CaSR在淫羊藿苷誘導的胚胎干細胞向心肌細胞分化中的作用*

孫　健，　白淑芝，　李　爽，　許曉義，　袁　輝，　魏　韜，　徐長慶，　欒海蓉△

(1牡丹江醫學院，黑龍江 牡丹江 157011；2哈爾濱醫科大學病理生理教研室，黑龍江 哈爾濱 150081)

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CaSR在淫羊藿苷誘導的胚胎干細胞向心肌細胞分化中的作用*

孫健1，白淑芝2，李爽1，許曉義1，袁輝1，魏韜1，徐長慶2，欒海蓉1△

(1牡丹江醫學院，黑龍江 牡丹江 157011；2哈爾濱醫科大學病理生理教研室，黑龍江 哈爾濱 150081)

[摘要]目的： 觀察鈣敏感受體(calcium sensing receptor，CaSR)對淫羊藿苷(ICA)誘導小鼠胚胎干細胞向心肌細胞分化的影響。方法: 129小鼠ES-D3細胞經直接懸浮法形成擬胚體(EBs)，應用ICA定向誘導，透射電鏡觀察分化細胞的超微結構;免疫熒光和Western blot分別檢測細胞有無α-輔肌動蛋白(α-actinin)和肌鈣蛋白I(cTnI)的表達；流式細胞術檢測細胞分化率；Western blot檢測心肌特異轉錄因子NKx2.5、GATA-4和CaSR的蛋白表達。結果: ICA誘導2 d后，可見自發性收縮的細胞簇;隨著誘導分化時間的延長，α-actinin和cTnI蛋白的表達逐漸增多；CaSR、NKx2.5和GATA-4蛋白在分化早期表達最多，持續表達至晚期；電鏡觀察分化細胞中可見連接結構、肌絲;CaSR激動劑新霉素能夠增加早期EBs中CaSR、NKx2.5和GATA-4的表達，CaSR抑制劑NPS2390能夠阻斷上述作用。結論: CaSR在胚胎干細胞分化的心肌細胞中有表達，CaSR活化可通過增加NKx2.5和GATA-4的表達促進心肌細胞的分化。

[關鍵詞]鈣敏感受體； 淫羊藿苷; 細胞分化； 心肌細胞

由于成熟的心肌細胞缺乏再生能力，一旦損傷只能由瘢痕替代，嚴重影響心臟的功能甚至導致心力衰竭。胚胎干細胞(embryonic stem cells，ESCs)具有增殖和分化的全能性[1]，是一種很有實用價值的、理想的心肌細胞移植療法的有效來源。揭示促進ESCs向心肌細胞定向分化并提高轉化率是亟待解決的問題。

本課題組前期研究表明，鈣敏感受體(calcium sensing receptor，CaSR)在小鼠胚胎干細胞(mouse embryonic stem cells，mESCs)有表達，其活化可以增加細胞內鈣離子濃度[2]。但其對胚胎干細胞向心肌細胞定向分化的影響及機制，迄今尚不清楚。淫羊藿苷(icariin，ICA)是一個新型的生物反應調節劑和分化劑，有研究報道在體外淫羊藿苷可誘導小鼠胚胎干細胞向心肌細胞分化[3-4]。因此，本文以mESCs為觀察對象，通過淫羊藿苷誘導，對上述尚未解決的問題開展研究。

材料和方法

1材料

小鼠胚胎干細胞株129小鼠ES-D3細胞株CRL-11632購于ATCC；胎牛血清購自Gibco；小鼠白血病抑制因子購自Chemicon；CaSR、 FITC熒光標記 II 抗購自Sigma；Fluo-3/Am購自Invitrogen；心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin I,cTnI)和α-輔肌動蛋白(α-actinin)抗體購自Santa Cruz。

2方法

2.1ES-D3的培養及向心肌細胞的誘導分化小鼠ES-D3復蘇，第2天換液。2 d后，加入0.25%胰酶-EDTA消化傳代，傳代后選擇生長狀態較好的ESCs克隆充分消化離心后用分化培養基進行重懸，計數后接種于10 cm的細胞培養皿中，每個皿接種10 mL細胞懸液，放置37 ℃、5% CO2培養箱中培養2 d，制備擬胚體(embryoid bodies，EBs)。胚體懸浮培養5 d后，按每孔10個胚體數量接種于6孔板進行胚體貼壁培養及誘導，每板分別設ICA組及實驗組各3孔，培養并每天觀察。

2.2免疫熒光分析預冷0.1 mol/L PBS沖洗各組細胞，4%多聚甲醛固定30 min，1%山羊血清封閉30 min；分別用抗CaSR、cTnI和α-actinin抗體(1∶50)孵育，4 ℃過夜，陰性對照用0.1 mol/L PBS代替 I 抗；0.1 mol/L PBS沖洗3次；FITC標記的IgG(1∶50)37 ℃孵育1 h；PBS沖洗3次，核用DAPI復染。熒光顯微鏡觀察并拍照。

