脾氣虛證模型大鼠中BNP介導的cAMP-PKA信號通路對bFGF表達的影響*

姜曉琳，　張立德

(遼寧中醫藥大學，遼寧 沈陽 110032 )

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脾氣虛證模型大鼠中BNP介導的cAMP-PKA信號通路對bFGF表達的影響*

姜曉琳，張立德△

(遼寧中醫藥大學，遼寧 沈陽 110032 )

[摘要]目的： 以脾氣虛證大鼠為研究對象，探討脾氣虛證導致的心功能變化及其機制。方法: 大鼠隨機分為2組，分別為空白對照組及脾氣虛模型組。采用小動物超聲測定2組大鼠的心功能變化；HE染色觀察心肌組織病理學變化；Western blotting法測定心肌中腦鈉肽(BNP)的蛋白表達情況；ELISA法測定血清及心肌中BNP和cAMP含量；real-time PCR測定堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)和蛋白激酶A(PKA)的mRNA表達。結果: 與空白組比較，脾氣虛模型組大鼠心肌細胞發生不同程度壞死及變性，每搏輸出量及射血分數均降低，血清及心肌中BNP和cAMP含量均升高，BNP蛋白表達及bFGF、PKA mRNA表達增加。結論: 脾氣虛可引起大鼠心功能下降，機體BNP、cAMP含量及PKA、bFGF表達均有所增加。

[關鍵詞]脾氣虛證； 心功能； 腦鈉肽； 堿性成纖維細胞生長因子

脾氣虛證為中醫臨床主要證型之一，可因飲食不節、勞倦過度、外感淫邪及久病體虛等多種因素引起，導致患者出現不思飲食、神疲乏力及便溏等臨床癥狀。中醫學歸納脾的功能不僅涵蓋了西醫學的整個消化系統，而且與神經、內分泌、血液、循環、免疫、生殖、運動等系統生理功能密切相關[1]。中醫理論認為，心為脾之母，脾虛日久，子病及母；加之，脾為氣血生化之源，脾虛，生血乏源，血脈不充，可致心血虧虛。由此可見，脾氣虛證可直接或間接引起行血異常，導致心系疾病的發生。借助現代科學技術和方法對脾氣虛證的研究涉及消化吸收、免疫、微循環等系統的功能,結果顯示脾氣虛證的發病為先有運化不足，導致生化乏源，氣血虧虛，此為脾氣虛證的演變過程及與心臟病及老年氣虛證等其它病證的轉變關系[2]。但是脾氣虛證導致心功能改變及其機制研究甚少，本研究以脾氣虛證大鼠為研究對象，探討腦鈉肽(brain natriuretic peptide，BNP)介導的心肌細胞cAMP-PKA信號轉導通路的變化。

材料和方法

1實驗動物、主要試劑和儀器

雄性SD大鼠，體重(200±10)g，由本溪實驗動物中心提供，許可證號SCXK(遼)-2010-0001。

PMSF(博士德);RIPA組織細胞裂解液(Solarbio)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司；化學發光底物(Thermo)； I 抗稀釋液(Beyotime)；I 抗(北京博奧森生物技術有限公司)；II抗(北京中杉金橋生物技術有限公司，批號為150112)；大鼠BNP ELISA試劑盒和大鼠環磷酸腺苷(cAMP)ELISA試劑盒(上海博谷生物科技有限公司)；real-time PCR試劑盒(TaKaRa)。

Vevo2100型高分辨率小動物專用超聲影像系統(VisualSonics)；iMark型酶標儀(Bio-Rad)；7500 real- time PCR儀(Applied Biosystems)；BioSpec-nano型紫外可見分光光度計(島津)；BX51顯微鏡(Olympus)；RM2245型石蠟切片機(Leica)；冷凍離心機(Thermo)；Trans-Blot SD半干轉印、垂直板電泳裝置(Bio-Rad)；FA2004精密天平(上海佑科儀器儀表有限公司)。

