MicroRNA-132通過調控膽堿能通路減輕肺泡巨噬細胞炎癥反應*

劉　芬，　李　勇，　趙　寧，　李東海，　江　榕，　曾振國，　邵　強，　彭菲菲，　王　燕，　錢克儉△

(南昌大學第一附屬醫院1重癥醫學科，2腫瘤科，3神經外科，江西 南昌 330006)

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MicroRNA-132通過調控膽堿能通路減輕肺泡巨噬細胞炎癥反應*

劉芬1，李勇2，趙寧1，李東海3，江榕1，曾振國1，邵強1，彭菲菲1，王燕1，錢克儉1△

(南昌大學第一附屬醫院1重癥醫學科，2腫瘤科，3神經外科，江西 南昌 330006)

[摘要]目的： 探討microRNA-132(miR-132)通過調控膽堿能通路減輕肺泡巨噬細胞炎癥反應的作用機制。方法: 向大鼠肺泡巨噬細胞NR8383中轉染miR-132 mimic、mimic陰性對照(NC)、miR-132 inhibitor或inhibitor NC，轉染后用脂多糖(LPS)和(或)乙酰膽堿(ACh)處理細胞；采用real-time PCR檢測乙酰膽堿酯酶(AChE)的mRNA表達；采用Western blot檢測細胞中AChE、信號轉導及轉錄激活因子3(STAT3)和磷酸化STAT3(p-STAT3)，以及細胞漿和細胞核中核因子κB(NF-κB)蛋白的改變；采用AChE活性測試盒檢測細胞上清液中AChE活性的改變；采用免疫熒光檢測NF-κB的核移位變化。結果: 上調或下調miR-132不影響AChE的mRNA相對表達水平；上調miR-132可使AChE蛋白及活性的水平均顯著降低(P<0.05)，下調miR-132可使AChE蛋白及活性的水平均顯著升高(P<0.05)。當給予LPS+ACh作用時，miR-132 mimic組對NF-κB p65核移位的抑制作用較mimic NC組更強(P<0.05)，miR-132 inhibitor組較inhibitor NC組更弱(P<0.05)；miR-132 mimic組對STAT3及p-STAT3蛋白的抑制作用較mimic NC組更強(P<0.05)。結論: miR-132通過調控膽堿能通路減輕肺泡巨噬細胞炎癥反應的作用機制可能是miR-132靶向作用AChE，抑制AChE對ACh的水解作用，從而增強ACh的抗炎作用，抑制NF-κB及STAT3的活化。

[關鍵詞]MicroRNA-132； 乙酰膽堿酯酶； 乙酰膽堿

MicroRNAs(miRNA)是一類內源性非編碼小RNAs，可以通過與靶基因mRNA特定位點結合而影響該mRNA的穩定性或抑制蛋白的翻譯，參與轉錄后水平的調控[1]。近年來研究顯示microRNAs在調控炎癥反應中起著重要的作用，其中microRNA-132(miR-132)參與調控病毒感染免疫反應以及免疫刺激物如脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導的免疫細胞炎癥反應[2-3]。我們的前期研究[4]發現在LPS誘導的大鼠肺泡巨噬細胞中，miR-132的表達隨著LPS刺激時間延長而逐步升高；在體外培養環境，單獨給予LPS刺激時上調或下調miR-132不影響肺泡巨噬細胞炎癥因子的釋放，但當加入膽堿能抗炎通路的重要遞質乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)后， miR-132可增強ACh對LPS誘導的肺泡巨噬細胞炎癥反應的抗炎作用。因此我們推測miR-132通過調控膽堿能通路減輕肺泡巨噬細胞炎癥反應，但其中具體的分子作用機制尚不十分明確。本研究通過向肺泡巨噬細胞轉染miR-132 mimic及miR-132 inhibitor，觀察miR-132靶基因乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase，AChE)的表達及活性的改變，并在轉染肺泡巨噬細胞后給予LPS刺激或LPS+ACh作用，觀察ACh作用下游的2條主要信號通路即核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)和信號轉導及轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)的改變，以探討miR-132通過調控膽堿能通路減輕肺泡巨噬細胞炎癥反應的作用機制。

