小鼠慢性酒精中毒及戒斷過程中抑郁樣行為的改變及其共病機制*

蔣　曦，　田福榮，　趙應征

(1寧波明州醫院藥劑科，浙江 寧波 315100；2溫州醫科大學， 浙江 溫州 325035)

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小鼠慢性酒精中毒及戒斷過程中抑郁樣行為的改變及其共病機制*

蔣曦1 △，田福榮2，趙應征2

(1寧波明州醫院藥劑科，浙江 寧波 315100；2溫州醫科大學， 浙江 溫州 325035)

[摘要]目的： 研究小鼠慢性酒精中毒及戒斷過程中抑郁樣行為的改變，進一步探討酒精中毒與抑郁癥的共病機制。方法: 構建新型慢性酒精中毒小鼠模型；實驗分為正常對照組及慢性酒精7 d、14 d、21 d和28 d組。在第6、13、20和27天分別進行酒精偏好度測試，測試后戒斷酒精1 d，隨后次日進行抑郁行為學測試，測試結束后處死小鼠取海馬與額葉皮層，采用高效液相色譜法測定5-羥色胺(5-HT)及去甲腎上腺素(NE)含量，采用免疫印跡法測定cAMP反應元件結合蛋白(CREB)和腦源性神經營養因子(BDNF)的含量。結果: 隨著酒精飲酒天數及戒斷次數的增加，小鼠表現出明顯嗜酒現象，并且在強迫游泳和懸尾測試中，表現出明顯的不動時間增加。7 d組小鼠額葉皮層內5-HT水平升高(P<0.05)，海馬與額葉5-HT水平在21 d與28 d組降低(P<0.01)；7 d和14 d組小鼠海馬與額葉NE水平無明顯變化，21 d和28 d組NE水平降低(P<0.05)。21 d和28 d組小鼠海馬與額葉內p-CREB/CREB比值及BDNF表達水平明顯下降(P<0.05)，7 d與14 d組無明顯變化。結論: 酒精中毒、戒斷階段與抑郁的共病機制涉及5-HT。5-HT-cAMP-CREB-BDNF信號轉導通路可能為酒精中毒與抑郁癥的共病機制。

[關鍵詞]酒精中毒； 抑郁； 5-羥色胺； cAMP反應元件結合蛋白； 腦源性神經營養因子

酒精成癮與抑郁癥均是中樞神經性疾病，兩者的病理特點表現為腦內特定腦區大量神經細胞的凋亡，相關神經保護蛋白表達的減少，神經再生的減少。報道指出酒精成癮與抑郁癥存在關聯性[1]，相關臨床前研究也發現酒精成癮與抑郁癥存在關聯[2]，臨床研究也已證實抑郁癥與酒精濫用有關[3]，抑郁與酒精成癮共病率高達70%[2]，但兩者的共病機制仍不明確。

本研究基于抑郁癥的重要機制單胺假說，以及酒精成癮與神經遞質5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)等存在相關性[4]，以腦內神經遞質為突破口，進一步檢測神經保護相關蛋白——環磷腺苷反應元件結合蛋白(cAMP response element-binding protein, CREB)和神經再生相關蛋白腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)的表達，深入探討神經遞質→cAMP→CREB→BDNF通路是否為酒精成癮與抑郁癥兩者的共病機制。本研究采用慢性酒精成癮小鼠模型，并在經典模型基礎上稍作修改，模擬臨床酒精戒斷后復飲的現象，觀察小鼠在反復戒斷及復飲時，抑郁樣行為的改變、相關神經遞質及相關蛋白表達的改變。

材料和方法

成年雄性ICR小鼠40只， 6～8周齡，購于中國科學院上海實驗動物中心，實驗動物許可證號為SYXK(浙)2010-0150。動物自由進食及飲水。所有實驗和動物處理符合1986 年11 月24日歐洲共同體理事會指導，并通過復旦大學動物護理和使用委員會批準。所有的實驗均在上午8：00～10：00進行。

