神經干細胞過表達Hsp75降低Aβ介導的神經毒性*

王　艷，　林繼宗，　陳慶狀，　賈思遠，　馬艷姣，　王　勇△

(1南方醫科大學珠江醫院藥劑科，廣東 廣州 510282；2廣東省中西醫結合醫院藥事管理科，廣東 佛山 528200；3中山大學附屬第三醫院肝膽外科，廣東 廣州 510630；4廣州市中西醫結合醫院藥劑科，廣東 廣州 510800；5南方醫科大學珠江醫院燒傷科，廣東 廣州 510282)

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神經干細胞過表達Hsp75降低Aβ介導的神經毒性*

王艷1, 2，林繼宗3，陳慶狀4，賈思遠5，馬艷姣1，王勇1△

(1南方醫科大學珠江醫院藥劑科，廣東 廣州 510282；2廣東省中西醫結合醫院藥事管理科，廣東 佛山 528200；3中山大學附屬第三醫院肝膽外科，廣東 廣州 510630；4廣州市中西醫結合醫院藥劑科，廣東 廣州 510800；5南方醫科大學珠江醫院燒傷科，廣東 廣州 510282)

[摘要]目的： 應用腺病毒為載體在體外過表達熱休克蛋白75(Hsp75)，研究Hsp75蛋白過表達對神經干細胞在Aβ誘導神經毒性中的作用，并初步探討其作用機制。方法: 體外培養小鼠神經干細胞C17.2，實驗分為對照組、Aβ處理組、腺病毒陰性感染組和腺病毒Hsp75過表達感染組。使用熒光顯微鏡觀察腺病毒的感染情況并進行細胞免疫鑒定；倒置相差顯微鏡觀察各組神經干細胞的形態；MTT法檢測細胞活力；流式細胞術檢測細胞凋亡率；Western blot檢測Hsp75和活化型caspase-3蛋白水平。結果: 熒光顯微鏡觀察和Western blot檢測表明腺病毒成功感染神經干細胞并高效表達Hsp75蛋白。此外，腺病毒感染不會導致細胞形態改變及細胞分化，同時也不會影響細胞活力。與對照組比較，Aβ處理組及腺病毒陰性感染組細胞存活率顯著降低(P<0.05)，細胞凋亡率及活化型caspase-3蛋白水平顯著增高(P<0.05)；然而，Hsp75過表達能顯著提高神經干細胞的存活率，減少細胞凋亡和降低活化型caspase-3蛋白水平(P<0.05)。結論: Hsp75過表達對Aβ誘導損傷的C17.2細胞具有明顯保護作用，其機制可能是與抑制caspase-3途徑依賴的細胞凋亡有關。

[關鍵詞]熱休克蛋白75； C17.2神經干細胞； 細胞凋亡

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)又稱老年癡呆癥，是一種以認知功能進行性下降和情感障礙為特點的中樞神經退行性疾病，其病理特征主要表現為細胞外β-淀粉樣蛋白(amyloid β-protein，Aβ)沉積形成老年斑及胞內tau蛋白過度磷酸化引起纖維纏結[1-2]。大量研究證實，Aβ對腦細胞產生的神經毒性在AD病理形成過程中發揮了重要的作用[3- 4]。因此，保護神經細胞拮抗Aβ誘導的神經毒性成為治療AD的重要途徑。

熱休克蛋白75(heat shock protein 75，Hsp75)是一個主要定位于線粒體，分子量約為75 kD的分子伴侶，對細胞存活、增殖及線粒體功能的維護具有重要的作用。近年來研究表明，Hsp75是一個抗凋亡蛋白，特別是在心肌細胞及腫瘤細胞中都已證實具有抗凋亡的作用[5-6]，但Hsp75過表達對保護神經干細胞拮抗Aβ誘導的細胞損傷尚未明確。本研究應用腺病毒載體在C17.2神經干細胞過表達人Hsp75基因，以探討Hsp75對Aβ誘導神經干細胞損傷的保護作用，為下一步的基因工程化神經干細胞移植治療AD奠定了基礎。

材料和方法

1實驗材料

重組腺病毒為本課題前期實驗包裝，滴度為1×1013PFU/L；C17.2神經干細胞由上海交通大學金衛林教授饋贈；DMEM、胎牛血清、馬血清購于Gibco；Hsp75、MAP2、GFAP和MBP多克隆抗體、nestin小鼠單克隆抗體均購自Abcam；活化型caspase-3(cleaved caspase-3)抗體購自CST；β-actin和α-tubulin小鼠單克隆抗體購于碧云天生物技術研究所；Aβ1-42購于USBiological。

