內皮源性吲哚胺2,3-雙加氧酶抑制周細胞遷移及收縮蛋白表達

岳莉英，　關志明，　裴志強

(山西醫科大學第二醫院1心內科，2呼吸科，3太原市中心醫院心內科，山西 太原 030001)

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內皮源性吲哚胺2,3-雙加氧酶抑制周細胞遷移及收縮蛋白表達

岳莉英1△，關志明2，裴志強3

(山西醫科大學第二醫院1心內科，2呼吸科，3太原市中心醫院心內科，山西 太原 030001)

[摘要]目的： 探討內皮源性吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)對周細胞遷移及收縮蛋白表達的影響。方法: 體外培養人肺動脈內皮細胞(HPAECs)及大鼠腦微血管周細胞。建立過表達IDO的HPAECs模型(IDO-HPAECs)。實驗分為3組：對照組，以HPAECs條件培養基干預周細胞；處理組，以IDO-HPAECs條件培養基干預周細胞；抑制組，以含1-甲基色氨酸(1-mT)的IDO-HPAECs條件培養基干預周細胞。測定共培養體系一氧化氮(NO)、色氨酸及犬尿氨酸濃度。觀察周細胞活性、遷移及收縮蛋白表達情況。結果: IDO-HPAECs條件培養基干預周細胞6～48 h對其活性無顯著影響。處理組的周細胞遷移能力顯著低于對照組(P<0.01)，抑制組顯著高于處理組(P<0.01)。共培養體系的NO濃度在各組間差異無統計學意義(P>0.05)。處理組的色氨酸濃度顯著低于對照組(P<0.01)，而抑制組顯著高于處理組(P<0.01)。處理組的犬尿氨酸濃度顯著高于對照組(P<0.01)，而抑制組顯著低于處理組(P<0.01)。處理組的α-平滑肌肌動蛋白與結蛋白表達水平顯著低于對照組(P<0.01)，抑制組顯著高于處理組(P<0.01)。結論: 內皮源性IDO抑制周細胞遷移及收縮蛋白表達，可能參與機體微血管功能調控。

[關鍵詞]吲哚胺2, 3-雙加氧酶； 內皮細胞； 周細胞

肺動脈高壓是嚴重危害人體健康的疾病，血管平滑肌細胞和內皮細胞功能改變是影響肺動脈高壓進展的重要因素。近年來研究顯示：內皮源性吲哚胺2,3-雙加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase，IDO)通過將色氨酸代謝為犬尿氨酸舒張動脈血管并參與血壓調節[1]。最近有研究發現內皮源性IDO可調控血管平滑肌細胞表型改變,抑制血管重塑，從而減緩肺動脈高壓的進展[1-2]。周細胞參與調控微血管血流[3]，與內皮細胞之間通過間隙連接進行信號傳遞，調節內皮細胞分化、增殖及遷移等病理生理學過程[4]。由此我們推測內皮源性IDO也可能對周細胞的生物學行為產生影響，進而參與微血管系統血流調控。本研究在體外探討內皮細胞高表達IDO對周細胞增殖、遷移及收縮功能的影響。

材料和方法

1材料

內皮細胞培養基(ScienCell)；兔抗大鼠β-actin、血小板衍生生長因子受體β(platelet-derived growth factor receptor-β，PDGFR-β)、神經元膠質抗原2(neuron-glial antigen 2，NG2)、α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)和結蛋白抗體，小鼠抗人血管內皮鈣黏素(vascular endothelial cadherin，VE-cadherin)和IDO抗體,ECL發光試劑盒(Santa Cruz)；一氧化氮(nitric oxide，NO)檢測試劑盒購自南京建成生物有限公司；細胞裂解液及小鼠抗人β-actin抗體(CST)；Transwell系統(Corning)；1-甲基色氨酸(1-methyl-DL-tryptophan，1-mT)購自Sigma；ViraPower腺病毒表達系統試劑盒(Life Technologies)；3周齡雄性Wistar大鼠(10只)購自山西醫科大學醫學實驗動物中心。動物實驗經太原市中心醫院醫學倫理委員會審核批準。