2主要試劑和設備

2.1試劑無水乙醇購于無錫佳妮化工有限公司;5-HT、去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)、5-羥基異丁酸(5-hydroxyisobutyric acid，5-HIAA)和3-甲氧-4-羥苯乙二醇(3-methoxy-4-hydroxyphenylglycol，MHPG)均購于 Sigma；BDNF抗體和ECL曝光液購于Abcam；CREB抗體、p-CREB抗體、兔Ⅱ抗及鼠Ⅱ抗均購于Santa Cruz；β-actin抗體購于Abcam；脫脂奶粉購于碧迪醫療器械有限公司；Tris-HCl購于Biosharp；APS、SDS、TEMED及BCA蛋白濃度測定試劑盒均購于上海碧云天生物技術有限公司；30%聚丙烯酰胺和PVDF膜購于Solarbio。

2.2設備BS110S型電子分析天平(北京賽多利斯天平有限公司)；JY92-2D超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；WH966漩渦混合器(太倉市科教器材廠)；Allegra 64R超速冷凍離心機(Beckman Coulter)；Agilent 1100 高效液相色譜儀(Agilent)。

3實驗方法

3.1慢性酒精成癮小鼠模型的建立64只小鼠分為慢性酒精成癮7 d組、14 d組、21 d組、28 d組和相應的正常對照組，每組8只小鼠，共8組。3～5只小鼠飼養為1籠。以酒精和水的體積比為5%的初始濃度，按10 mL/kg量取酒水溶液。第2、3、4周酒精濃度分別為10%、20%和35%，將酒精溶液作為唯一的飲水來源。除正常對照組外，所有小鼠第1周給予5%酒精，慢性酒精成癮7 d組及其正常對照組在第6天進行酒精偏好度測試，測試后停止給予酒精，戒斷1 d后，進行強迫游泳測試和懸尾測試，測試后殺7 d組小鼠，取海馬與額葉皮層組織，其它各組則模擬戒斷和復飲過程，但并不進行行為學測試，在第7天開始給予20%的酒精，以此類推處理14 d組、21 d組和28 d組小鼠。正常對照組則在全過程中給予正常飲水。

3.2酒精偏好測試仿照糖水消耗實驗方法[5]，對小鼠進行酒精消耗測試。在小鼠進行抑郁行為學測試前1 d，每只小鼠單籠飼養，禁水24 h后同時給予酒精與水各1瓶，記錄1 h內酒水與水各自的消耗量，用酒水消耗率來表示實驗結果。酒水消耗率(%)= 酒水消耗量/(酒水消耗量+自來水消耗量)×100%。

3.3強迫游泳實驗測試(forced swim test, FST)動物被迫在一個局限的空間中游泳，首先以游泳、攀爬、掙扎試圖逃脫，隨后即進入一種被稱為“行為絕望”的不動狀態，以反映動物的抑郁狀態。實驗時將對照組、慢性酒精組小鼠逐只放入高45 cm、直徑20 cm、水深20 cm的游泳水槽中，水溫維持在(22±1)℃，觀察6 min，記錄后4 min內小鼠的絕對不動時間[6]。

3.2 【指南建議】 表型相關的臨床信息是測序數據解釋的組成部分。在開始檢測之前，臨床信息必須進行咨詢的臨床醫生以標準格式提交，優先使用人類表型本體術語。此外，臨床醫生還應提供影像資料(至少要有報告，最好能補充相關圖像)以支持對胎兒的表型發現。鼓勵實驗室建立便于提交標準化表型信息的系統，這些信息作為檢測申請過程的一部分。

3.4懸尾實驗測試(tail suspension test,TST)根據相關文獻[6]，在距尾尖約1 cm 處用膠布把小鼠懸于高50 cm 的位置。小鼠被懸于高處會立刻出現逃生樣行為，然后轉變為被動不動。過了最初的掙扎期后小鼠會適應不動狀態， 類似于絕望和精神抑郁的狀態。測試時間為6 min，記錄后4 min內的累計不動時間，精確到秒。