2主要方法

2.1神經干細胞培養、實驗分組和處理C17.2細胞培養于含10%胎牛血清、5%馬血清的DMEM高糖培養基中，孵育于37 ℃、5% CO2培養箱中，取對數生長期的細胞用于實驗。實驗共分為4組：對照組(control組)：細胞于正常培養基生長；Aβ處理組(C17.2+Aβ組)：用含10 μmol/L Aβ1-42的培養基培養神經干細胞；腺病毒陰性感染組(Ad-GFP+Aβ組): 感染了對照腺病毒的神經干細胞置于含10 μmol/L Aβ1-42的培養基中生長；腺病毒Hsp75過表達感染組(Ad-Hsp75+Aβ組): 感染了攜帶Hsp75基因腺病毒的神經干細胞，用含10 μmol/L Aβ1-42的培養基處理。以上所有分組的處理時間均為36 h。

2.2腺病毒感染神經干細胞接種密度為每孔2×105個C17.2神經干細胞于6孔板，12 h后去除培養基，PBS洗3次，添加感染復數為100的病毒液和1 mL無血清的高糖培養基培養，2 h后，換正常培養基繼續培養36 h于熒光顯微鏡下觀察GFP表達情況，拍片。

2.3Hsp75和cleaved caspase-3蛋白水平的檢測用細胞裂解液裂解細胞，離心后取蛋白上清，BCA法測蛋白的含量，進行10% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，10 V恒壓半干轉膜1 h，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，過夜孵育Hsp75多克隆抗體和β-actin小鼠單克隆抗體，之后用辣根過氧化物酶結合的 II 抗結合，ECL法顯色后掃描。

2.4細胞形態學觀察、免疫鑒定和活力的檢測按上述感染方法，腺病毒感染細胞36 h后，于倒置相差顯微鏡下觀察細胞的形態，拍片。接著用4%多聚甲醛固定，10%山羊血清封閉，滴加nestin的I 抗過夜孵育。次日，依次滴加羅丹明山羊抗小鼠IgG的II抗和DAPI室溫孵育，熒光顯微鏡下觀察拍照。干細胞分化為神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞的檢測方法參照上述干細胞nestin免疫鑒定，只需把 I 抗分別換為MAP2、GFAP、MBP。細胞活力檢測方法參照下面細胞存活率的檢測。

2.5細胞存活率和凋亡的檢測接種于96孔板的C17.2細胞實驗處理36 h后，吸棄培養基，PBS洗3次，于每孔加入5 g/L的MTT溶液20 μL，37 ℃培養箱中避光孵育4 h，棄去上清液，加入150 μL的二甲基亞砜(DMSO)，振蕩混勻使結晶充分溶解，以酶標儀于490 nm波長處檢測A值。將接種于6孔板的細胞分別實驗處理后用無EDTA的胰酶消化收集細胞。制成單細胞懸液收集后1 000 r/min離心5 min，棄掉上清液，加入500 μL的結合緩沖液、5 μL的Annexin V-APC染色液混勻，室溫避光孵育15 min；再加入10 μL的7-AAD染色液，用流式細胞儀檢測C17.2細胞的凋亡率。

3統計學處理

數據使用SPSS 13.0 統計軟件分析，結果使用均數±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析。方差齊時采用SNK法；方差不齊時則采用Dunnett’s T3法。以P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1腺病毒感染后GFP熒光蛋白的觀察和Hsp75過表達的鑒定

腺病毒感染神經干細胞36 h 后，在熒光顯微鏡下觀察到GFP大量表達，證實C17.2細胞已被病毒感染(圖1)。提取總蛋白進行Western blot實驗，結果顯示Ad-Hsp75過表達感染組與正常組和腺病毒陰性感染組Ad-GFP相比，Hsp75蛋白表達量明顯增加，說明了腺病毒Ad-Hsp75感染的神經干細胞Hsp75基因可以有效表達，見圖2。

