BMP-7對高糖環境下腎小管上皮細胞Id2和E2A蛋白表達的影響*

曾令萍，　肖　瑛，　張瑩瑩，　張昌志，　吳德佩，　李圓圓，　石明雋，　郭　兵

(貴州醫科大學病理生理學教研室，貴州 貴陽 550025)

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BMP-7對高糖環境下腎小管上皮細胞Id2和E2A蛋白表達的影響*

曾令萍，肖瑛△，張瑩瑩，張昌志，吳德佩，李圓圓，石明雋，郭兵

(貴州醫科大學病理生理學教研室，貴州 貴陽 550025)

[摘要]目的： 通過觀察高糖環境下給予外源性骨形態發生蛋白-7(BMP-7)對腎小管上皮細胞(NRK-52E)表達分化抑制因子2(Id2)和轉錄因子E2A的影響，探討BMP-7減輕高糖誘導的腎小管纖維化病變的可能機制。方法: 將體外培養的腎小管上皮細胞NRK-52E分為3組：對照(control)組、高糖(HG)組和不同濃度BMP-7(10 μg/L和20 μg/L)干預組，HG組和干預組分別設12 h、24 h和48 h 3個時點。Western blot方法檢測Id2、E2A、上皮細胞鈣粘蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和Ⅰ型膠原(Col-Ⅰ)蛋白的表達，real-time PCR方法檢測Id2 mRNA的表達。結果: 與control組相比，HG組Id2的mRNA和蛋白水平及E-cadherin的蛋白水平明顯下調，E2A、α-SMA和Col-Ⅰ的蛋白水平明顯上調(P<0.05)；與HG組相比，20 μg/L BMP-7干預組Id2的mRNA和蛋白水平及E-cadherin的蛋白水平均較同時點顯著上調，E2A、α-SMA和Col-Ⅰ的蛋白水平顯著下調(P<0.05)。相關性分析結果顯示，Id2蛋白與E2A蛋白表達呈顯著負相關(P<0.05)。結論: BMP-7可阻斷高糖誘導的腎小管上皮細胞的纖維化，其機制可能與促進Id2蛋白并抑制E2A蛋白的表達有關。

[關鍵詞]NRK-52E細胞； 高糖； 骨形態發生蛋白-7； 分化抑制因子2； E2A

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)常見而嚴重的并發癥，進行性發展可導致終末期腎衰竭，深入研究防治DN纖維化病變的發生機制，對疾病的轉歸具有重要意義。分化抑制因子(inhibitor of differentiation,Id)屬于螺旋-環-螺旋(helix-loop-helix，HLH)轉錄因子家族，因缺乏堿性區域，可以與堿性螺旋-環-螺旋轉錄因子(basic helix-loop-helix，bHLH)E2A相結合形成異二聚體，從而發揮生物學效應。哺乳動物細胞含4種Id蛋白：Id1、 Id2、Id3和Id4。本課題組前期研究發現，DM大鼠隨病程的延長腎組織中Id2蛋白逐漸減少，促進了腎小管上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)及腎間質細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的沉積；控制血糖后Id2水平被上調，恢復了Id2對腎纖維化的負調節作用，從而使EMT過程逆轉，ECM沉積減輕[1]。另有研究發現骨形態發生蛋白-7(bone morphogenetic protein 7，BMP-7)具有抗纖維化作用，已有研究表明在肝纖維化、腎纖維化和肺纖維化疾病中BMP-7都能明顯降低細胞的纖維化水平[2-4]。在小鼠晶狀體上皮細胞中過表達BMP-7后可上調Id2、Id3的表達，從而逆轉小鼠因損傷誘導的EMT[5]。這些都提示在EMT的發生發展中BMP-7、Id2和E2A之間有著密切的聯系，而在高糖環境中三者的關系尚不清楚。本研究旨在觀察外源性BMP-7對高糖環境中腎小管上皮細胞Id2和E2A表達的影響，探討BMP-7減輕高糖狀態下腎小管纖維化的作用機制。

