米諾環素對新生鼠缺氧后腦室周圍區域谷氨酸清除的影響*

李虹椿，　李　霞，　馬雪濤，　肖　婕，3，　牛之瑞，　馮　雷，　李　凡△

(1昆明醫科大學病理學與病理生理學系，云南 昆明 650500；2云南省產品質量監督檢驗研究院，云南 昆明 650223;3黃石中心醫院理科，湖北 黃石435000)

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米諾環素對新生鼠缺氧后腦室周圍區域谷氨酸清除的影響*

李虹椿1，李霞1，馬雪濤2，肖婕1，3，牛之瑞2，馮雷2，李凡1△

(1昆明醫科大學病理學與病理生理學系，云南 昆明 650500；2云南省產品質量監督檢驗研究院，云南 昆明 650223;3黃石中心醫院理科，湖北 黃石435000)

[摘要]目的： 探討米諾環素對新生大鼠缺氧后腦室周圍區域谷氨酸的作用及其可能的機制。方法: 對出生后1 d的大鼠給予系統性缺氧構建缺血缺氧性腦損傷模型(hypoxic-ischemic brain damage，HIBD)。采用液相色譜-串聯質譜聯用技術檢測缺氧后4 h和1 d腦室周圍區域谷氨酸水平；Western blot觀察該區域EAAT1和EAAT2發育期變化以及EAAT1、EAAT2、Iba-1、IL-1β、TNF-α和TGF-β1蛋白在缺氧后4 h和1 d的動態變化，并同時觀察給予米諾環素后對谷氨酸水平及上述蛋白的影響。結果: 谷氨酸水平檢測發現，缺氧后4 h和1 d，腦室周圍區域谷氨酸水平明顯上升；給予米諾環素(45 mg/kg)后，谷氨酸水平顯著下降。Western blot結果顯示，出生后第1周EAAT1和EAAT2低表達，但在出生后第2周表達顯著上升；缺氧后1 d，EAAT1、EAAT2、Iba-1、IL-1β和TGF-β1表達上調；給予米諾環素后能促進EAAT1和TNF-α的表達，但卻抑制EAAT2的產生。結論: 缺氧后早期，米諾環素能降低腦室周圍區域谷氨酸水平，其機制可能與它選擇性調控谷氨酸轉運體，而非抑制該區域炎癥反應有關。

[關鍵詞]米諾環素； 腦室周圍區域； 缺氧； 谷氨酸； 谷氨酸轉運體

新生兒缺血缺氧性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE)是指圍產期由各種因素引起的缺氧和腦血流減少或暫停而引發胎兒和新生兒的腦損傷，該病是導致兒童神經系統傷殘的常見原因之一，而缺氧為其病理生理基礎。近年來研究發現，HIE存在腦室周圍區域易損現象[1]，該區域受損是導致患兒神經系統功能紊亂和認知功能障礙的主要原因。

谷氨酸(glutamate)是腦內含量最多的興奮性神經遞質，在突觸信號傳遞及認知功能的維系中發揮重要作用。缺血缺氧(hypoxia-ischemia，HI)后，大腦白質，尤其腦室周圍白質區域的谷氨酸水平升高[2]。胞外過多的谷氨酸會持續激活谷氨酸受體并使胞內Ca2+持續增高，引發一系列毒性反應，最終導致神經元變性、壞死、誘發腦損傷。該過程也被稱為谷氨酸所介導的興奮性毒性作用?？梢奌I后，谷氨酸在腦室周圍區域易損中起著重要的作用，維持該區域谷氨酸水平的穩定將有助于減輕HI后腦損傷。

研究認為谷氨酸清除主要受谷氨酸轉運體調節。人類已發現5種位于細胞膜上的谷氨酸轉運體，分別是興奮性氨基酸轉運體1～5(excitatory amino acid transporter 1～5，EAAT1～5)；而在嚙齒類動物中也發現4種同系物。其中EAAT1和EAAT2是調節谷氨酸的主要轉運蛋白，并大量分布在星形膠質細胞上。在神經系統發育過程中，EAAT1是清除谷氨酸的主要蛋白；而EAAT2則主要負責成人腦組織中谷氨酸的轉運。目前，對出生后早期腦室周圍區域谷氨酸轉運體的表達情況未見報道，缺氧后與谷氨酸水平變化的關系不清。