2方法

2.1分組及造模動物購回后適應性喂養1周。取SD大鼠30只，隨機分為2組，每組15只，分別為空白對照組和脾氣虛模型組。參考《中藥新藥臨床研究指導原則》[3]和《中醫實驗動物模型方法學》[4]，脾氣虛組造模方法采用飲食不節加力竭游泳法，即先飽食1 d，再禁食2 d，自由飲水，每日于35～37 ℃水溫下游泳至力竭，3 d為1個循環，連續5個循環。以大鼠出現食少、神疲乏力、消瘦、毛色枯槁無光澤及便軟或溏等表現時為脾氣虛證模型建立成功。

2.2心功能檢查采用高分辨率小動物專用超聲影像系統，為大鼠做彩色超聲多普勒心動圖，測定各組大鼠的左室收縮末期容積(end-systolic volume，ESV)、左室射血分數(left ventricular ejection fraction，LVEF)、左室舒張末期容積(end-diastolic volume，EDV)和左室每搏輸出量(stroke volume，SV)，各項數值均經計算機處理后獲得。

2.3心肌組織病理學檢查實驗結束后，各組大鼠禁食24 h，用20%氨基甲酸乙酯溶液將大鼠麻醉，處死后取心臟，用10%甲醛固定，石蠟包埋切片，做常規蘇木精-伊紅(HE)染色，顯微鏡下觀察切片，觀察空白組及模型組大鼠心肌組織病理學變化，并采集圖像。

2.4心肌中BNP的表達采用Western blot法檢測心肌中的BNP蛋白表達。取大鼠心肌組織100 mg放入玻璃勻漿器中，加入1 mL裂解液(蛋白裂解液與PMSF比列為100∶1)，在冰上充分研磨后，吸入到預冷的無菌EP管中，4 ℃下12 000 r/min離心10 min。取上清液，采用BCA試劑盒測定蛋白濃度，蛋白變性后，每孔上樣20 μL，電泳后轉膜3 h，I 抗孵育1 h后，4 ℃ 過夜，次日II 抗孵育1 h后，暗室中加入ECL發光液后，曝光30 min，掃描圖像后分析結果，得到目的蛋白與內參照GAPDH條帶的吸光度比值后，再進行組間比較。

2.5血清及心肌中BNP和cAMP含量于實驗結束后，各組大鼠禁食24 h，給予腹腔注射20%氨基甲酸乙酯溶液，劑量按照0.5 mL/100 g給藥，待其完全麻醉后，腹主動脈取血，離心取血清。取心肌組織，制作組織勻漿液。ELISA測定各組大鼠血清及心肌中BNP和cAMP的含量，按照試劑盒說明書進行操作。

2.6bFGF和PKA的mRNA表達應用real-time PCR方法檢測細胞bFGF和PKA的mRNA 表達。將留取的心肌組織勻漿，提取RNA，并對RNA進行清洗。于清洗后，應用分光光度法檢測RNA濃度和純度，經逆轉錄得到 cDNA 后擴增目的基因。以GAPDH為內參照，其上游引物為5’-TGGGTTTCCCGTTGATGA-3’，下游引物為5’-AGGGCTGCCTTCTCTTGT-3’(產物為161 bp)；bFGF的上游引物為5’-ACCGGTCACGGAAATACTCC-3’，下游引物為5’-CAAGCTCTACCACAGGGGAC-3’(產物為174 bp)；PKA的上游引物為5’-GGTGACAGACTTCGGTTTTGC-3’，下游引物為5’-TAACCAGCAGCCATCTCGT-3’(產物為90 bp)。反應條件為95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s；60 ℃ 30 s，40個循環。根據 NTC 反應有無熒光信號檢出，并結合熔解曲線確認反應體系是否有污染，以GAPDH作為內參照計算樣品中 mRNA的相對表達量。

3統計學處理

采用SPSS 13.0軟件進行統計學處理，數據均采用均數±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)；兩組數據間比較用兩樣本t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1一般情況

分別于實驗前及實驗第3、6、9、15天對脾氣虛模型組大鼠體重進行測量，與實驗前相比，隨著造模時間的逐漸延長，脾氣虛組大鼠體重明顯下降(P<0.05)，見圖1。同時大鼠伴隨不同程度的皮毛粗糙、枯焦無光澤，乏力、蜷臥、游泳時間縮短，足蹼、鼻尖顏色淡紅或蒼白，以及厭食、便溏、喜扎堆等癥狀。

Figure 1.The change of body weight in rats with spleen-qi deficiency syndrome. Mean±SD.n=15.*P<0.05vsbefore modeling.