材料和方法

1細胞

大鼠腎小管上皮細胞NRK-52E細胞株購于上海中科院細胞庫。

2主要試劑

兩步法免疫組化檢測試劑、辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG、辣根過氧化物酶標記羊抗小鼠IgG、DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋)；I抗稀釋液、ECL 顯色劑、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、牛血清白蛋白(碧云天)；苯甲基磺酰氟(phenyl methyl sulfonyl fluoride，PMSF)和RIPA細胞裂解液(索萊寶)；PVDF膜、3 mm Whatman濾紙(Millipore)；低糖DMEM 培養基、胰酶蛋白、青霉素和鏈霉素(HyClone)；胎牛血清(Gibco)；RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo)；iQTMSYBR?Green Supermix(Bio-Rad)；Id2、E2A抗體(Santa Cruz)；rhBMP-7(Sigma)；Ⅰ型膠原(collagen Ⅰ，Col-Ⅰ)抗體(北京博奧森)；α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)、上皮細胞鈣黏蛋白(E-cadherin)、β-actin抗體(武漢博士德)。

3主要方法

3.1細胞培養與分組把NRK-52E細胞復蘇接種于25 cm2的培養瓶中，用含10% 胎牛血清的DMEM(含5.5 mmoL/L葡萄糖)培養。倒置顯微鏡下觀察，待細胞融合度達80%～90%時進行傳代。將狀態良好的細胞同步化處理后隨機分為3組：對照(control)組：用含有2% 胎牛血清的DMEM (含5.5 mmoL/L葡萄糖)培養，同步化后不予任何處理；高糖(high glucose,HG)組：用含有2% 胎牛血清的DMEM(含25 mmoL/L葡萄糖)培養；10 μg/L和20 μg/L BMP-7干預組：在含有2% 胎牛血清的DMEM(含25 mmoL/L葡萄糖)中加入不同濃度的BMP-7，使其終濃度分別為10 μg/L和20 μg/L。在高糖誘導和BMP-7干預后的12 h、24 h和48 h 3個時點收集RNA或蛋白進行后續實驗。

3.2免疫細胞化學染色將NRK-52E細胞接種至鋪有22 mm×22 mm蓋玻片的6孔板中，生長融合度達80%時，細胞同步化處理，PBS漂洗，細胞固定液固定，3% H2O2浸泡消除內源性過氧化物酶，10% 牛血清白蛋白封閉，予細胞角蛋白18(cytokeratin,CK18； 1∶50)、E-cadherin(1∶100)和α-SMA(1∶300)特異性抗體4 ℃孵育過夜。PBS漂洗后滴加即用型生物素標記的 II 抗，DAB室溫顯色，蘇木素復染，脫水，透明，晾干后，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并攝取圖像。

3.3Western blot檢測目的蛋白棄去細胞培養基后用生理鹽水清洗3次，加入細胞蛋白裂解液裂解細胞，12 000 r/min離心10 min，將上清轉移置一新的EP管中，取部分蛋白使用BCA試劑盒測定蛋白濃度。然后根據蛋白濃度加入上樣緩沖液配制成統一濃度的蛋白樣品，煮沸10 min。蛋白經SDS-PAGE分離后，轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST洗膜，分別加入Id2(1∶100)、E2A(1∶300)、E-cadherin(1∶200)、α-SMA(1∶200)和Col-Ⅰ(1∶200)的 I抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后加入相應 II 抗室溫孵育1 h，ECL顯影，壓片并分析結果。

3.4Real-time PCR檢測Id2 mRNA的表達TRIzol法提取總RNA，核酸蛋白儀檢測RNA濃度和純度后，使用Thermo試劑盒進行逆轉錄。通過Bio-Rad CFX 96TM熒光定量PCR分析系統進行檢測，以β-actin為內參照，目的基因的相對含量以2-△△Ct表示，引物序列和退火溫度見表1。