近年研究發現，谷氨酸的產生與HI后腦內炎癥反應密切相關。腦內炎癥反應主要以小膠質細胞活化為特征。小膠質細胞在受到各種刺激(包括HI)后由靜息狀態變為活化狀態并啟動腦內炎癥反應。活化的小膠質細胞除產生和釋放過多炎癥介質外，還能釋放谷氨酸。而炎癥介質(IL-1β、TNF-α等)可通過損傷神經元并導致其產生和釋放更多的谷氨酸[3]，誘發星形膠質細胞膜上谷氨酸轉運體功能障礙[4]等方式，使胞外谷氨酸水平升高。同樣抗炎因子(TGF-β1等)在HI后也會高表達，它能促進神經元存活，減輕腦內炎癥反應，抑制谷氨酸產生。因此，缺氧后新生大鼠腦室周圍區域的炎癥反應及其與谷氨酸間可能的關系還有待進一步研究。

米諾環素(minocycline,M)是一種四環素類廣譜抗生素。由于其脂溶性好，易透過血腦屏障，在多種腦損傷模型中發揮神經保護作用，也包括HIE后腦損傷。其保護機制與抑制小膠質細胞活化，繼而減輕腦內炎癥反應有關。既然米諾環素能抑制HI后腦內炎癥反應，那么它是否也對谷氨酸的清除產生影響，這成為本研究的目的。

據此，本研究采用谷氨酸轉運體EAAT1和EAAT2，炎癥介質IL-1β和TNF-α，抗炎因子TGF-β1以及小膠質細胞活化的標志物Iba-1為研究對象，觀察缺氧后腦室周圍區域谷氨酸水平的改變，并結合谷氨酸轉運體以及炎癥介質表達的變化，揭示缺氧后該區域谷氨酸變化可能的機制以及米諾環素對其的影響。

材料和方法

1實驗動物

SD新生大鼠體重(6±1)g，SPF級，雌雄各半，由昆明醫科大學動物飼養和使用委員會提供。每窩新生鼠10～12只與母鼠同籠飼養，保證食物及水供應，動物許可證編號為SYXK(滇)2011-0004。

2藥品和試劑

米諾環素(Sigma)；水合氯醛(索萊寶公司)； PVDF膜(Millipore)；脫脂奶粉(BD)；anti-EAAT1和anti-TGF-β1(Santa Cruz)；anti-EAAT2、anti-IL-1β、anti-TNF-α和anti-β-actin(Abcam)；anti-Iba-1(Wako)；anti-mouse IgG-HRP和anti-rabbit IgG-HRP(Abmart)。

3實驗方法

作為食品領域的高風險行業，我國特殊食品管理要求最高、制度最多、措施最嚴。如今，在各界的共同努力下，我國特殊食品管理制度不斷完善，產業環境日趨向好，安全指數逐年攀升，消費者信心不斷增強。據統計，2017年國產嬰幼兒配方乳粉合格率達99.1%，保健食品監督抽檢總體樣品合格率達98.1%，特殊食品安全達到歷史最好水平。

3.1動物系統性缺氧及藥物干預本實驗采用同窩出生后1 d的SD大鼠幼崽，置入恒溫缺氧實驗裝置，在28 ℃、5% O2+ 95% N2混合氣體中暴露3.5 h[5]。系統性缺氧結束后，大鼠隨機分為缺氧(hypoxic，Hy)組(缺氧后2 h腹腔注射生理鹽水8 μL)和米諾環素(Hy+M)組(缺氧后2 h腹腔注射米諾環素45 mg/kg[6])，并設置同齡正常組(normal group，NG)。NG組置于21% O2、28 ℃的環境中，不予處理。

