能；每個α亞基有6個跨膜片段、1個孔區以及氨基和羧基末端[1]。2007年[3]從一個LQTS家系中發現了父系遺傳的HERG第7外顯子cDNA第1 619～1 637核苷酸位點存在缺失突變，導致位于第586位氨基酸提前出現終止密碼子，產生大片段丟失的截短蛋白質，肽鏈終止于S4區域前，命名為L539fs/47。

在病理狀態下，心肌細胞外以低鉀為主的慢性電解質紊亂很常見。既往對鉀離子與LQT2的研究多集中在快速增加細胞外K+以減少HERG通道的失活，造成功能降低方面，以及近年來還發現生理濃度范圍內提高細胞內K+濃度能穩定HERG通道蛋白從內質網輸出。這2種機制的差異提出了一個重要的問題[4]，即目前多研究急性低鉀是否直接引起HERG功能抑制，而忽略了抑制HERG蛋白轉運的因素，對使已經成功轉運到膜上的HERG蛋白向細胞內逆向轉運、降解的環境及藥物因素鮮有研究。另外，對細胞外鉀濃度持續變化時HERG離子通道蛋白表達時間相關的調控研究甚少，對鉀濃度持續改變下HERG突變體蛋白表達和轉運的研究值得關注。

材料和方法

1試劑和儀器

質粒野生型pcDNA3-HERG (WT) 和突變體pcDNA3-L539fs/47(MT)由本實驗室張愛峰博士提供；pEGFP-C2-WT(本實驗室霍建華博士提供)；pEGFP-C2-MT(本實驗室前期自行構建[5])；pDsRed2-ER(Clontech)；HEK293細胞(本實驗室提供)；含4.3 mmol/L鉀離子的高糖型DMEM培養基及胎牛血清(HyClone)；X-tremeGENE HP DNA轉染試劑(Roche)；兔抗人HERG-N端單克隆抗體(Sigma)；HRP標記的山羊抗兔IgG II 抗(Thermo)；其它均為國產分析純試劑。低鉀(0.8 mmol/L)DMEM培養基采用高糖型DMEM培養基，選用國產分析純試劑配制：添加氯化鉀74.42 mg，溶解于1 L去離子水中，補加3.7 g NaHCO3，混勻后分別加入0.1 U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素，將pH值調至7.2，經雙層0.22 μm濾膜過濾除菌后，分裝后-20 ℃冰箱保存。配制高鉀(10 mmol/L)DMEM培養基：正常鉀濃度的DMEM 100 mL加入10% KCl 435 μL。

TCS SP2型激光掃描共聚焦顯微鏡(Leica)；FASCalibur流式細胞儀；2000型凝膠成像系統(Bio-Rad)。

2方法

2.1細胞培養用DMEM高糖型培養基加10%胎牛血清在37 ℃、5% CO2條件下培養HEK293細胞。

2.2細胞轉染6孔板中HEK293細胞密度調整至40%～50%后，FuGENE? HD轉染劑(質粒總量選取4 μL∶2 μg比例轉染)。

2.3激光共聚焦成像在96孔板中，將pEGFP-C2-MT(綠色)或pEGFP-C2-WT(綠色)0.75 μg、內質網指示質粒pDsRed2-ER(紅色)0.25 μg、無血清DMEM 50 μL和轉染劑1 μL室溫預混孵育15 min，加入HEK293細胞的24孔板中。轉染36 h后，分為3組，分別換成含10%胎牛血清的低鉀(0.8 mmol/L)、正常鉀(4.3 mmol/L)和高鉀(10 mol/L)DMEM培養基孵育12 h后，4%的多聚甲醛固定；碳酸甘油緩沖液封片后，分別用波長488 nm和633 nm激光分別激發綠色和紅色熒光，在激光共聚焦顯微鏡下觀察。

2.4流式細胞計數35 mol/L培養皿中HEK293細胞貼壁生長至60%～70%時，轉染pEGFP-C2-WT或pEGFP-C2-MT后36 h，3組不同鉀濃度(0.8、4.3和10 mmol/L)DMEM培養基孵育6 h，消化后用PBS懸浮細胞，調整濃度1×105～1×107/L，流式細胞術檢測EGFP-WT或EGFP-MT融合蛋白的表達量。