表1PCR引物序列及擴增條件

Table 1.The sequences and conditions of primers used in real-time PCR

Name Sequences(5'-3')AnnealingtemperatureId2Forward:TACGAGCAGCATGAAAGCCT58℃Reverse:GAGCTTGGAGTAGCAGTCGTβ-actinForward:GCCAACACAGTGCTGTCT58℃Reverse:AGGAGCAATGATCTTGATCTT

4統計學處理

所有數據用SPSS 17.0統計軟件分析處理，數據用均數±標準差(mean±SD)表示。多組比較采用單因素方差分析，若方差齊時，采用Bonferroni校正的t檢驗；若方差不齊時，則采用Games-Howell法檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1NRK-52E細胞中CK-18、α-SMA和E-cadherin的表達

免疫細胞化學結果顯示，在培養的NRK-52E細胞中腎小管上皮細胞標志蛋白CK-18、E-cadherin蛋白表達陽性，α-SMA表達陰性，說明培養的細胞為大鼠腎小管上皮細胞，見圖1。

2BMP-7對高糖培養不同時點NRK-52E細胞中E-cadherin、α-SMA和Col-Ⅰ蛋白表達的影響

Western blot結果顯示，與control組相比，HG組E-cadherin蛋白表達明顯減少(P<0.05)，以HG刺激24 h組減少最為顯著；與HG組比較，10 μg/L BMP-7干預組E-cadherin蛋白僅24 h時增多(P<0.05)；而20 μg/L BMP-7干預組E-cadherin蛋白在12 h、 24 h和48 h表達均顯著高于同期HG組(P<0.05)，24 h達最高峰。

Figure 1.Immunocytochemistry staining of CK-18, E-cadherin and α-SMA in NRK-52E cells (×400).

圖1CK-18、E-cadherin和α-SMA在NRK-52E細胞中的表達

α-SMA在control組有少量表達，HG 12 h、24 h和48 h其表達均顯著高于control組(P<0.05)；加入外源性10 μg/L的BMP-7干預后，HG 12 h和24 h組α-SMA的表達顯著低于同期HG組(P<0.05)，而20 μg/L BMP-7干預組，各時點的α-SMA的表達均顯著低于同期HG組(P<0.05)。

在control組Col-I有少量表達，HG 12 h、24 h和48 h其表達均顯著高于control組(P<0.05)；加入外源性BMP-7(10 μg/L或20 μg/L)后，Col-Ⅰ的蛋白表達較同期HG組均下調(P<0.05)，見圖2。

3BMP-7對高糖培養不同時點NRK-52E細胞中Id2 mRNA和蛋白表達的影響

Real-time PCR和Western blot結果顯示，與control組相比，HG組Id2的mRNA和蛋白表達顯著降低(P<0.05)；20 μg/L BMP-7干預組，各時點Id2的mRNA和蛋白的表達較同期HG組明顯上調(P<0.05)；而在10 μg/L BMP-7干預組，Id2的mRNA和蛋白僅在24 h時點表達顯著上調(P<0.05)，見圖3。

4BMP-7對高糖培養不同時點NRK-52E細胞中E2A蛋白表達的影響

Western blot結果顯示，與control組相比，HG 12 h、24 h和48 h組E2A的表達均明顯增多(P<0.05)；BMP-7干預組(10 μg/L和20 μg/L)組各時點E2A表達較同期HG組均明顯下調(P<0.05)，見圖4。

Figure 2.The effects of BMP-7 on the protein expression of E-cadherin, α-SMA and Col-I in NRK-52E cells under different conditions. Mean±SD.n=3.#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsHG group.

圖2BMP-7對高糖培養不同時點NRK-52E細胞中E-cadherin、α-SMA 和Col-Ⅰ蛋白表達的影響

Figure 3.The effects of BMP-7 on the mRNA and protein expression of Id2 in NRK-52E cells under different conditions. Mean±SD.n=3.#P<0.05vscontrol group；*P﹤0.05vsHG group.

圖3BMP-7對高糖培養不同時點NRK-52E細胞中mRNA和Id2蛋白表達的影響

Figure 4.The effects of BMP-7 on the protein expression of E2A in NRK-52E cells under different conditions. Mean±SD.n=3.#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsHG group.