3.2液相色譜-串聯質譜聯用技術檢測谷氨酸缺氧后4 h和1 d，對各組大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉(0.3 mL/100 g)后，分離腦室周圍區域，見圖1。用高效液相串聯質譜分析儀檢測該區域單位重量腦組織中谷氨酸的濃度。樣品前處理：使用色譜級甲酸與樣本一起進行超聲乳化勻漿后，12 000 r/min離心20 min，吸取上清液，經0.2 μm的濾膜進行過濾。然后按條件[色譜柱: 1.7 μm，100 mm×2.0 mm，柱溫30 ℃，流動相乙腈(A)-0.1%甲酸(B)，流速0.3 mL/min，進樣量5 μL]進行分析，流動相梯度洗脫程序見表1。質譜條件為電噴霧電離(ESI)，正離子化模式，多反應監測模式(MRM)，毛細管噴霧電壓(IS)5 500 V；氣簾氣(CUR)：15.0 psi；碰撞室碰撞氣(CAD)：5 psi；離子源溫度(TEM)：650 °C；霧化氣(GS1)：60 psi；輔助氣(GS2)：65 psi；所用氣體均為高純氮氣(純度99.999%)；去簇電壓(DP)：13 V；其它條件見表2。優化后母離子為148.0，定性子離子為m/z 84.1和m/z 130.1，定量離子為m/z 84.1，檢測方式為多反應監測(MRM)模式。在完成谷氨酸標準品色譜分析后，建立標準曲線，并對樣本進行分析，將計算得出的峰面積代入方程，算出樣本中谷氨酸濃度。

Figure 1.Periventricular zone.

圖1腦室周圍區域

表1　流動相洗脫程序

表2　串聯質譜條件

3.3Western blot 檢測目標蛋白對出生后1 d、2 d、4 d、8 d和15 d的正常大鼠觀察腦室周圍區域EAAT1和EAAT2發育期表達動態變化；對缺氧后4 h和1 d的各組大鼠檢測該區域EAAT1、EAAT2、Iba-1、IL-1β、TNF-α和TGF-β1蛋白表達情況。腹腔注射10%水合氯醛麻醉(0.3 mL/100 g)后斷頭取腦，分離腦室周圍區域。每組取處理過的蛋白樣品20 μg進行SDS-PAGE，并將蛋白質轉移到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上。轉膜結束后，5%脫脂牛奶封閉1 h后結合I抗，室溫孵育1 h，4 ℃過夜。第2天結合含有辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)的II抗，室溫孵育2 h。Bio-Rad Chemical XRS+顯影系統掃描，用ImageJ 3.0軟件測量所有目標蛋白以及內參照的灰度值。

4統計學處理

使用SPSS 20.0統計軟件對實驗數據進行統計處理。數據均采用均數±標準差(mean±SD)表示。對各組數據進行正態性和方差齊性檢驗后發現，數據呈非正態分布，因此采用非參數的Mann-Whitney和Wilcoxon檢驗對兩樣本進行統計學分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1EAAT1和EAAT2發育期動態變化

2缺氧后4 h和1 d，米諾環素對腦室周圍區域谷氨酸及谷氨酸轉運體的作用

缺氧后4 h和1 d，對新生大鼠腦室周圍區域谷氨酸水平測定后發現谷氨酸水平持續增高(P<0.05)。給予米諾環素后，在缺氧后1 d，該區域谷氨酸水平顯著下降(P<0.05)。缺氧后4 h，EAAT2的表達明顯增加(P<0.05)，缺氧后1 d，EAAT1和EAAT2的表達均高于正常組(P<0.05)；Hy+M組與Hy組相比， EAAT1的表達升高(P<0.05)，而EAAT2的表達降低(P<0.05)，見圖3。結果提示缺氧早期，米諾環素能降低腦室周圍區域谷氨酸水平和EAAT2的表達，但同時促進EAAT1的上調。

3缺氧后4 h和1 d，米諾環素對腦室周圍區域炎癥反應的作用

系統性缺氧后4 h和1 d，腦室周圍區域IL-1β的表達持續增高(P<0.05)。在缺氧后1 d，該區域Iba-1以及TGF-β1的表達也上升(P<0.05)。給予米諾環素后，IL-1β、Iba-1及TGF-β1的表達均沒有變化，但TNF-α的表達卻升高(P<0.05)，見圖4。結果提示米諾環素未能干預缺氧后早期腦室周圍區域的炎癥反應。

Figure 2.The time course of EAAT1 (A) and EAAT2 (B) protein expression in the periventricular zone. Mean±SD.n=7～8.**P<0.01vspostnatal 15 d group.

圖2腦室周圍區域EAAT1和EAAT2發育期動態變化

Figure 3.The effect of minocycline on glutamate level (A) and the protein expression of EAAT1 (B) and EAAT2 (C) in the periventricular zone after 4 h and 1 d of hypoxic exposure. Mean±SD.n=3～7.*P<0.05vsNG;#P<0.05vsHy.