2方法

2.1細胞培養人肺動脈內皮細胞(human pulmonary artery endothelial cells，HPAECs)株購自ScienCell。采用內皮細胞培養基培養。構建高表達IDO的腺病毒載體及其對照的重組腺病毒表達載體。具體方法參照試劑盒說明書。通過感染HPAECs 60 h建立高表達IDO的內皮細胞株(IDO-HPAECs)。腦微血管周細胞原代分離自3周齡雄性Wistar大鼠，采用2次酶消化及1次密度梯度離心分離腦微血管片段，進行原代培養并鑒定，具體步驟參照文獻[5]。采用DMEM培養基，添加物包括谷氨酰胺(2 mmol/L)及雙抗(青霉素1×105U/L，鏈霉素100 mg/L)。以上細胞培養于37 ℃、5% CO2的孵箱中，經免疫學鑒定后使用3～7代細胞進行實驗。實驗分為對照組(以HPAECs條件培養基干預周細胞)、處理組(以IDO-HPAECs條件培養基干預周細胞)和抑制組(以含1 mmol/L 1-mT的IDO-HPAECs條件培養基干預周細胞)。

2.2周細胞活力的測定考察過表達IDO的HPAECs條件培養基是否會影響周細胞活力。取對數生長期的周細胞，以每孔5×103個接種于96孔板。各孔加入200 μL不同IDO-HPAECs培養時間(0 h、6 h、12 h、24 h和48 h)的內皮細胞培養基，每份設5個復孔，20 h后每孔加入5 g/L的四甲基偶氮唑鹽(MTT)20 μL，培養4 h。棄上清后，每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，混勻10 min。采用多功能酶標儀檢測570 nm處吸光度(A)值。以對照組(0 h)周細胞活性為100%，各處理組：細胞活力(%)=(處理孔A值/對照孔A值)×100%。

2.3周細胞遷移的測定采用Transwell系統進行HPAECs與周細胞共培養。先將HPAECs以1×105/cm2密度接種于Transwell系統下層，待細胞生長至匯合后再將周細胞以同樣密度接種于8 μm孔嵌套膜上層。共培養48 h后，用棉簽將仍位于嵌套膜上層的周細胞拭去。將嵌套膜取出，0.1%結晶紫(溶于20%乙醇)染色。顯微鏡下觀察遷移至嵌套膜底面的周細胞。每孔取5個隨機視野計數，每種處理設3個復孔。

2.4共培養體系活性物質的測定共培養48 h后，采用硝酸還原酶法檢測共培養體系中培養液上清NO濃度。采用高效液相色譜法檢測培養液上清色氨酸與犬尿氨酸濃度。每種處理設6個復孔。

2.5Western blot實驗鑒定IDO-HPAECs模型及分析周細胞收縮蛋白表達情況后者以3組不同的條件培養基干預周細胞24 h后進行實驗，實驗重復3次。將細胞裂解物以20 μg蛋白上樣于10% SDS凝膠進行電泳分離，濕法轉印于PVDF膜上。5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)封閉，I 抗4 ℃過夜。以相應 II 抗孵育后，最終以ECL試劑盒產生光信號。分別檢測內皮細胞IDO、β-actin與周細胞α-SMA、結蛋白及β-actin表達情況。

3統計學處理

實驗數據以均數±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS 14.0軟件進行統計分析，組間比較使用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1HPAECs與周細胞的形態學觀察與鑒定

相差顯微鏡下，HPAECs細胞呈多邊形、邊界清，細胞核位于中央(圖1A)；經鑒定，VE-cadherin特異性表達于細胞膜上(圖1B)。周細胞體積大、形狀不規則，周邊常見突起，匯合后接觸抑制不明顯(圖1C)；經鑒定，PDGFR-β與NG2陽性表達(圖1D～F)。

Figure 1.Morphology and identification of HPAECs and pericytes. A: HPAECs under phase-contrast microscope; B: VE-cadherin expressed on the membrane of HPAECs; C: the pericytes under phase-contrast microscope; D: the positive expression of PDGFR-β; E: the positive expression of NG2; F: merged image of D and E.