3.5高效液相色譜法采用高效液相色譜法測定小鼠海馬及額葉皮質內單胺遞質的含量。7 d、14 d、21 d和28 d行為學測試后，斷頭處死小鼠，迅速剝離大腦，分離出海馬和皮質，稱重，放入-80 ℃ 冰箱中保存。測試時，每100 mg組織置于200 μL冰冷高氯酸(濃度為0.4 mol/L，溶液 A)中超聲勻漿。勻漿液避光置于冰上1 h，使其充分裂解，然后置于12 000 r/min 4 ℃離心20 min，丟棄沉淀。160 μL上清液加入至80 μL的溶液B(0.2 mol/L檸檬酸、0.3 mol/L磷酸氫二鉀和0.2 mol/L EDTA)。混合液避光在冰上孵育1 h，之后，再次進行離心，轉速為12 000 r/min，溫度為4 ℃，離心20 min。取樣品上清液經過0.22 μm 孔徑的過濾器處理，然后再取20 μL 進行高效液相色譜分析。該色譜柱為 Diamonsilim C 18(150 mm ×4.6 mm，5 μm)，采用CoulArray電化學檢測器(ESA Inc.)。流動相組分為125 mmol/L枸櫞酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH 4.3)、0.1 mmol/L EDTA、1.2 mmol/L辛烷基磺酸鈉和18%甲醇。流動相的流速為1.0 mL/min。腦組織中單胺及其代謝產物的含量以ng/g組織濕重表示。

3.6蛋白免疫印跡法各組小鼠在對應天數進行行為學測試后處死，在4 ℃條件下迅速剝離大腦，用生理鹽水洗去血漬后分離出海馬和皮質，分別置預冷的RIPA 裂解液中進行組織勻漿。用 BCA 蛋白定量試劑盒進行蛋白定量，經過上樣電泳及轉膜后，蛋白轉移至PVDF膜上。室溫下用5%脫脂奶粉封閉 1 h或4 ℃封閉過夜， 隨后用TBST 洗膜3次， 加入BDNF的 I 抗(稀釋倍數為1∶1 000)、p-CREB或CREB的I抗(稀釋倍數為1∶200)4 ℃孵育過夜。用TBST洗膜3 次， 每次7 min， 加入相應的II抗(稀釋倍數為1∶10 000)， 孵育1 h。用TBST 洗膜3 次。曝光顯影后，用薄層掃描分析儀分析結果。

4統計學處理

采用SPSS 16.0統計軟件包進行統計學處理，數據以均數±標準誤(mean±SEM)表示，數據進行多因素方差分析。多因素方差分析，給予酒精與不給予酒精及不同酒精濃度作為組間因素，當出現多個時點的比較，時點的變化均為組內因素，數據之間的多重比較采用Duncan檢驗。單因素方差分析中，采用Dunnett’st檢驗進行多重比較。以P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1慢性酒精成癮過程中對酒精的依賴程度

如圖1所示，與正常對照組相比，7 d組小鼠對酒精的偏好程度有所增加，但差異無統計學意義，而14 d組、21 d組和28 d組小鼠對酒精的偏好程度顯著增加，差異具有統計學意義(P<0.01)。

Figure 1.The effects of chronic alcohol consumption on alcohol preference test in 7 d, 14 d, 21 d and 28 d groups. Mean±SEM.n=8.**P<0.01vs0 d group.