2.3Western blot法檢測鈣敏感受體和心肌特異轉錄因子Nkx2.5、GATA-4的表達將待提取蛋白的細胞吸去培養液，置于冰上，預冷PBS清洗3次；吸去PBS，加入適量RIPA裂解液，冰上孵育30 min，BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，SDS-PAGE分離蛋白，電壓100 V；電流300 mA，冰浴中轉膜90 min。加入 I 抗，室溫振蕩孵育1 h，4 ℃過夜。洗膜后TBST稀釋各相應 II 抗，室溫振蕩孵育1 h；堿性磷酸酶法顯色，凝膠成像系統下拍照。

2.4電鏡技術取貼壁培養早期(貼壁后5 d)、中期(貼壁后10 d)、晚期(貼壁后17 d)的細胞，預冷PBS懸浮后2 000 r/min離心10 min，使細胞形成團塊。2.5% 戊二醛4 ℃固定細胞2 h，常規脫水、透明、包埋、染色后制成50～70 nm的超薄切片，透射電鏡下觀察各細胞超微結構的變化，拍照。

2.5流式細胞術mESCs誘導分化的第12天，1%多聚甲醛固定后，預冷的0.1 mol/L PBS沖洗EBs 3次，使之分離成單細胞的懸浮液。cTnI(1∶100)孵育4 ℃過夜，FITC標記抗兔IgG 37 ℃ 1 h，流式細胞術檢測cTnI表達陽性的心肌細胞所占的百分比。

3統計學處理

數據用均數±標準差(mean±SD) 表示，統計學處理使用SPSS 17.0統計軟件, 采用單因素方差分析比較均數間差異，多重比較應用Bonferroni校正的t檢驗，以P<0.05 為差異有統計學意義。

結果

1mESCs的誘導分化

生長在瓊脂上未分化的單個mESCs較小，呈圓形。懸浮培養 2 d后，mESCs聚集成EBs，呈立體球形結構。隨著培養時間的延長，EBs進一步成熟，體積增大，邊界較光滑，中間細胞密度相對較大，顏色較深。5 d后將EBs轉移到明膠鋪被的培養皿貼壁生長。2～3 d可見自發性節律性收縮的細胞群，跳動頻率約20～60 beats/min，分化中期可達70～100 beats/min，1個EBs可包含1個或者多個收縮中心，表明心肌細胞已經分化；高倍鏡下可觀察到纖維狀的細胞群，見圖1。

2ICA誘導mESCs分化的心肌細胞超微結構

透射電鏡下可看到分化細胞胞漿內內質網發達，合成功能增強，含有豐富的線粒體、粗面內質網等細胞器外，可以看到大量成束的肌絲，細胞間的橋粒和緊密聯接等連接結構，見圖2。

Figure 1.The differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) into cardiomyocytes. A: undifferentiated mESCs in agar (×200); B: 2 days EBs in suspension method (×100); C: 4 d EBs in suspension method (×100); D: beating cells of cardiac clusters derived from EBs with ICA induction (×200, rectangular frames refereed to the contracting areas).

圖1小鼠ES細胞分化為心肌細胞的形態學變化

Figure 2.The ultrastructural alteration of differentiation cells under transmission electronic microscope. A: the bundles of myofilaments were observed in the cytoplasm; B: the arrow indicates the closely connected (rectangular frame refereed to desmosome).

圖2透射電鏡下分化細胞的超微結構變化

3心肌特異性蛋白α-actinin和cTnI在ICA誘導的mESCs分化的心肌細胞的表達

免疫熒光原位檢測心肌特異性結構蛋白α-actinin和cTnI的表達，結果顯示EBs內表達大量α-actinin或cTnI，FITC可被激發出綠色熒光，DAPI可將細胞核染成藍色，當用PBS代替 I 抗時，沒有陽性染色，見圖3。

Figure 3.The expression of cardiac-specific proteins in mESC-derived cardiomyocytes (mESC-CMs) was detected by immunofluorescence (×200).