圖4BMP-7對高糖培養不同時點NRK-52E細胞中E2A蛋白表達的影響

5高糖條件下不同時點NRK-52E細胞中Id2蛋白與E2A蛋白表達量的相關性分析

相關性分析結果顯示，Id2蛋白與E2A蛋白表達呈顯著負相關，在12 h、24 h和48 h這3個時點的相關系數分別為-0.869、-0.957和-0.991(P<0.05)，見圖5。

Figure 5.Correlation analysis between Id2 and E2A protein expression at different time points in NRK-52E cells under high glucose conditions.

圖5高糖條件下不同時點NRK-52E細胞中Id2蛋白與E2A蛋白表達量的相關性分析

討論

大量研究表明，腎小管上皮細胞發生EMT后伴隨ECM的生成增多和降解減少，是腎小管間質纖維化包括DN發生發展的重要機制之一[6]。本研究顯示，高糖培養NRK-52E細胞12 h、24 h和48 h后，腎小管上皮細胞標志性蛋白E-cadherin的表達顯著減少，間充質細胞標志性蛋白α-SMA的表達明顯增多，并伴有Col-Ⅰ的高表達，這表明在高糖持續刺激下NRK-52E細胞發生了EMT，同時合成和分泌大量ECM。這與本課題前期研究結果一致[7]。

Id 蛋白是一種廣泛存在于哺乳動物細胞中的核轉錄因子的負調控蛋白，屬于HLH 轉錄因子家族特別成員，哺乳動物含有4種Id因子(Id1～Id4)，119～199 個氨基酸殘基。Id蛋白缺乏堿性DNA結合區，可以與bHLH形成異二聚體，抑制bHLH與DNA及其它組織特異性bHLH轉錄因子結合，抑制細胞分化并促進細胞的增殖[8]。目前有研究發現，Id2與一些臟器纖維化有關，并且有維持細胞正常生物學形態和抑制轉分化的作用。過表達Id2可以維持肺泡上皮細胞表型，減輕肺纖維化[9]。在肝星狀細胞中，通過逆轉錄病毒感染Id2可顯著抑制α-SMA和Col-Ⅰ的mRNA表達，調節肝星狀細胞的轉分化[10]。目前國內外學者研究Id2在腫瘤、免疫系統及纖維化疾病中的作用機制時，都涉及到bHLH家族轉錄因子E2A基因[11-13]。E2A基因(又稱TCF3，免疫球蛋白增強子結合因子E12/E47，ITF1)可以編碼2種不同類型的蛋白產物，分別為E47和E12。已有研究證明E12和E47抑制E-cadherin表達并且可以調控α-SMA的表達[14-15]。免疫抑制劑環孢菌素A誘導人腎小管上皮細胞HK-2發生EMT過程中E2A表達逐漸增多；另外過表達E2A后α-SMA表達增多，E-cadherin表達減少，表明E2A在環孢菌素A誘導的EMT進展中有著重要作用[16]。Kondo等[11]研究發現TGF-β1誘導小鼠乳腺上皮細胞NMuMG的過程中能與E2A相互作用的Id蛋白表達下調，E2A產物增多并直接抑制E-cadherin表達，最終發生EMT。本研究顯示，高糖刺激NRK-52E細胞后，Id2的蛋白和mRNA表達減少而E2A表達增多，且二者呈顯著的負相關并伴隨E-cadherin的表達顯著減少，α-SMA的表達明顯增多及Col-Ⅰ的增多，提示高糖環境中Id2和E2A蛋白參與了腎小管上皮細胞EMT的發生過程。