圖1酒精偏好行為學結果

2慢性酒精成癮戒斷對抑郁樣行為學的影響

各組小鼠戒斷1 d后的抑郁行為學如圖2所示，7 d與14 d組小鼠在戒斷1 d后的FST和TST中，與對照組相比，不動時間并無顯著變化，差異無統計學意義。21 d組與28 d組小鼠經歷7 d與14 d的戒斷后復飲過程，FST的不動時間較正常對照組明顯增加；在TST中，21 d與28 d組小鼠的不動時間與對照組相比較，也明顯增加，差異具有統計學意義(P<0.05)。

3慢性酒精成癮戒斷對腦內海馬和額葉皮層5-HT及NE水平的影響

如表1所示，7 d戒斷組小鼠海馬內5-HT水平與正常對照組相比略有升高，NE水平則無明顯變化，差異均無統計學意義，14 d組小鼠腦內神經遞質則無明顯差異，而21 d與28 d組的5-HT與NE水平則明顯降低(P<0.05)；相對應的額葉皮層腦區，7 d戒斷組小鼠皮層中5-HT水平與正常對照組相比明顯升高(P<0.05)，NE水平并無明顯變化，但21 d及28 d組5-HT與NE水平隨著飲酒時間與戒斷次數的增加，呈階梯式降低，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表2。

4慢性酒精成癮戒斷對腦內海馬和額葉皮層p-CREB和BDNF表達的影響

21 d和28 d酒精戒斷組小鼠海馬內pCREB和BDNF的蛋白水平與正常對照組相比明顯降低(P<0.05)，而7 d和14 d組表達并無明顯變化；相應的21 d和28 d組小鼠額葉皮層的p-CREB和BDNF蛋白水平也明顯降低(P<0.05)，7 d和14 d組蛋白表達與正常組相比差異并無統計學意義，見圖3、4。

Figure 2.The effects of chronic alcohol consumption on force swimming test (A) and tail suspension test (B) in 7 d, 14 d, 21 d and 28 d groups. Mean±SEM.n=8.*P<0.05,**P<0.01vs0 d group.

圖2抑郁樣行為學強迫游泳和懸尾實驗結果

表1海馬單胺遞質含量測定結果

Table 1.The effects of chronic alcohol consumption on the concentrations of 5-HT, NE and their metabolites in hippocampus of mice (ng/g tissue. Mean±SEM.n=8)

Group5-HT5-HIAANEMHPGControl313.98±22.90237.36±30.40237.85±33.50191.18±22.40Alcohol7d365.45±23.60231.21±30.30239.34±27.80192.49±20.50Alcohol14d268.94±25.00214.33±24.10206.83±21.90184.33±13.80Alcohol21d205.75±24.50*222.60±16.70148.31±11.00*198.80±16.50Alcohol28d193.40±14.10**219.71±40.90145.80±16.40*192.36±24.20

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

表2額葉皮層單胺遞質含量測定結果

Table 2.The effects of chronic alcohol consumption on the concentrations of 5-HT, NE and their metabolites in frontal cortex of mice (ng/g tissue. Mean±SEM.n=8)

Group5-HT5-HIAANEMHPGControl323.91±16.40233.35±27.40304.46±31.40217.85±39.80Alcohol7d406.39±50.30**240.36±38.20295.10±34.40220.15±28.40Alcohol14d264.46±37.00244.76±33.50284.57±31.10229.12±24.60Alcohol21d218.10±30.60*238.41±38.60189.86±35.20*216.08±23.90Alcohol28d186.16±28.80**229.21±33.80181.88±21.30*218.77±31.20

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

討論

酒精是一種人類歷史上使用時間最長的成癮藥物。適量飲酒對機體并無害，但過量飲酒會導致中樞神經系統受損。額葉皮層是受損最為明顯的腦區，尸檢結果發現皮層存在明顯的神經元丟失[7]。同時酒精中毒也會損害重要的學習記憶腦區海馬。研究發現海馬胚胎培養細胞暴露于酒精中時會引起酒精導致的細胞活力明顯降低，但如果暴露于BDNF時則會顯著逆轉酒精引起的神經毒性[8]。額葉皮層與海馬調節著復雜的認知功能，如學習記憶、情緒和情感。酗酒可導致這2個腦區受損，酗酒者表現出判斷力下降，情感麻木，洞察力變弱，社交退縮。這些表現與抑郁癥的表現驚人地相似，同時海馬與皮層也是抑郁癥最易累及的腦區[9]。酒精中毒與抑郁癥均為神經退行性疾病，有著相似的病變腦區，臨床研究發現，酒精依賴及戒斷的患者首先多表現為：興奮、躁動、敵對攻擊、傷人毀物，并出現幻覺，隨著依賴程度的加深及戒斷次數的增多，患者可能出現焦慮、抑郁等伴隨癥狀。臨床也將抗抑郁藥物——選擇性5-HT重攝取抑制劑(selective serotonin reuptake inhibitor，SSRI)作為酒精成癮的治療藥物之一，這提示兩者可能存在共同的發病機制。