材料和方法

1主要材料

大鼠肺泡巨噬細胞NR8383購自中國科學院細胞庫；Ham’s F-12K培養基購自Sigma；胎牛血清購自Gibco；miR-132 mimic、miR-132 inhibitor、mimic陰性對照(negative control，NC)和inhibitor NC購自Invitrogen；PowerFectTMsiRNA轉染試劑購自SignaGen；LPS和ACh購自Sigma；PrimeScript? 逆轉錄試劑盒和SYBR實時熒光定量試劑盒購自TaKaRa；RIPA裂解液購自上海碧云天；核抽提試劑盒購自Active Motif；山羊抗AChE多克隆抗體購自Abcam；兔抗NF-κB p65多克隆抗體和山羊抗核纖層蛋白B(lamin B)多克隆抗體購自Santa Cruz；STAT3小鼠單克隆抗體和兔抗磷酸化STAT3(p-STAT3)多克隆抗體購自CST；β-actin小鼠單克隆抗體購自Anbo；辣根過氧化物酶標記兔抗山羊IgG、山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG購自北京中衫金橋；Alexa Fluor? 488標記驢抗兔IgG購自Life Technologies；4’, 6-二脒基-2-苯基吲哚(4’, 6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)購自Roche；AChE活性測試盒購自南京建成。

2主要方法

2.1細胞培養大鼠肺泡巨噬細胞NR8383使用含15%胎牛血清的Ham’s F-12K培養基，置于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養，根據細胞生長情況，2～3 d換液 1 次。

2.2細胞轉染取對數生長期NR8383細胞在轉染前24 h接種至6孔板。向細胞中轉染miR-132 mi-mic、mimic NC、miR-132 inhibitor或inhibitor NC，轉染步驟按照PowerFectTMsiRNA轉染試劑說明書進行。

2.3實驗分組將轉染了miR-132 mimic、mimic NC、miR-132 inhibitor或inhibitor NC的NR8383細胞用LPS和(或)ACh處理。細胞轉染24 h后，給予LPS刺激的濃度為1 mg/L，ACh在LPS刺激前5 min加入，濃度為10 μmol/L。刺激12 h后收集各組細胞沉淀及細胞上清液，用于后續檢測。

2.4Real-time RCR轉染后24 h收集各組細胞，采用TRIzol法提取細胞的總RNA，通過分光光度計及瓊脂糖凝膠電泳檢測所提總RNA的濃度及完整性。參照PrimeScript? 逆轉錄試劑盒說明書，采用10 μL反應體系，將RNA用逆轉錄反應合成cDNA。將獲得的cDNA使用SYBR實時熒光定量試劑盒進行擴增反應，采用20 μL反應體系，AChE 的上游引物為5’-AAA CAT GCA GAA GAT GAG GAT-3’，下游引物為5’-GAC CAC TAT AGC AAG CAG GAA C-3’；β-actin的正向引物為5’-TAC TGC CCT GGC TCC TAG CA-3’，逆向引物為5’-TGG ACA GTG AGG CCA GGA TAG-3’。選取β-actin作為內參照，采用2-ΔΔCt方法計算各組AChE的mRNA相對表達量。

2.5Western blot實驗離心收集各組細胞，采用RIPA裂解液提取細胞總蛋白，用于檢測AChE、STAT3、p-STAT3蛋白及內參照β-actin蛋白；采用核抽提試劑盒提取細胞漿蛋白和細胞核蛋白，用于檢測NF-κB p65蛋白及內參照β-actin、lamin B蛋白。通過BCA法測定蛋白濃度，10% SDS-PAGE垂直凝膠電泳分離蛋白，后電轉移至硝酸纖維素膜上，經5%脫脂奶粉封閉1 h，孵育相應 I 抗過夜 [AChE(1∶200)，NF-κB p65(1∶500)，STAT3(1∶500)，p-STAT3(1∶500),β-actin(1∶3 000)，lamin B(1∶100)]。孵育相應辣根過氧化物酶標記的 II 抗后，經化學發光法顯影，曝光，分析各條帶灰度值。