BMP-7作為一種成骨蛋白，屬于TGF-β超家族中的一員，是維持腎臟正常發育的重要因子。本課題組前期研究發現，高糖刺激腎小管上皮細胞，BMP-7的蛋白和mRNA表達顯著減少[17]。相反，Wang等[18]運用基因轉染動物在DN病程中過表達BMP-7，可減輕尿蛋白的含量，改善腎功能，減少腎間質Col-Ⅰ及FN的沉積。Veerasamy等[19]也發現外源性的BMP-7可以通過Smad1/5信號通路上調Id2的表達來抑制TGF-β1刺激人近端腎小管上皮細胞后引起的α-SMA增多。然而，在高糖狀態下，腎小管上皮細胞Id2和E2A表達變化是否受到BMP-7調節，目前還不清楚。因此，我們體外培養腎小管上皮細胞，在高糖環境中同時加入不同劑量的BMP-7(10 μg/L和20 μg/L)，并設12 h、24 h和48 h 3個時點，觀察BMP-7對高糖狀態下Id2和E2A表達的影響。結果顯示，BMP-7可以顯著逆轉同時點高糖誘導的Id2的mRNA和蛋白下調及E2A蛋白的上調，使E-cadherin蛋白表達上調，而α-SMA和Col-Ⅰ蛋白表達下調，提示Id2的mRNA和蛋白減少及E2A蛋白增多，可能是高糖狀態下腎小管上皮細胞發生EMT，腎間質出現ECM沉積的原因之一，而BMP-7可能通過Smad1/5信號通路誘導Id2表達，抑制E2A活性，恢復E-cadherin的表達，減輕腎小管上皮細胞的EMT，減少腎間質ECM的沉積，減輕腎纖維化病變。但是Id2是直接還是通過某些機制調控E2A的還不清楚，需要進一步研究。

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(責任編輯： 陳妙玲， 余小慧)

Effects of BMP-7 on Id2 and E2A expression in NRK-52E cells exposed to high glucoseZENG Ling-ping, XIAO Ying, ZHANG Ying-ying, ZHANG Chang-zhi, WU De-pei, LI Yuan-yuan, SHI Ming-jun, GUO Bing

(DepartmentofPathophysiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550025,China.E-mail：yxhx20060725@126.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the effects of bone morphogenetic protein 7 (BMP-7) on the expression of transcription factor E2A and inhibitor of differentiation 2 (Id2) in the renal tubule epithelial cells(NRK-52E)exposed to high glucose, and to explore its possible mechanism of improving renal tubular fibrosis induced by high glucose. METHODS: The NRK-52E cells were divided into control group, high glucose (HG) group and high glucose with different doses of BMP-7 (10 μg/L and 20 μg/L) group. The cells in HG group and BMP-7 group were cultured for 12 h, 24 h and 48 h. The protein expression of Id2, E2A, E-cadherin, α-smooth muscle actin (α-SMA) and collagen-I was detected by Western blot. In addition, the mRNA expression of Id2 was detected by real-time PCR. RESULTS: Compared with control group, the mRNA and protein levels of Id2 and the protein level of E-cadherin were down-regulated, while the protein levels of E2A, α-SMA and collagen-I were up-regulated in HG group (P<0.05). Compared with HG group, the mRNA and protein levels of Id2 and the protein level of E-cadherin were significantly up-regulated, while the protein expression of E2A, α-SMA and collagen-I was significantly down-regulated in 20 μg/L BMP-7 group (P<0.05). The correlation analysis showed that the Id2 protein level was negatively correlated with the E2A protein level (P<0.05). CONCLUSION: BMP-7 may intercept the process of renal tubule fibrosis induced by high glucose via promoting the expression of Id2 and inhibiting the expression of E2A at protein level.

[KEY WORDS]NRK-52E cells; High glucose; Bone morphogenetic protein-7; Inhibitor of differentiation 2; E2A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.02.022

[中圖分類號]R363; R 573.1

[文獻標志碼]A

通訊作者△Tel: 0851-8174011； E-mail: yxhx20060725@126.com

*[基金項目]國家自然科學基金資助項目(No. 81360116)；貴州省科學技術基金(黔科合J字[2011]2120號)；貴州省衛生廳科學技術基金項目(黔衛發[2013]71號)

[收稿日期]2015- 08- 28[修回日期] 2015- 12- 08

[文章編號]1000- 4718(2016)02- 0321- 06