單胺假說作為抑郁癥的經典發病機制之一，主要闡述的是腦內神經遞質(5-HT、NE等)失衡導致抑郁的發病，但5-HT和NE不僅僅與抑郁相關，近年來大量研究發現其與酒精成癮、酒精依賴相關，其中5-HT與酒依賴之間的相關性已被公認，但目前其病理生理機制尚未研究清楚。本次研究以酒精中毒為模型，探究酒精與抑郁的共病機制，結果發現，在酒精攝入初期(7 d～14 d)，海馬和額葉的5-HT神經遞質水平升高，且并無抑郁樣行為出現，而在酒精中毒中后期(14 d～28 d)，5-HT與NE遞質水平明顯降低，出現抑郁樣行為。這一結果在酒精的相關研究中得到部分驗證，即人體長期飲酒和中樞5 -HT 能神經遞質呈負相關，中樞5-HT 能神經遞質的濃度隨著飲酒時間的延長而降低[10]，并且近期研究也發現5-HT受體亞型的活性與酒精攝入量密切相關，然而在飲酒后期的NE水平的變化并無相關研究可以佐證，同時在抑郁研究領域中，雖有大量臨床病人調研及群眾心理分析，至今仍無相關研究能說明長期飲酒后的神經遞質改變與戒斷階段的抑郁癥有關。以本實驗結果為基礎，結合經典單胺假說，不難發現5-HT與NE均是抑郁發病的重要神經遞質，酒精攝入初期的遞質水平升高可能是由于乙醇脫氫酶能催化酒精生成乙醛，乙醛可抑制催化5-HT的酶活性，減弱其降解[11]，從而使5-HT 濃度增加，這也正符合臨床應用中，使用抗精神病藥緩解酒精中毒患者出現的幻覺癥狀，抗精神病藥均在不同程度上減少突觸間隙5-HT含量或阻斷5-HT受體。但在酒精中毒及戒斷加重的后期，本研究結果發現神經遞質水平明顯降低，這可能正是酒后抑郁癥狀出現的原因所在，因此本研究提出5-HT及其受體和受體后通路可能是酒精依賴與抑郁的共病機制這一觀點。

Figure 3.Western blot analysis for p-CREB, CREB (A) and BDNF (B) expression in hippocampus of 0 d, 7 d, 14 d, 21 d and 28 d groups. Mean±SEM.n=4.*P<0.05,**P<0.01vs0 d group.

圖3海馬p-CREB、CREB和BDNF蛋白表達結果

Figure 4.Western blot analysis for p-CREB, CREB (A) and BDNF (B) expression in frontal cortex of 0 d, 7 d, 14 d, 21 d and 28 d groups. Mean±SEM.n=4.*P<0.05,**P<0.01vs0 d group.