圖1HPAECs與周細胞形態學觀察與鑒定

2IDO-HPAECs條件培養基對周細胞活力的影響

觀察不同培養時間IDO-HPAECs 條件培養基對周細胞活力的影響，結果表明周細胞在培養時間分別為6 h、12 h、24 h及48 h的條件培養基作用下，細胞活力在各組間差異無統計學意義(P>0.05)，且接近對照組，可用于進一步研究，見圖2。

Figure 2.The effects of conditioned medium of IDO-HPAECs on the viability of pericytes. Mean±SD.n=5.

圖2IDO-HPAECs條件培養基對周細胞活性的影響

3內皮源性IDO對周細胞遷移的影響

HPAECs與周細胞共培養48 h后，對照組遷移至嵌套膜底面的單視野周細胞數為376.3±20.5。過表達IDO的處理組單視野周細胞數為154.4±16.1，顯著低于對照組(P<0.01)。含有1-mT的抑制組單視野周細胞數為347.9±17.8，顯著高于抑制組(P<0.01)，見圖3。

4共培養體系NO、色氨酸及犬尿氨酸濃度測定

HPAECs與周細胞共培養48 h后，培養基上清液中NO濃度在3組間差異無統計學意義。處理組色氨酸濃度顯著低于對照組(P<0.01)，而抑制組色氨酸濃度則顯著高于處理組(P<0.01)。相反的，處理組犬尿氨酸濃度顯著高于對照組(P<0.01)，而抑制組犬尿氨酸濃度顯著低于處理組(P<0.01)，見圖4。

5內皮源性IDO對周細胞收縮蛋白表達的影響

經攜帶IDO的腺病毒載體轉染HPAECs后，可見IDO蛋白的高表達。對照HPAECs及空載體轉染表達量很低。經條件培養基處理后的周細胞，與對照組相比，處理組α-SMA與結蛋白表達水平顯著降低。與處理組相比，抑制組α-SMA與結蛋白表達水平顯著增高，見圖5。

討論

多種病因導致肺動脈高壓時均存在炎癥反應。當炎癥反應發生時，內皮細胞IDO可催化色氨酸代謝為犬尿氨酸，與一氧化氮合酶2(nitric oxide syn-thase 2, NOS2)催化精氨酸產生的NO協同調節血管平滑肌張力[6]。在小鼠的研究發現，體內內毒素導致炎癥反應時，內皮細胞IDO表達增高，可降低血漿色氨酸濃度并提高犬尿氨酸水平，繼而引發低血壓[1]。當前該領域的研究熱點在于內皮源性IDO對血管平滑肌細胞可塑性的調控。其實驗依據在于自肺動脈高壓患者或實驗性肺高血壓動物體內分離、培養的具有病理表型的平滑肌細胞在體外可經過外界信號的誘導恢復生理表型[7-8]。

Figure 3.The effects of endothelial IDO on the migration of pericytes (crystal violet staining, ×100). Mean±SD.n=15.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vstreatment group.

圖3內皮源性IDO對周細胞遷移的影響

Figure 4.Detection of NO, tryptophan and kynurenine in the co-culture system. Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vstreatment group.

圖4共培養體系NO、色氨酸及犬尿氨酸濃度測定

周細胞通過許多長的突起環繞微血管壁，并與內皮細胞共用基底膜[9-10]。周細胞對微血流的調控作用依賴于其類平滑肌的收縮特性[11-12]。目前未見內皮細胞通過IDO與周細胞相互作用的報道。本研究利用Transwell系統觀察周細胞與內皮細胞共培養時的遷移情況。結果表明，與過表達IDO的HPAECs共培養的周細胞遷移能力顯著下降，而此現象并非由于其細胞活力下降所致。此外，應用IDO抑制劑1-mT可逆轉IDO-HPAECs條件培養基對周細胞遷移的抑制作用。提示內皮細胞可通過表達IDO對其周圍的細胞(周細胞)產生作用，影響其生物學行為。我們同時檢測了共培養體系中NO、色氨酸及犬尿氨酸的濃度。其中，NO濃度在3組中未見統計學差異，說明NOS系統不是引起本研究模型中周細胞生物學行為變化的原因。色氨酸及犬尿氨酸的濃度在各組中的相應變化與IDO將色氨酸代謝為犬尿氨酸的過程相一致。