2.5免疫印跡實驗將pcDNA3-WT或pcDNA3-WT+pcDNA3-MT轉染進野生組及雜合組HEK293細胞36 h后，3種濃度鉀干預12 h，提取蛋白變性后保存。濃縮膠80 V，20～30 min，8 %分離膠120 V，60～90 min，兔抗人 I 抗(1∶200稀釋)，4 ℃過夜，TBST稀釋HRP標記的 II 抗(山羊抗兔 II 抗1∶3 000稀釋)，室溫2 h，HRP化學發光法顯影。

3統計學處理

使用SPSS 15.0軟件進行統計學分析，GraphPad Prism 5軟件進行作圖。計量資料采用均數±標準差(mean±SD)表示， WT組和WT+MT組間比較采用t檢驗；各濃度亞組間采用單因素方差分析，各亞組之間兩兩比較用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1激光共聚焦成像檢測野生型及突變HERG蛋白的定位

pEGFP-C2-WT和pEGFP-C2-MT分別與特異性定位于內質網的pDsRed2-ER共轉染HEK293細胞(圖1)，HERG-WT和HERG-MT分別與EGFP形成融合蛋白后，經藍光模式激發顯示細胞膜呈綠色光滑線型熒光圖像，分別與pDsRed2-ER質粒(紅色，僅在胞漿的內質網中表達)重疊后，可見“綠包紅”(綠色熒光包繞在紅色熒光外周)。EGFP-WT融合蛋白綠色熒光主要位于細胞膜上；表達的EGFP-MT截短突變蛋白熒光部分位于胞漿中，部分位于細胞膜上。突變通道蛋白膜分布減少，胞質內蛋白增加，且與內質網共定位，說明突變通道蛋白由于轉運障礙而部分被滯留在內質網內。

Figure 1.Localization of WT and MT EGFP-HERG fusion channel proteins by laser scanning confocal microscopy.

圖1激光共聚焦顯微鏡定位野生型及突變型EGFP-HERG融合通道蛋白

2激光共聚焦成像檢測不同細胞外鉀濃度干預后野生型及突變HERG蛋白的表達

低、中、高3組細胞外鉀干預12 h后，高鉀組EGFP-WT蛋白在細胞膜上分布最多；高鉀組EGFP-MT截短突變蛋白表達亦最多，見圖2。

Figure 2.The expression of EGFP-MT and EGFP-WT under different concentrations of extracellular potassium detected by green fluorescence.

圖2綠色熒光顯示不同細胞外鉀濃度下EGFP-WT及EGFP-MT的表達

3流式細胞術結果

pEGFP-C2-WT及pEGFP-C2-MT轉染HEK293細胞36 h，再經0.8、4.3和10 mmol/L 3個濃度鉀干預6 h后，流式細胞術檢測結果表明EGFP-WT的陽性細胞百分比和熒光強度均高于EGFP-MT的陽性細胞。通道右側信號的熒光強度明顯高于左側，越靠右側熒光強度越高。WT組與MT組間比較，WT組EGFP熒光陽性細胞百分比和熒光強度均高于MT組(P<0.05)。WT組和MT組EGFP熒光陽性細胞百分比均隨細胞外鉀濃度升高而增多(P<0.01)；WT組和MT組GFP熒光強度也隨鉀濃度升高而增多(P< 0.01)。此外，各不同濃度鉀處理組間差異均有統計學意義(P<0.01)，見圖3、4。

Figure 3.The percentage of positive cells and fluorescence intensity of EGFP-HERG under different concentrations of extracellular potassium detected by flow cytometry. Mean±SD.n=6.#P<0.05vsMT;**P<0.01vs0.8 mmol/L K+;△△P<0.01vs4.3 mmol/L K+.

圖3不同細胞外鉀濃度下EGFP-HERG陽性細胞百分比和熒光強度的變化

4Western blot實驗結果

代表野生型HERG 2次糖基化的155 kD和135 kD條帶及代表突變體L539fs/47的60 kD條帶在高鉀組表達最多。低鉀組155 kD及60 kD條帶幾乎消失，見圖4。

Figure 4.HERG protein bands of WT and WT+MT groups under different concentrations of extracellular potassium detected by Western blot. Mean±SD.n=6.*P<0.05vs0.8 mmol/L K+.