圖4額葉皮層p-CREB、CREB和BDNF蛋白表達結果

CREB與BDNF是cAMP第二信使通路中重要的兩類神經保護蛋白，相關研究發現慢性應激抑郁大鼠海馬和額葉內cAMP含量、CREB和BDNF的表達都會相應發生變化[12-13]，CREB通路的激活可以介導BDNF的表達從而促進神經元的再生[14]。CREB與BDNF不僅僅與抑郁癥的發病密切相關，也與酒精中毒相關聯。本實驗的行為學結果表明，在酒精中毒后小鼠有明顯的抑郁樣行為出現，并且這種行為與海馬與額葉中神經遞質(5-HT和NE)紊亂有關，進一步檢測2個腦區的CREB、p-CREB和BDNF的表達水平后，發現隨著酒精攝入量及戒斷次數的增加，CREB的磷酸化及BDNF的表達下降明顯。這表明酒精中毒后的抑郁樣行為與CREB和BDNF表達下降有關。慢性酒中毒、酒精戒斷過程及抑郁癥，均涉及神經退行性變和再生。CREB和BDNF在神經元的存活、生長、分化發育過程中發揮著重要的作用。不僅在神經發育過程中，在成人腦中BDNF也被認為參與了神經遞質的調節，及神經元的可塑性，如長時程增強和學習，同時也參與了物質成癮的過程。此外，相關研究還發現,BDNF水平下降會導致酒精消耗量增加，而其水平的增加則會減少酒精的攝入。重要的是，cAMP-CREB-BDNF通路也同樣是5-HT及其受體后的相關通路之一[15]，BDNF也與5-HT存在相互作用。當BDNF激活其受體TrkB時，可以使5-HT的合成及釋放增加，從而增加突觸間隙5-HT的濃度,達到減輕癥狀、治療疾病的作用。這些結果均表明，調控5-HT-cAMP-CREB-BDNF信號通路可能是改善酒精成癮的重要途徑。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅森)

Change of depression-like behavior in chronic alcoholism and withdrawal model, and co-mechanism of depression and chronic alcoholism in miceJIANG Xi1, TIAN Fu-rong2, ZHAO Ying-zheng2

(1PharmaceuticalPreparationSectionofNingboMingzhouHospital,Ningbo315100,China;2WenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325035,China.E-mail:jiangxi901022@163.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the behavior of depression in chronic alcoholism and withdrawal model of mice, and to explore the co-mechanism of alcoholism and depression. METHODS: A novel model of chronic alcoholism was constructed in this study. The animals were divided into normal control group, and alcohol 7 d, 14 d, 21 d and 28 d groups. The mice were given alcohol preference test on the 6th, 13th, 20th and 27th days. After the test, alcohol were withdrawn for 1 d, then the next day the mice were given behavior test of depression. After the test, the mice were sacrificed. The contents of 5-hydroxytryptamine (5-HT) and norepinephrine (NE) were detected by HPLC. The expression of cAMP response element-binding protein (CREB) and brain-derived neurotrophic factor (BDNF) was detected by Western blot. RESULTS: The mice showed an obvious drinking phenomenon, and the immobility time of forced swimming test and tail suspension test was significantly increased, with increasing drinking days and withdrawal times. 5-HT level in 7 d group mice only increased in frontal cortex (P<0.05). However, compared with control group, 5-HT levels in hippocampus and cortex were decreased on the 21th and 28th days (P<0.01). NE levels in 21 d and 28 d groups were decreased in hippocampus and frontal cortex (P<0.05), and no significant change was observed in 7 d and 14 d groups. The protein levels of p-CREB and BDNF were significantly decreased in hippocampus and frontal cortex of 12 d and 28 d groups (P<0.05), and no significant change was observed in 7 d group and 14 d group. CONCLUSION: The co-mechanism of alcoholism, withdrawal and depression is related to 5-HT. 5-HT-cAMP-CREB-BDNF signaling pathway may be a common mechanism for alcoholism and depression.

[KEY WORDS]Alcoholism; Depression; 5-hydroxytryptamine; cAMP response element-binding protein; Brain-derived neurotrophic factor

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.02.018

[中圖分類號]R363.21

[文獻標志碼]A

通訊作者△Tel: 0574-83009631; E-mail: jiangxi901022@163.com

*[基金項目]國家自然科學基金資助項目 (No. 81272160)

[收稿日期]2015- 08- 03[修回日期] 2015- 10- 09

[文章編號]1000- 4718(2016)02- 0296- 06