圖1脾氣虛模型組大鼠體重變化結果

2大鼠心功能的變化

與空白組比較，模型組大鼠心臟左室收縮末期容積明顯升高(P<0.05)；模型組大鼠心臟的左室射血分數、左室舒張末期容積、左室每搏輸出量明顯降低(P<0.05)，結果見圖2、表1。

Figure 2.The ultrasonic images of high-resolutioninvivoimaging system.

圖2小動物超聲影像結果

3心肌組織病理學檢查

從HE染色結果可以看出，空白組大鼠心肌細胞橫紋清晰，纖維結構清楚、排列整齊、無炎癥細胞浸潤；模型組大鼠部分心肌萎縮，細胞排列紊亂、部分細胞核溶解細胞壞死，出現炎癥細胞浸潤，存在細胞渾濁及脂肪變性，見圖3。

4心肌中BNP的表達

Western blot法檢測大鼠心肌組織中BNP蛋白表達的結果顯示，模型組平均吸光度升高，BNP蛋白的表達增強(P<0.05)，見圖4。

表1　小動物超聲影像心功能變化結果

*P<0.05vscontrol group.

Figure 3.The pathological changes of cardiac muscle cells in the rats (HE staining, ×100).

圖3大鼠心肌細胞組織病理學變化

5血清及心肌中BNP和cAMP含量

空白組與脾氣虛模型組大鼠血清及心肌中BNP和cAMP含量測定結果顯示，與空白組比較，模型組大鼠BNP和cAMP的含量在血清及心肌中均明顯升高(P<0.05)，見表2。

6bFGF和PKA的mRNA表達

Real-time PCR的檢測結果表明，目的基因的擴增曲線符合S型曲線，目的基因得到有效擴增。熔解曲線中顯示只有一個峰值，沒有出現雜峰，提示可以使用該體系對目的基因進行定量。模型組bFGF及PKA的mRNA表達水平明顯高于空白組(P<0.05)，見表3。

Figure 4.Determination of BNP in the myocardium by Western blot. Mean±SD.n=15.*P<0.05vscontrol group.

圖4Western blot法測定心肌中BNP

討論

脾胃為后天之本，乃臟象學說的核心。脾，氣血生化之源，主運化水谷，主統血即統攝、控制血液在脈中正常運行的作用，脾氣虛則導致生血乏源。心主血，包括主行血的功能。《血證論》說：“守氣者即是血”，血為氣之母，血脈不充，氣無依附，漂浮無根，故可見心氣虛。心氣虛，推動乏力；加之血脈空虛，導致患者正常生理功能的下降，可出現心功能及心射血能力下降。

脾虛證是中醫較早開展研究的一個證候，而脾虛證動物模型的復制在脾虛證的研究中起著至關重要的作用。造模方法大體上有中醫病因復制方法以及西醫理化因素復制方法，方式上則有單因素、復合因素及多因素等[5]。但很多文獻報道的方法在實施的過程中并沒有得到理想的結果，利血平法雖效果顯著，但屬于理化因素復制，不符合中醫的證候理論[6]。本研究在參照幾種常用的脾虛造模方法，采用勞倦法外加飲食控制，希望以此確定既符合中醫證的特點，又可復制的脾氣虛證動物模型。造模后大鼠呈現皮毛粗糙、枯焦無光澤，乏力、蜷臥、游泳時間縮短，足蹼、鼻尖顏色淡紅或蒼白，以及厭食、便溏、喜扎堆等癥狀，說明造模成功。

表2　大鼠血清及心肌中BNP和cAMP含量

*P<0.05vscontrol group.

表3bFGF和PKA的 mRNA表達水平

Table 3.The mRNA expression levels of bFGF and PKA (Mean±SD.n=15)

GroupbFGFPKAControl1.26±0.051.03±0.12Model1.60±0.09*1.38±0.10*

*P<0.05vscontrol group.