2.6AChE活性的檢測轉染后24 h收集各組細胞上清液，參照AChE活性測試盒檢測各組細胞上清液中AChE的活性變化，于酶標儀412 nm處測定吸光度。

2.7免疫熒光觀察將肺泡巨噬細胞接種至細胞爬片，根據分組給予相應處理。4%多聚甲醛固定20 min后PBS漂洗，0.2% Triton X-100透膜處理5 min，PBS漂洗后置入含5%牛血清蛋白的PBS中封閉1 h，NF-κB p65的 I 抗(1∶50)4 ℃孵育過夜，PBS漂洗后Alexa Flour 488標記的 II 抗室溫避光孵育1 h，PBS漂洗，加入細胞核染色液DAPI染核2 min，PBS漂洗后滴加防熒光淬滅劑封片，通過熒光顯微鏡觀察，采用Image-Pro Plus軟件進行分析，高倍鏡視野(×400)計數總細胞和NF-κB p65核染色陽性細胞。

3統計學處理

用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析。數據以均數±標準差(mean±SD)表示，組間均數比較采用獨立樣本t檢驗或單因素方差分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1調控miR-132對肺泡巨噬細胞AChE表達及活性的影響

在肺泡巨噬細胞中分別轉染miR-132 mimic及miR-132 inhibitor 24 h后，檢測細胞中AChE mRNA、蛋白水平及細胞上清液中AChE活性的改變，結果發現上調或下調miR-132不影響AChE的mRNA相對表達水平；而miR-132 mimic組與mimic NC組相比，AChE蛋白及活性水平均顯著降低(P<0.05)；反之,miR-132 inhibitor組與inhibitor NC組相比，AChE蛋白及活性水平均顯著升高(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.The effect of miR-132 on the expression and activity of AChE in alveolar macrophages. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmimic NC group;#P<0.05vsinhibitor NC group.

圖1調控miR-132對肺泡巨噬細胞AChE表達及活性的影響

2調控miR-132聯合ACh對肺泡巨噬細胞NF-κB核移位的影響

在肺泡巨噬細胞中分別轉染miR-132 mimic及miR-132 inhibitor 24 h后，給予LPS(1 mg/L)刺激或LPS+ACh(10 μmol/L)作用12 h，通過免疫熒光和Western blot檢測肺泡巨噬細胞中NF-κB p65的核移位情況及細胞核內外NF-κB p65蛋白的改變，結果顯示在肺泡巨噬細胞未給予LPS刺激時，NF-κB p65主要分布在細胞胞漿中；當給予LPS刺激時，miR-132 mimic組和mimic NC組的NF-κB p65均從胞漿向細胞核移位，但兩組之間差異無統計學顯著性；而當給予LPS+ACh作用時，miR-132 mimic組和mimic NC組的NF-κB p65的核移位均受抑制，但miR-132 mimic組對NF-κB p65核移位的抑制作用較mimic NC組更強(P<0.05)。miR-132 inhibitor組與inhibitor NC組相比，NF-κB p65核移位的情況在給予LPS刺激時兩組之間差異無統計學顯著性，但在給予LPS+ACh作用時，miR-132 inhibitor組對NF-κB p65核移位的抑制作用較inhibitor NC組更弱(P<0.05)，見圖2。

Figure 2.The regulatory effect of miR-132 combined with ACh on NF-κB nuclear translocation in the alveolar macrophages. A: immunofluorescence detection of NF-κB p65 (green) nuclear translocation (×400). The cell nuclei were stained by DAPI (blue). NF-κB nuclear translocation was expressed as the percentage of nuclear NF-κB p65 positive relative to total cells. B， C: detection of nuclear and cytoplasmic NF-κB p65 levels by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmimic NC group;#P<0.05vsinhibitor NC group.