圖3通過免疫熒光檢測心肌特異性蛋白在mESC-CMs的表達

Western blot結果顯示在貼壁培養的第1天(d1)α-actinin表達量較低，而cTnI幾乎不表達。隨著分化時間的推移，α-actinin和cTnI表達逐漸升高，其中在分化第9天(d9)顯著增強，在分化第13天(d13)達到較高水平，之后變化不大，見圖4。

4心肌CaSR蛋白和特異性轉錄因子GATA-4、Nkx2.5的表達

EBs進行貼壁培養后第 1 d(即分化d1)，心肌CaSR蛋白和特異性轉錄因子Nkx2.5、GATA4均有表達，繼續貼壁培養，三者的表達均相應增加。結果還發現在mESCs分化為心肌細胞過程中，CaSR、Nkx2.5和GATA-4表達具有一定的規律性，都是在d5達到高峰，之后略有下降，見圖5。

5CaSR活化對mESCs向心肌細胞分化的影響

流式細胞術檢測結果顯示，在ICA組、0.4 mmol/L新霉素和0.01 mmol/L NPS2390組，cTnI陽性細胞分別占總數的(14.97±0.80)%、(25.82±2.41)%和(10.26±0.16)%，經過Bonferroni法進行校正檢驗后發現各組間差異具有統計學顯著性(P<0.05)，見圖6。

Figure 4.The expression of α-actinin and cTnI in the differentiated cells by Western blot. Mean±SD.n=3.★P<0.05vsd1 group.

圖4Western blot檢測誘導分化細胞的α-actinin和cTnI蛋白表達

Figure 5.The expression of Nkx2.5, GATA-4 and CaSR in differentiated cells by Western blot.Mean±SD.n=3.★P<0.05vsd1 group.

圖5Western blot檢測誘導分化細胞Nkx2.5、GATA-4 和CaSR蛋白的表達

6CaSR活化對Nkx2.5和GATA4蛋白表達的影響

Western blot結果表明，用CaSR的激動劑0.4 mmol/L新霉素處理24 h后，GATA-4 和Nkx2.5蛋白的表達均較對照組增多(P<0.05)；而抑制劑NPS2390對其具有抑制作用，阻斷了激動劑的作用，見圖7。

討論

心肌細胞是終末分化細胞，不可再生，細胞移植可以用來修復損傷或死亡的心肌細胞，以改善心臟功能，是一種潛在的很有實用價值的治療措施[5]。ESCs是具有多向分化潛能的全能干細胞，在培養過程中能分化成包括自發性搏動心肌細胞在內的3個胚層的所有體細胞[6]。提高ESCs向心肌細胞的定向分化率并揭示其機制，日益受到心血管領域科學工作者的關注。

體外誘導mESCs定向分化為心肌細胞主要是通過形成EBs的方法，本實驗采用直接懸浮法，同時選擇傳統中藥ICA做誘導劑，可以形成大量的EBs為后續實驗提供便利。有研究發現在ESCs向心肌細胞分化的過程中，心肌細胞特異性肌小節蛋白依次表達，其中出現較早的是輔肌動蛋白，出現較晚的是肌鈣蛋白。其中心肌肌鈣蛋白Ⅰ是心室和心房細胞中典型的蛋白，在較晚期才有少量表達，這與早期胚胎內心肌發育過程一致。本實驗采用免疫熒光法檢測α-actinin和cTnI的表達情況，結果顯示mESCs誘導分化的細胞中α-actinin和cTnI呈陽性表達；Western blot檢測結果顯示，在整個心肌誘導分化過程中，α-actinin表達量都保持在較高水平，并且晚期明顯高于早期；而cTnI在分化的早期表達較少，在分化中晚期逐漸升高。這與前人的研究成果相似[4, 7]。說明在誘導分化過程中，隨分化進程的進展心肌特異性結構蛋白的合成逐漸增多，符合胚胎心臟發育的規律。同時本實驗電鏡超微結構的結果顯示隨著誘導分化進程的發展，細胞內出現大量與心肌細胞功能相適應的細胞器，如線粒體、內質網、高爾基體、糖原等(結果未顯示)。分化至晚期階段，細胞質內可以看到大量成束的肌絲，新生的“Z線”及細胞間的橋粒和緊密聯接等連接結構，此時肌絲具有肌節的功能，電鏡超微結構的結果進一步說明誘導mESCs分化細胞的結構與正常心肌細胞的結構相似。

Figure 6.The effect of CaSR activation on differentiation of mouse embryonic stem cells into cardiomyocytes. Expression of cardiac-specific marker protein cTnI expression in the EBs by flow cytometry. The red dots indicate cTnI-positive cells (in R2 region). The X-axis and Y-axis corresponded to the fluorescence intensity and the number of cells per channel (events), respectively.

圖6CaSR活化對小鼠胚胎干細胞向心肌細胞分化的影響

Figure 7.The effect of CaSR activation on GATA-4 and Nkx2.5 expression.n=3.★P<0.05vscontrol group.