圖4不同細胞外鉀濃度下WT和WT+MT組HERG蛋白的表達

討論

自從Fisch于1973年首次提出了電解質和心律失常的相關性以來，大量研究發現細胞外低鉀與LQT相關。早前發現低鉀可誘發85%小鼠產生心肌早期后除極。林加鋒等[6]對64例發生室性早搏誘發的惡性快速性室性心律失常患者研究，發現43.8%是由低鉀低鎂血癥伴LQTS誘發；嚴重低鉀血癥時，溫和的LQTS突變可能表現出臨床癥狀。

ACC、AHA和ESC 2006室性心律失常治療與心臟猝死預防指南對于藥物引起的心律失常建議補鉀治療，將血鉀維持4 mmol/L以上(推薦等級Ⅱa、證據等級C)[7]。2010年進一步建議將血鉀維持在4.5～5.0 mmol/L左右[8]。補鉀提高血清鉀水平可能對LQTS患者治療有益，尤其是在LQT2患者[9]。通過短期及長期[9]補充外源性鉀可改善受損的IKr功能，增加外向鉀電流和縮短復極，糾正LQT2患者復極時間、QT離散度等心電圖異常表現。補鉀治療也可能是對一些獲得性LQTS的治療有效[10]。

既往細胞層面對鉀離子與LQT2的研究多集中在快速增加細胞外K+以減少HERG通道的失活，促使可用性通道的數目增加，從而增大電流，近年來還發現生理濃度范圍內提高細胞內K+濃度可穩定HERG通道蛋白從內質網輸出[11]。而慢性細胞外鉀濃度與HERG離子通道蛋白表達時間相關的調控研究甚少。

與Zhang等[12]的研究一致，L539fs/47蛋白可表達于細胞膜，部分滯留于胞漿。與既往研究不同的是，Guo等[13]近年來證實細胞外K+濃度對通道失活的調節作用有限；急性細胞外低鉀時，HERG通道進入了一種新的“不導電狀態”，不同于電壓依賴失活狀態及藥物阻滯狀態。此外，這種不導電狀態繼而觸發細胞表面的鉀通道快速向細胞內轉運及降解。由于門控狀態與HERG通道細胞膜穩定性之間的直接聯系，他們首次提出細胞表面的HERG蛋白密度是由細胞外鉀調控。進一步研究更為重要的持續低鉀對HERG通道的影響揭示，在家兔心臟和人類HEK293細胞系中，0 mol/L的細胞外鉀濃度負性控制細胞表面HERG蛋白表達量。共聚焦成像分析表明在向細胞內轉運過程中，細胞外低鉀促進泛素過度表達，通道蛋白被聚集到溶酶體，HERG蛋白發生降解。恢復細胞外的鉀濃度至5 mmol/L，HERG通道的“不導電狀態”及向細胞內轉運狀態均可逆，可以重新獲得細胞膜上的功能性通道；而已進入降解程序的通道蛋白無法恢復。

本研究中激光共聚焦成像、流式細胞術及免疫印跡結果均支持細胞外鉀濃度是HERG通道功能和膜穩定性的先決條件，細胞外相對高鉀可以防止HERG通道進入不導電狀態，從而保持蛋白停留在細胞膜。低鉀時野生及突變的3個條帶表達均較正常鉀組明顯減少，同慢性低鉀促使通道蛋白向細胞內逆向轉移及繼發降解有關。而高鉀時3個條帶表達均較正常鉀組明顯增多，除抑制逆向轉運及繼發降解外，還可能與高鉀穩定HERG蛋白結構并促進前向轉運至膜上，避免被降解相關。此外，低鉀介導HERG通道蛋白的構像缺陷，阻斷HERG轉運至細胞膜。如Wang等[11]發現強心甙過夜孵育，通過直接抑制Na+-K+-ATP酶，耗盡細胞內K+，誘發LQTS，而通過滲透作用增加細胞內的K+或 Rb+，可以恢復HERG轉運。