腦鈉肽是心室容量負荷和壓力負荷增大時心肌細胞釋放的一種激素，具有利鈉、利尿、舒張血管作用，在心功能不全時可拮抗交感神經、抗利尿激素和腎素-血管緊張素-醛固酮系統等神經內分泌因素的過度激活，從而起到維護心功能的作用，機械性牽張是心肌細胞合成和分泌BNP的主要機制[7]。近年研究發現心房鈉尿肽(atrial natriuretic peptide，ANP)和BNP等神經內分泌激素水平在心臟負荷過重或心臟擴大時分泌增加[8]，BNP的合成主要在心室，心衰時室壁壓力和張力增加會導致BNP釋放增加[9]，所以體內ANP和BNP的含量可反映心臟的功能狀態[10]。BNP己成為心力衰竭的血漿標記物，是目前心力衰竭檢測惟一的實驗室指標，已被歐洲心臟協會和美國心臟學會納入心力衰竭的診斷標準[11]。

堿性成纖維細胞生長因子作為一種細胞有絲分裂原和促血管生成因子，是成纖維生長因子家族中的成員之一[12]。cAMP-PKA系統是介導機械刺激心肌細胞肥大的第2信號途徑之一，且bFGF表達受cAMP的調控[13]。研究證明，壓力超負荷可引起心肌細胞內cAMP濃度升高和bFGF表達[14]。

本研究中脾氣虛證模型組大鼠體重明顯下降，模型組大鼠心肌組織細胞發生不同程度壞死及變性，心輸出量及射血分數均降低，血清及心肌中BNP和cAMP含量均升高，BNP蛋白表達及bFGF、PKA mRNA表達增加。脾氣虛證心功能變化是通過何種信號通路改變鮮有報道，本研究以cAMP-PKA信號通路為設想：脾氣虛引起心功能發生變化；機體分泌BNP增加生成的BNP與肌細胞膜受體結合產生cAMP；cAMP作為第2信使，激活PKA，使多種蛋白質磷酸化，并誘導心肌細胞bFGF mRNA及蛋白表達，產生細胞反應。

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(責任編輯： 盧萍， 羅森)

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《中國病理生理雜志》編輯部

2016年2月15日

Effect of BNP- mediated cAMP-PKA signaling pathway on bFGF expression in rats with spleen-qi deficiency syndromeJIANG Xiao-lin, ZHANG Li-de

(LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shenyang110032,China.E-mail:zhldtcm@163.com)

[ABSTRACT]AIM: To explore the changes and the mechanism of heart functions in the rats with spleen-qi deficiency syndrome. METHODS: The rats were randomly divided into blank control group and spleen-qi deficiency model group. The changes of cardiac functions in the rats were determined by ultrasonic imaging with a high-resolutioninvivoimaging system. HE staining was used to observe the pathological changes. The protein expression of brain natriuretic peptide (BNP) in the myocardium was assessed by Western blotting. The contents of BNP and cAMP in the serum and myocardium were measured by ELISA. The mRNA expression of basic fibroblast growth factor (bFGF) and protein kinase A (PKA) was detected by real-time PCR. RESULTS: Compared with blank control group, the myocardial cells in the model group had different degrees of necrosis and degeneration. Stroke volume and ejection fraction were decreased. The contents of cAMP and BNP in the serum and myocardium were increased in model group. The protein expression of BNP and the mRNA expression of bFGF and PKA were also increased.CONCLUSION: Spleen-qi deficiency syndrome causes heart function decline in rats. The expression of BNP, cAMP, PKA and bFGF is all increased.

[KEY WORDS]Spleen-qi deficiency syndrome; Heart function; Brain natriuretic peptide; Basic fibroblast growth factor

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.02.010

[中圖分類號]R256.3; R363

[文獻標志碼]A

通訊作者△Tel: 024-31207078; E-mail: zhldtcm@163.com

*[基金項目]遼寧省教育廳創新團隊項目(No. LT2014017)

[收稿日期]2015- 08- 04[修回日期] 2015- 09- 28

[文章編號]1000- 4718(2016)02- 0251- 05