圖3米諾環素對缺氧后腦室周圍區域谷氨酸以及谷氨酸轉運體EAAT1和EAAT2的作用

討論

缺氧后，谷氨酸水平升高所介導的興奮性毒性作用能導致腦室周圍區域受損。因此維持該區域谷氨酸水平的穩定，對HIE患兒在神經系統的發育和認知功能的改善都有著重要作用。本實驗通過對新生大鼠系統性缺氧構建HIE動物模型，探討米諾環素對缺氧后腦室周圍區域谷氨酸清除的作用及其可能的機制。

本研究發現腦室周圍區域，EAAT1和EAAT2在出生后第1周表達水平較低，可能與出生后第1周谷氨酸轉運體的啟動子快速下調有關[7]。由于谷氨酸轉運體在出生后低表達，新生大鼠在出生早期經系統性缺氧后，是否更易引起谷氨酸水平升高，據此我們測定了該區域缺氧后早期谷氨酸水平的動態變化。

Figure 4.The effect of minocycline on the protein expression of Iba-1 (A), IL-1β (B), TGF-β1 (C) and TNF-α (D) in the periventricular zone after 4 h and 1 d of hypoxic exposure. Mean±SD.n=6～9.*P<0.05vsNG;#P<0.05vsHy.

圖4米諾環素對缺氧后腦室周圍區域炎癥介質Iba-1、IL-1β、TNF-α和抗炎因子TGF-β1的作用

結果揭示缺氧后該區域谷氨酸水平升高，給予米諾環素后能下調谷氨酸水平。因此，本研究進一步對該區域炎癥介質和谷氨酸轉運體的表達進行觀察，探討缺氧后早期米諾環素減輕谷氨酸水平的病理生理學機制。

EAAT1和EAAT2在缺氧后所發揮的作用有所不同。出生后早期EAAT1主要負責谷氨酸轉運[8]，它能清除腦內多余的谷氨酸。2013年Nijboer等[8]發現，G蛋白偶聯受體激酶2(G protein-coupled receptor kinase 2，GRK2)敲除的小鼠經HI造模后腦損傷程度明顯輕于野生型小鼠, 該保護機制與GRK2缺失后，星形膠質細胞膜上EAAT1表達增多、清除谷氨酸能力增強有關。相反缺氧后，EAAT2則表現出逆轉運作用[9]，可將胞內的谷氨酸釋放到組織間隙，提高谷氨酸水平。體外實驗也證實，少突膠質細胞前體細胞經氧糖剝奪(oxygen-glucose deprivation，OGD)后，給予EAAT2特異性拮抗劑二氫卡因酸鹽(dihydrokainate，DHK)，能顯著抑制胞外谷氨酸的產生，并降低少突膠質細胞前體細胞死亡的數量[10]。在我們的研究中發現缺氧后4 h，谷氨酸水平升高可能與EAAT2高表達有關，因為缺氧后它可能發揮了逆轉運作用。近年來對米諾環素的研究中，Colovic等[11]發現給藥后4 h腦內米諾環素的濃度逐漸上升，并在6 h后其血藥濃度逐漸達到穩定。因此缺氧后4 h，米諾環素未對谷氨酸及其轉運體產生影響，這可能與其還未及時透過血腦屏障到達中樞，未對它們進行調控有關。因此，缺氧后1 d，米諾環素能降低谷氨酸水平，這也許與其促進EAAT1(負責將谷氨酸轉運入胞)表達的同時抑制EAAT2(負責將谷氨酸轉運出胞)有關。