2腺病毒感染后細胞形態學觀察、免疫鑒定和活力的檢測

腺病毒感染36 h后，在倒置相差顯微鏡下觀察，腺病毒感染組(Ad-GFP和Ad-Hsp75)的細胞形態與對照組的細胞形態一樣。均呈現為細胞形態不規則、呈扁平的形態，細胞邊界不清，并與鄰近的細胞相互接觸，證實了腺病毒的感染不會改變細胞的正常形態；此外，MTT結果顯示3組的細胞活力無顯著差異，證實了腺病毒感染C17.2細胞不會影響細胞活力，見圖3。在熒光顯微鏡下觀察到所有細胞均表達nestin，然而3組細胞均不表達MAP2、GFAP和MBP，說明了腺病毒的感染不會導致C17.2神經干細胞的分化，見圖4。

Figure 1.GFP expression in C17.2 neural stem cells after adenovirus transfection (×100).

圖1腺病毒感染C17.2神經干細胞的GFP表達

Figure 2.The expression of Hsp75 protein in the cells. Mean ±SD.n=3.*P<0.05vsAd-Hsp75 group.

圖2Hsp75蛋白在細胞中的表達

Figure 3.The morphology and viability of C17.2 neural stem cells. A: the morphology of the cells was observed under inverted phase-contrast microscope (×200); B: the cell viability was detected by MTT assay after transfection. Mean±SD.n=3.

圖3C17.2神經干細胞的形態學觀察和細胞活力檢測

3Hsp75過表達對Aβ誘導C17.2細胞存活率和凋亡率的影響

如圖5所示，與對照組比較，未感染的神經干細胞和感染了對照腺病毒的神經干細胞經Aβ處理后，細胞存活率下降，凋亡率明顯增加(P<0.05)；用過表達Hsp75腺病毒感染神經干細胞后，能夠明顯逆轉Aβ引起的細胞活性降低及凋亡增加(P<0.05)。

4Hsp75過表達對cleaved caspase-3蛋白水平的影響

從Western blot實驗結果可見，對照組神經干細胞cleaved caspase-3蛋白的水平非常低，而用Aβ處理的2個神經干細胞組(C17.2+Aβ和Ad-GFP+Aβ)，其cleaved caspase-3表達水平明顯增加，與對照組相比均差異顯著(P<0.05)。用過表達Hsp75腺病毒感染后，cleaved caspase-3水平明顯下降(P<0.05)，見圖6。

討論

大量研究已經證實，AD患者顱內微環境改變與Aβ有關，Aβ在腦內產生神經毒性抑制了神經細胞的生成[7-8]。我們的前期實驗結果也證實Aβ1-42不僅能直接影響神經干細胞的增殖，更通過小膠質細胞加強抑制了神經干細胞的增殖與分化[9]。由于C17.2神經干細胞與原代神經干細胞生理功能具有許多相似之處，且同樣具有多潛能分化的功能，在一定的條件下能誘導分化為神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞這3種細胞，被認為是研究神經干細胞的一種工具細胞[10]，因此我們采用此細胞建立模型，研究其過表達Hsp75以對抗Aβ介導的神經毒性。

Figure 4.The immunofluorescence identification of C17.2 neural stem cells (×400).

圖4C17.2神經干細胞的免疫熒光鑒定

Figure 5.The neural stem cell viability and apoptotic rate in different groups. A: the cell viability was detected by MTT assay; B: the cells were double stained with Annexin V-APC and 7-AAD and analyzed by flow cytometry. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAd-Hsp75+Aβ group.

圖5各組細胞存活率和凋亡率的檢測

Figure 6.The protein levels of cleaved caspase-3 in different groups. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAd-Hsp75+Aβ group.