為確定內皮細胞是否可能通過IDO影響周細胞的舒縮行為并進而調控微血管的血流，我們觀察了IDO-HPAECs條件培養基對α-SMA及結蛋白2種與收縮行為相關蛋白的表達情況。結果發現，過表達IDO后，內皮細胞的條件培養基可下調周細胞α-SMA及結蛋白表達，而應用1-mT后可部分減輕IDO對α-SMA及結蛋白表達的抑制。提示內皮細胞可能通過表達IDO調控周細胞的舒縮行為。

Figure 5.The effects of endothelial IDO on the expression of contractile proteins in the pericytes. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsHPAECs alone;##P<0.01vsHPAECs+vehicle;△△P<0.01vscontrol group;▲▲P<0.01vstreatment group.

圖5內皮源性IDO對周細胞收縮蛋白表達的影響

綜上所述，本研究首次發現內皮源性IDO可能通過調控周細胞收縮蛋白的表達影響包括遷移在內的生物學行為，為深入研究周細胞調控微血管血流的機制提供實驗依據，并為肺動脈高壓研究提供了新的方向。然而本研究在這一新領域中僅為細胞水平的初步探索，在動物實驗和細胞學中深入研究IDO是如何作用于周細胞及可能的分子機制，會有更積極的意義。

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(責任編輯： 林白霜， 羅森)

Endothelial indoleamine 2,3-dioxygenase inhibits migration and expression of contractile proteins in pericytesYUE Li-ying1, GUAN Zhi-ming2, PEI Zhi-qiang3

(1DepartmentofCardiology，2DepartmentofRespiration,TheSecondHospitalofShanxiMedicalUniversity;3DepartmentofCardiology,TaiyuanCentralHospital,Taiyuan030001,China.E-mail:yly6673@sina.cn)

[ABSTRACT]AIM: To explore the effects of endothelial indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) on the migration and the expression of contractile proteins in the pericytes. METHODS: Human pulmonary artery endothelial cells (HPAECs) and rat cerebral microvascular pericytes were culturedinvitro. Over-expression of IDO in the HPAECs (IDO-HPAECs) was established. The pericytes were treated with HPAEC-conditioned medium (control group), IDO-HPAEC conditioned medium (treatment group), or IDO-HPAECs-conditioned medium containing 1-methyl-DL-tryptophan (1-mT) (inhibition group). The concentrations of nitric oxide (NO), tryptophan and kynurenine in the co-culture system were determined. The viability, migration and the expression of the contractile proteins in the pericytes were compared. RESULTS: No statistical difference of the pericyte viability after treatment with IDO-HPAEC-conditioned medium at 6～48 h was observed (P>0.05). The migratory ability of the pericytes significantly decreased in treatment group compared with control group (P<0.01), and significantly increased in inhibition group compared with treatment group (P<0.01). The concentration of NO in the co-culture system had no significant difference among groups (P>0.05). The concentration of tryptophan was significantly lower in treatment group than that in control group (P<0.01), and significantly higher in inhibition group than that in treatment group (P<0.01). The concentration of kynurenine was significantly higher in treatment group than that in control group (P<0.01), and significantly lower in inhibition group than that in treatment group (P<0.01). The expression of α-smooth muscle actin and desmin was significantly lower in treatment group than that in control group (P<0.01), and significantly higher in inhibition group than that in treatment group (P<0.01). CONCLUSION: Endothelial IDO inhibits the migration and the expression of the contractile proteins in the pericytes, and may play essential roles in the regulation of microvasculatures.

[KEY WORDS]Indoleamine 2,3-dioxygenase; Endothelial cells; Pericytes

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.02.011

[中圖分類號]R543；R363.2

[文獻標志碼]A

通訊作者△Tel: 0351-3365536; E-mail: yly6673@sina.cn

[收稿日期]2015- 07- 17[修回日期] 2015- 10- 10

[文章編號]1000- 4718(2016)02- 0256- 05