細胞外持續低鉀促使通道蛋白時間依賴性向細胞內轉運，0 mol/L 細胞外鉀培養下可在3 h內使HERG完全內化，在4 h內開始降解，12 h降解達峰，使轉染野生型HERG的HEK細胞IKr密度降低，電流減少[14]。與此一致，本研究中免疫印跡發現低鉀干預12 h后155 kD和60 kD蛋白從細胞膜上向胞漿中轉運后充分降解，而低鉀干預6 h后流式細胞術顯示蛋白部分降解，未達到峰值[14]。

簡言之，細胞膜上的通道密度是全細胞電流大小的一個關鍵性決定因素。本研究通過激光共聚焦成像觀察證實HERG大片段無義突變體L539fs/47部分滯留胞漿，部分糖基化后可能與HERG-WT形成異源四聚體，定位于細胞膜上；再通過激光共聚焦成像、流式細胞術和免疫印跡證實，同HERG-WT一樣，細胞外相對高鉀增強HERG-L539fs/47穩定性，使其在細胞膜分布增多；而慢性低鉀干預時間依賴性地減少HERG通道蛋白表達。研究細胞外鉀離子相對慢性的調節過程中突變HERG通道的蛋白表達、轉運及功能的改變，可能為臨床低鉀誘發LQT2惡性心律失常的機制研究及治療提供分子生物學證據。

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(責任編輯： 林白霜， 羅森)

Effects of extracellular potassium on expression ofHERGgene nonsense mutant L539fs/47Lü Ying1, ZHANG Jun-bo2, LIU Zhong-wei1, ZHANG Aai-feng3, PAN Jun-qiang1, WANG Jun-kui1, PAN Shuo1, HAN Wen-qi2, SUN Chao-feng2

(1TheFirstDepartmentofCardiovascularMedicine,ShanxiProvincialPeople’sHospital,Xi’an710068,China;2DepartmentofCardiovascularMedicine,TheFirstAffiliatedHospital,MedicalCollegeofXi’anJiaotongUniversity,Xi’an710061,China;3DepartmentofCardiovascularMedicine,TheSecondAffiliatedHospital,MedicalCollegeofXi’anJiaotongUniversity,Xi’an710004,China.E-mail:csun1@163.com)

[ABSTRACT]AIM: To study the effects of extracellular potassium on the protein expression of wild- type HERG and its mutant L539fs/47. METHODS: Wild-type HERG (WT) or its mutant HERG-L539fs/47 (MT) were transfected into HEK293 cells for 36 h. The cells were incubated in different media containing 0.8, 4.3 or 10 mmol/L potassium. After 6 h of incubation, the protein expression of HERG was detected by flow cytometry.After 12 h of incubation, the localization and quantity of the proteins were detected by laser confocal imaging and Western blot. RESULTS: Different from the retention of mutant protein in cytoplasm, wild-type HERG protein was mainly distributed in the cell membrane. The 2 proteins both increased with the changes of extracellular potassium. Flow cytometry showed that the fluorescence in the 2 groups both increased with the changes of extracellular potassium (P<0.01). The fluorescence in WT group was significantly higher than that in MT group (P<0.01). Western blot showed that mutant HERG protein included only one 60 kD band, different from the 135 kD and 155 kD bands in wild-type HERG, which were affected by the changes of extracellular potassium (P<0.05). CONCLUSION: The retention of HERG mutant L539fs/47 protein in the cytoplasm is more than wild-type HERG. Chronic high extracellular potassium keeps the stability of wild-type and mutant HERG proteins on the cell membrane. Chronic low potassium reduces the expression of HERG channel proteins in a time-dependent manner.

[KEY WORDS]HERGgene; Nonsense mutation; Extracellular potassium; HEK293 cells

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.02.006

[中圖分類號]R541.7； R363

[文獻標志碼]A

通訊作者△Tel: 029-85323809; E-mail: csun1@163.com

*[基金項目]國家自然科學基金資助項目(No. 30800473)

[收稿日期]2015- 06- 03[修回日期] 2015- 12- 24

[文章編號]1000- 4718(2016)02- 0228- 06