缺氧后早期腦室周圍區域炎癥介質表達增多，反映該區域炎癥反應可能是一個早期過程；此時谷氨酸水平升高，提示谷氨酸的產生與炎癥反應可能存在聯系。最近Wixey[6, 12]團隊對出生后3 d的新生大鼠進行右側頸總動脈結扎后，經系統性缺氧構建HIE動物模型，同樣在缺氧后2 h給予米諾環素發現在造模后第1周和第6周，其能抑制皮質、丘腦和中縫背核部位的小膠質細胞活化和炎癥反應。在我們的模型中按相同的給藥方式和給藥劑量后觀察到，米諾環素未能干預腦室周圍區域炎癥介質的表達，這可能與觀察部位的解剖結構[13]，新生大鼠不同腦區的小膠質細胞活化后功能及其對神經元的毒性作用存在差異[14]，造模的方式和觀察的時點不同有關，其具體機制還需進一步研究。近期有研究發現小膠質細胞能表達TGF-β1[15]，而TGF-β1陽性的小膠質細胞在機體中起到抗炎、抗氧化、保護受損后的神經元的作用。本研究發現缺氧后TGF-β1表達增加，或許與EAAT1一樣，是機體面對損傷后的代償反應。Boycott等[4]在對培養的星形膠質細胞進行缺氧后發現有大量TNF-α產生，而TNF-α對EAAT1和EAAT2具有選擇性作用，它能顯著性抑制EAAT2的產生，但不能對EAAT1的表達產生影響。在我們研究中發現給予米諾環素后，TNF-α表達上升，而EAAT2的表達卻下降。這說明米諾環素對EAAT2表達的調控可能與其促進該區域TNF-α水平升高存在關聯。

綜上所述，缺氧后早期米諾環素能降低腦室周圍區域谷氨酸水平，其作用機制可能與其選擇性調控谷氨酸轉運體(促進EAAT1表達的同時抑制了EAAT2)，而非抑制該區域炎癥反應有關。通過降低該區域谷氨酸水平，減輕由谷氨酸介導的興奮性毒性作用，將有助于改善HIE患兒神經系統功能紊亂和認知能力障礙。在今后的研究中，我們將進一步證實米諾環素選擇性地調控谷氨酸轉運體的信號轉導機制，為其在臨床治療HIE提供更有力的證據。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅森)

Effect of minocycline on glutamate uptake in periventricular zone of neonatal rats after hypoxiaLI Hong-chun1, LI Xia1, MA Xue-tao2, XIAO Jie1，3, NIU Zhi-rui2, FENG Lei2, LI Fan1

(1DepartmentofPathologyandPathophysiology,KunmingMedicalUniversity,Kunming650500,China;2YunnanTestingInstituteforProductQualitySupervision,Kunming650223,China；3DepartmentofPathology,HuangshiCentralHospital,Huangshi435000,China.E-mail:leefan623@sina.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the role of minocycline on glutamate uptake in the periventricular zone and its putative mechanism after hypoxic exposure in neonatal rats. METHODS: A model of hypoxic-ischemic brain damage (HIBD) was developed by putting postnatal 1 d rat pups in 5% O2for 3.5 h. The glutamate level in periventricular zone was measured by liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry assay (LC-MS/MS) after hypoxic exposure for 4 h and 1 d. The dynamic changes of glutamate transporters EAAT1, and EAAT2 during developmental period in periventricular zone were determined by Western blot. Moreover, the expression of EAAT1, EAAT2, Iba-1, IL-1β, TNF-α and TGF-β1 was also detected by Western blot after hypoxic exposure for 4 h and 1 d in that region. The effects of minocycline on all parameters mentioned above were tested after minocycline treatment at the same time points and in the same region. RESULTS: After hypoxic exposure, glutamate level was increased, but it was decreased after minocycline treatment. EAAT1 and EAAT2 kept a low expression level at the first postnatal week, but a predominant elevation was found at the end of the second postnatal week. The expression of EAAT1, EAAT2, Iba-1, IL-1β and TGF-β1 was increased at 1 d after hypoxic exposure. EAAT1 and TNF-α expression was significantly up-regulated, while EAAT2 was down-regulated after minocycline treatment. CONCLUSION: Minocycline inhibits the increase in the glutamate level after hypoxia in periventricular region of the neonatal rats. The mechanism may relate to the selective regulation of glutamate transporters, rather than the inhibition of neuroinflammation in periventricular zone.

[KEY WORDS]Minocycline; Periventricular zone; Hypoxia; Glutamate; Glutamate transporters

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.02.017

[中圖分類號]R363

[文獻標志碼]A

通訊作者△Tel： 0871-65922858; E-mail: leefan623@sina.com

*[基金項目]國家自然科學基金資助項目(No. 81200939; No. 31260242)；云南省科技計劃(No. 2011FB060)

[收稿日期]2015- 08- 27[修回日期] 2015- 11- 25

[文章編號]1000- 4718(2016)02- 0290- 06