圖6各組cleaved caspase-3的蛋白水平

Hsp75是一種線粒體分子伴侶，研究已經證實其在腦和心臟中過表達能維護線粒體的正常功能，對維持細胞內環境的穩定起著重要的作用。Hsp75過表達能夠逆轉缺氧引起心肌細胞的凋亡[5]，也能夠降低腦缺血所引起的損傷[11]。然而，Hsp75過表達在保護神經干細胞免受Aβ誘導神經毒性的作用及其機制還尚未清楚。實驗中我們選取C17.2神經干細胞作為Hsp75基因感染的靶細胞，進一步去探討Hsp75過表達在保護神經干細胞免受Aβ誘導神經毒性中的作用。因為神經干細胞是一群相對靜止的細胞，利用脂質體轉染的效率低、毒性較大，因此我們選用了高感染效率、低毒性的腺病毒去感染神經干細胞；考慮到C17.2細胞是一種具有多潛能分化的干細胞，在實驗中我們對感染前后的細胞進行了相關免疫鑒定。實驗結果表明，腺病毒感染C17.2神經干細胞，感染率較高；通過Western blot 檢測發現感染了Hsp75基因的神經干細胞能夠高效表達Hsp75蛋白；同時腺病毒感染后不會改變細胞的正常形態和誘導神經干細胞的分化，而且細胞的活性也不受影響，證實了腺病毒感染C17.2神經干細胞是一種可行且安全的方法。AD患者腦內神經細胞增殖受到抑制，很大程度上是由于腦內Aβ誘導神經毒性加速了神經細胞的壞死和凋亡；細胞的凋亡涉及到凋亡調控因子半胱氨酸蛋白酶，其中激活型caspase-3是凋亡過程中的最終執行者，caspase-3的活化程度直接反映了細胞的凋亡程度。我們的實驗結果顯示，Hsp75過表達能夠提高C17.2神經干細胞的存活率，減少細胞凋亡率；同時也下調了cleaved caspase-3蛋白的表達，說明Hsp75過表達能夠逆轉Aβ誘導神經干細胞的凋亡。

綜上所述，Hsp75 過表達能夠保護神經干細胞免受Aβ介導的神經毒性，其機制可能與抑制細胞的凋亡有關。此外，Hsp75過表達對于保護神經干細胞的具體機制有待于下一步的研究。

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(責任編輯： 林白霜， 羅森)

Over-expression of Hsp75 in neural stem cells reduced Aβ-mediated neurotoxicityWANG Yan1, 2, LIN Ji-zong3, CHEN Qin-zhuang4, JIA Si-yuan5, MA Yan-jiao1, WANG Yong1

(1DepartmentofPharmacy,ZhujiangHospital,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510282,China;2DepartmentofPharmacy,GuangdongHospitalofIntegratedChineseandWesternMedicine,Foshan528200,China;3DepartmentofHepatobiliarySurgery,TheThirdAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China;4DepartmentofPharmacy,GuangzhouHospitalofIntegratedChineseandWesternMedicine,Guangzhou510800,China;5DepartmentofBurn,ZhujiangHospital,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510282,China.E-mail:yongwh2005@163.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the effect of heat shock protein 75 (Hsp75) over-expression on Aβ-induced neurotoxicity in the neural stem cells and to explore its mechanism. METHODS: An adenovirus-mediated Hsp75 over-expression vector was usedinvitro. The mouse neural stem cell C17.2 was culturedinvitroand divided into control group, Aβ group, negative adenovirus vector transfection group and Hsp75 over-expression adenovirus vector transfection group. The transfection and cellular immune identification were detected by fluorescence microscopy. The cell morphology was observed under inverted phase-contrast microscope. The cell viability and apoptosis were detected by MTT assay and flow cytometry, respectively. Hsp75 over-expression and cleaved caspase-3 protein level were measured by Western blot. RESULTS: Observation by fluorescence microscopy indicated that C17.2 cells were successfully transfected andHsp75 gene was effectively expressed in the neural stem cells after transfection. In addition, the morphology and viability of the cells did not change and these cells did not differentiate after transfection. As compared with control group, the cell viability in Aβ group and negative adenovirus vector transfection group was significantly decreased (P<0.05), and the cell apoptotic rate and cleaved caspase-3 level (P<0.05) were increased. As compared with Aβ group and negative adenovirus vector transfection group, Hsp75 over-expression significantly increased the cell viability, and decreased the cell apoptosis and cleaved caspase-3 level (P<0.05). CONCLUSION: Hsp75 over-expression protects the neural stem cells against Aβ-induced injury. The mechanism may be related to inhibiting caspase-3 pathway-dependent apoptosis.

[KEY WORDS]Heat shock protein 75; C17.2 neural stem cells; Apoptosis

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.02.019

[中圖分類號]R363

[文獻標志碼]A

通訊作者△Tel: 020-61643555; E-mail: youngwp005@163.com

*[基金項目]廣東省自然科學基金資助項目(No. S2012010008199； No. S2013010015546)

[收稿日期]2015- 01- 05[修回日期] 2015- 11- 25

[文章編號]1000- 4718(2016)02- 0302- 05