圖2調控miR-132聯合ACh對肺泡巨噬細胞NF-κB核移位的影響

3調控miR-132聯合ACh對肺泡巨噬細胞STAT3活化的影響

在肺泡巨噬細胞中轉染miR-132 mimic 24 h后，給予LPS(1 mg/L)刺激或LPS+ACh(10 μmol/L)作用12 h，檢測細胞中STAT3蛋白及其磷酸化水平的變化，結果顯示在給予LPS刺激后，肺泡巨噬細胞中STAT3蛋白及p-STAT3的蛋白含量均增加，但miR-132 mimic組和mimic NC組之間差異均無統計學顯著性；ACh的加入可抑制LPS誘導的STAT3及p-STAT3蛋白的增加，其中miR-132 mimic組對STAT3及p-STAT3蛋白的抑制作用較mimic NC組更強，見圖3。

Figure 3.The regulatory effect of miR-132 combined with ACh on STAT3 activation in the alveolar macrophages. Mean±SD.n=3. NC: negative control.*P<0.05vsmimic NC group.

圖3調控miR-132聯合ACh對肺泡巨噬細胞STAT3活化的影響

討論

膿毒癥時細菌毒素如LPS釋放入血引發肺部炎癥級聯放大，導致膿毒癥肺損傷，肺泡巨噬細胞作為主要的肺內炎癥始動細胞在膿毒癥肺損傷中起著重要的作用[5]。文獻報道及我們的前期研究表明microRNAs參與調控肺泡巨噬細胞的炎癥反應[6-7]，miR-132是其中之一，但其調控肺泡巨噬細胞炎癥反應的具體機制尚不十分清楚。MicroRNA主要的作用機制是通過與靶基因mRNA的3’非翻譯區域(untranslated region，UTR)的特異序列結合，在轉錄后水平調控靶基因的表達。 Shaked等[8]通過研究證實miR-132可靶向作用AChE mRNA的3’UTR，增強大腦通過膽堿能通路調控全身炎癥反應的能力，另有研究表明miR-132通過靶向作用AChE參與改善人類炎癥性腸病的炎癥反應[9]，以及參與介導壓力應激誘導的小鼠認知障礙[10]。本研究也發現在肺泡巨噬細胞中調控miR-132不影響AChE mRNA的相對表達水平，但上調miR-132可降低AChE蛋白及活性的水平，下調miR-132可增加AChE蛋白及活性水平，提示miR-132在肺泡巨噬細胞中可靶向作用AChE，從轉錄后水平調控AChE的表達。

AChE是一種特異性催化水解神經遞質ACh的酶，近年研究發現迷走神經釋放的ACh可與巨噬細胞上的α7煙堿型乙酰膽堿受體(α7 nicotinic acetylcholine receptor，α7nAChR)相互作用，通過細胞內NF-κB及Janus激酶2(Janus kinase 2, JAK2)/STAT3信號通路，減少腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等促炎因子的釋放，形成一條膽堿能抗炎通路調控機體的炎癥反應[11-12]。鑒于ACh由迷走神經分泌，在體外細胞培養環境中缺乏，因此我們在肺泡巨噬細胞中加入外源性ACh，以便研究miR-132調控膽堿能通路的機制。本研究的結果發現在肺泡巨噬細胞中上調miR-132并加入ACh后，可抑制LPS誘導的NF-κB p65的核移位，以及抑制STAT3及p-STAT3蛋白的增加，并且其抑制作用強于ACh的作用。目前的研究認為NF-κB及JAK2/STAT3這2條信號通路是ACh最主要的抗炎機制，其中NF-κB通路的激活對TNF-α等促炎因子的產生具有重要的作用，研究表明[13]膽堿受體激動劑尼古丁可通過激活α7nAChR后抑制NF-κB的活化，從而抑制巨噬細胞促炎因子的分泌，與本研究結果相符。而對JAK2/STAT3信號通路目前的研究存在爭議，有報道[14]認為LPS刺激RAW264.7細胞后通過激活STAT3的磷酸化而誘導白細胞介素 1β(interleukin-1β，IL-1β)和白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)的生成，而加入尼古丁后通過抑制STAT3蛋白及p-STAT3的水平，從而抑制炎癥因子的產生，與我們的研究結果一致。另外也有研究[15]發現在LPS刺激的腹腔巨噬細胞中尼古丁呈劑量依賴的方式增加STAT3的磷酸化及細胞因子信號傳導抑制蛋白3(suppressor of cytokine signaling 3，SOCS3)的表達，與我們的結果相反，原因可能與多種炎癥因子之間相互作用激活有關。