圖7CaSR活化對GATA-4和Nkx2.5表達的影響

ESCs分化為心肌細胞是一個復雜的過程，需要多種信號活動的協調[8]。大量轉錄因子均參與了心臟發育過程的調控, 如GATA-4、 Nkx2.5、Pitx2等。其中Nkx2.5、GATA-4是影響心臟發育2個最為重要的轉錄因子，且二者具有協同作用，調控著眾多下游基因的準確表達。本實驗中采用Western blot法檢測了ICA誘導mESCs分化不同時段二者蛋白的表達，結果顯示在細胞分化早期即在貼壁誘導1 d都有表達，5 d達到高峰，在依次檢測的各個時點，表達雖然有下降，但仍保持著高表達狀態。由此可以證明，心肌特異性轉錄因子Nkx2.5和GATA-4在mESCs向心肌細胞分化早期即有表達，從而激活其它如ANF、心臟α-actinin等基因的表達，促進心肌細胞的繼續分化和完善。

本實驗應用Western blot 檢測CaSR在分化不同時點的表達。實驗結果顯示，與Nkx2.5和GATA-4的表達情況類似，在分化第 5天 CaSR蛋白表達最高，其它時點表達量有所降低，但仍保持較高水平。因此判斷CaSR在mESCs向心肌細胞分化早期發揮其作用。

細胞內鈣離子信號調節許多細胞功能和器官發育。已有文獻報道，細胞內Ca2+通過CaSR在多種細胞的分化和增殖中發揮重要作用[9-11]。為了觀察CaSR活性改變對mESCs向心肌細胞分化的影響，本研究根據分化細胞不同時點CaSR蛋白的表達情況，選擇了在貼壁培養的1 d分別加入CaSR激動劑新霉素和抑制劑NPS-2390作為干擾因素，探討CaSR在mESCs向心肌細胞分化中的作用。本實驗發現，和ICA組相比，新霉素能顯著增加心肌細胞跳動率、cTnI陽性細胞的百分比及早期分化細胞中CaSR、Nkx2.5和GATA-4蛋白的表達，但上述效應可以被NPS-2390抑制。這些結果提示CaSR激活能促進mESCs向心肌細胞的分化，并且是通過促進轉錄因子Nkx2.5和GATA-4表達而實現的。

總而言之，本部分研究說明在mESCs向心肌細胞分化的過程，激活CaSR可以通過促進轉錄因子Nkx2.5和GATA-4表達而促進定向轉化，為如何提高ESCs細胞定向誘導分化為心肌細胞的分化率，提供了一個有價值的理論依據。

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(責任編輯： 陳妙玲， 余小慧)

Roles of calcium sensing receptor in icariin-induced differentiation of mouse embryonic stem cells to cardiomyocyteSUN Jian1, BAI Shu-zhi2, LI Shuang1, XU Xiao-yi1, YUAN Hui1, WEI Tao1, XU Chang-qing2, LUAN Hai-rong1

(1MudanjiangMedicalCollege,Mudanjiang157011,China;2DepartmentofPathophysiology,HarbinMedicalUniversity,Harbin150081,China.E-mail:vivian7835@163.com)

[ABSTRACT]AIM: To study the effect of calcium sensing receptor (CaSR) on icariin (ICA) induced mouse embryonic stem cells (mESCs) to differentiate into cardiomyocytesinvitro. METHODS: mESCs were cultured to embryoid bodies (EBs) by direct suspension method and the differentiation of EBs into cardiomyocytes was induced by ICA. The expression of cardiac specific proteins α-actinin and cardiac troponin-I (cTnI) was analyzed by Western blot and immunofluorescence. The differentiation rate was determined by flow cytometry. The ultrastructure of the derived cardiomyocytes was further characterized by transmission electron microscopy. The expression of cardiac-specific transcription factors Nkx2.5 and GATA-4,as well as CaSR was detected by Western blot. RESULTS: After induction with ICA, the positive characteristics of myocardial cells appeared in the EBs cultured for 2 d. The expression of cardiac-specific sarcomeric protein actinin (α-actinin) and cTnI showed an overall upward trend by Western blot in different phases of ICA induced differentiation. The expression of CaSR, Nkx2.5 and GATA-4 was the highest at an early stage of ICA-induced differentiation. Neomycin (an activator of CaSR) up-regulated CaSR, NKx2.5 and GATA-4 expression in the EBs at early stage of ICA-induced differentiation, all of which were reversed by NPS2390 (an inhibitor of CaSR).CONCLUSION: CaSR is functionally expressed in mESC-derived cardiomyocytes, and activation of CaSR is involved in the differentiation of mESCs into cardiomyocytes by facilitating the expression of NKx2.5 and GATA-4.

[KEY WORDS]Calcium sensing receptors; Icariin; Cell differentiation; Cardiomyocyte

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.02.007

[中圖分類號]R363.2

[文獻標志碼]A

通訊作者△Tel: 0453-6582302; E-mail: vivian7835@163.com

*[基金項目]國家自然科學基金資助項目(No.81300163； No.81200160)；黑龍江省教育廳科學技術研究項目(No.12531749； No.12531731)；牡丹江醫學院科學研究項目(No.IS201308)

[收稿日期]2015- 07- 27[修回日期] 2015- 11- 11

[文章編號]1000- 4718(2016)02- 0234- 06