綜上所述，miR-132調控膽堿能通路減輕肺泡巨噬細胞炎癥反應的作用機制，與miR-132通過靶向作用AChE，抑制AChE對ACh的水解作用，從而增強ACh的抗炎作用，抑制NF-κB及STAT3的活化有關。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅森)

MicroRNA-132 inhibits inflammation of alveolar macrophages by regulating cholinergic anti-inflammatory pathwayLIU Fen1, LI Yong2, ZHAO Ning1, LI Dong-hai3, JIANG Rong1, ZENG Zhen-guo1, SHAO Qiang1, PENG Fei-fei1, WANG Yan1, QIAN Ke-jian1

(1DepartmentofCriticalCareMedicine,2DepartmentofOncology，3DepartmentofNeurosurgery,TheFirstAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang330006,China.E-mail:qiankejianicu@163.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the role of microRNA-132 (miR-132) on alveolar macrophage inflammation. METHODS: Rat alveolar macrophage cell line NR8383 was transfected with miR-132 mimic, mimic negative control (NC), miR-132 inhibitor, or inhibitor NC. The cells were divided into transfection group, transfection + lipopolysaccharide (LPS) group, and transfection + LPS + acetylcholine (ACh) group. The mRNA expression of acetylcholinesterase (AChE) was detected by real-time PCR. The protein levels of AChE, signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) and phosphorylated STAT3 (p-STAT3) in the cells, and nuclear factor-κB (NF-κB) in the cytoplasm and nucleus were analyzed by Western blot. The activity of AChE in the culture supernatant was measured by AChE activity assay kit. The nuclear translocation of NF-κB was detected by immunofluorescence assay. RESULTS: Up-regulation or down-regulation of miR-132 had no effect on the mRNA expression of AChE. However, up-regulation of miR-132 decreased the protein level of AChE compared with mimic NC group (P<0.05). Transfection with miR-132 inhibitor increased the protein expression of AChE compared with inhibitor NC group (P<0.05). In the alveolar macrophages treated with LPS+ACh, the inhibition of nuclear translocation of NF-κB p65 in miR-132 mimic group was more effective than that in mimic NC group (P<0.05). The inhibitory effect in miR-132 inhibitor group was weaker than that in inhibitor NC group (P<0.05). The inhibitory effect of miR-132 mimic on the protein levels of STAT3 and p-STAT3 was stronger than that of mimic NC (P<0.05). CONCLUSION: miR-132 in LPS-stimulated alveolar macrophages reinforced ACh-mediated anti-inflammatory reaction by targeting AChE to suppress ACh hydrolyzation, which was related to the suppression of NF-κB and STAT3 activation.

[KEY WORDS]MicroRNA-132; Acetylcholinesterase; Acetylcholine

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.02.012

[中圖分類號]R392.12

[文獻標志碼]A

通訊作者△Tel: 0791-88692533; E-mail: qiankejianicu@163.com

*[基金項目]國家自然科學基金資助項目(No.81101410；No.81460292)；江西省自然科學基金資助項目(No.20122BAB205002)

[收稿日期]2015- 08- 10[修回日期] 2015- 12- 04

[文章編號]1000- 4718(2016)02- 0261- 06