肺炎鏈球菌實驗室診斷方法的研究進展

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肺炎鏈球菌實驗室診斷方法的研究進展

劉美蓉1(綜述)，譚效鋒1，陳哲2*(審校)(1.天津醫院普內科，天津 300211；2.天津醫科大學總醫院保健醫療部，天津 300052)

[關鍵詞]肺炎球菌感染；診斷技術和方法；綜述文獻

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2016.02.034

在世界范圍內，下呼吸道感染是感染性疾病的主要死亡原因[1]，但約40%社區獲得性肺炎(community-acquired pneumonia，CAP)仍然病原不明確，致病原可能為肺炎鏈球菌[2-3]，分析其原因為：①肺炎鏈球菌是一種苛養菌，可以產生自溶酶，送檢時間要求嚴格，實驗室中普通培養基或涂片革蘭染色檢查可與草綠色鏈球菌混淆，培養和菌種菌型鑒別過程復雜，導致診斷率降低；②社區感染患者住院率低，因培養檢查時間長，門診留取標本培養比例也低[4]，同時早期抗生素的應用降低了血及胸腔積液培養的陽性率；③由于侵入性診斷技術的應用局限，人為因素導致痰標本的合格率低。所以，臨床診斷肺炎鏈球菌性肺炎目前存在一定困難，易導致誤診延誤治療，尤其在患者出現耐藥肺炎鏈球菌感染時。因此，一些新的實驗室診斷方法應運而生，如免疫層析法(immunochromatographic test，ICT)、酶聯免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、乳膠顆粒凝集試驗(latex particle agg lutination test，LPAT)、聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)等。近年研究顯示ICT尿肺炎鏈球菌抗原檢測可以明顯提高臨床診斷率[5-9]。現就肺炎鏈球菌的病原學特點及實驗室診斷方法綜述如下。

1肺炎鏈球菌的病原學特點

1.1形態特征肺炎鏈球菌簡稱肺炎球菌，舊稱肺炎雙球菌，是痰液中分離出的，革蘭染色陽性，電鏡下可見菌體似矛頭狀，涂片檢查成雙或成短鏈狀排列的雙球菌。

1.2致病機制除了細菌莢膜是肺炎鏈球菌的主要毒力因子，溶血素和神經氨酸酶也是致病物質。肺炎鏈球菌可以通過表面蛋白和人類鼻咽部上皮細胞表面受體相互作用而使細菌黏附于細胞。在呼吸道上皮層無損傷時，細菌可定植于呼吸道黏膜，與人處于共生狀態，無致病性[10-11]。近年研究顯示，不同人群上呼吸道攜帶此菌的比例有差別，如兒童高于成人[12]，低收入國家人群高于發達國家人群等[13]。當上呼吸道黏膜防御功能及正常肺部清除機制受損時易引發疾病，如炎性反應后上呼吸道黏膜損傷、慢性肺部結構病變等。該菌主要引起人類的肺炎，以大葉性實變為主要表現，也可以表現為小葉性肺炎，其次是支氣管炎。肺炎鏈球菌引起肺炎后可繼發中耳炎、乳突炎、肺膿腫、腦膜炎和敗血癥等。

1.3耐藥性肺炎鏈球菌對青霉素的耐藥機制是由青霉素結合蛋白(penicillin binding protein,PBP)-1a、PBP-2a、PBP-2b、PBP-2x質量和數量突變所引起的。對青霉素耐藥的菌株對其他β-內酰胺類抗生素的敏感性也會降低。對β-內酰胺類抗生素耐藥的肺炎鏈球菌常表現出多重耐藥，如四環素類、大環內酯類、氯霉素類和磺胺異噁唑等藥物，目前肺炎鏈球菌對氟喹諾酮類仍保持敏感，耐藥菌株相對較少。肺炎鏈球菌對大環內酯類的耐藥主要通過2種機制：①由erm介導的核糖體甲基化和由mef介導的外排泵系統；②有少數菌株由于核糖體突變導致耐藥[10]。不但青霉素耐藥的肺炎鏈球菌發生率在我國不同地區有較大差異，對青霉素不敏感菌株(penicillin is not sensitive strains of streptococcus pneumoniae，PNSSP)的比例也有差異。兒童感染PNSSP的機會要大于成人。有研究顯示急性呼吸道感染患兒細菌性因素中肺炎鏈球菌占有比例最高約12.0%，并且200株肺炎鏈球菌中,耐青霉素的肺炎鏈球菌有182株(91.0%)[14]。肺炎鏈球菌對大環內酯類藥物的耐藥率甚至可達到96%[4]。劉又寧等[15]研究顯示，我國導致CAP的肺炎鏈球菌對大環內酯類抗生素耐藥率達75.0%以上,對青霉素的不敏感率為20.3%。國內相近文獻也報道452例CAP患者中明確病原體感染者187例，其中41株肺炎鏈球菌有產超廣譜β-內酰酶18株(43.9%)[16]。不僅肺炎鏈球菌在下呼吸道感染中耐藥性較高，在皮膚感染中也具有很高的耐藥性，國內文獻報道大面積燒傷患者皮膚感染來源的肺炎鏈球菌氨曲南、阿米卡星、美洛培南的耐藥性較高，分別為85.4%、90.6%和76.9%[17]。

1.4致病性感染耐藥肺炎鏈球菌后會加重患者的病情程度，增加預后不良風險。耐藥肺炎鏈球菌感染的危險因素包括：①年齡>65歲或<2歲；②3個月內曾用β-內酰胺類抗生素；③酗酒；④內科慢性疾病(包括慢性心、肺、肝、腎疾病，糖尿病，惡性腫瘤，脾臟缺如，免疫抑制性疾病)；⑤免疫抑制狀態(疾病所致或使用免疫抑制劑治療的)；⑥接觸過托幼所的兒童。所以據統計是否存在敗血癥、年齡和潛在性基礎疾病等因素肺炎球菌性肺炎的病死率有時甚至可高達30%[2-18]。另外，引起重癥肺炎最多的病原體也是肺炎鏈球菌，其特定的基因型感染人后可產生大量內毒素而引起嚴重的全身系統性炎癥反應綜合征，因此導致重癥肺炎患者的病死率增高[19]。

2肺炎鏈球菌的傳統實驗室診斷方法

2.1肺炎鏈球菌的培養可作為培養的標本包括痰液、膿液、血液、腦脊液、肺泡灌洗液等標本，其中合格痰的標準是革蘭染色顯微鏡下鱗狀上皮細胞<10個/低倍鏡視野、多核白細胞>25個/低倍鏡視野，或二者比例<1∶2.5。合格的痰標本再進一步培養鑒定。典型的肺炎鏈球菌鏡檢革蘭染色涂片為陽性球菌，菌體呈矛頭狀成雙排列，坦面相鄰，尖端向外，有時可以診斷；肺炎鏈球菌正常生長營養要求較高，為苛養菌，在普通培養基上生長不良，容易誤認為草綠色鏈球菌，在含血液或血清的培養基上才能生長，所以分離培養常采用羊血平板，并且有助于其溶血特征的識別和進一步鑒定。在血平板上，肺炎鏈球菌的菌落呈灰白色、半透明狀，直徑0.5～1.5 mm，菌落表面光滑扁平狀，也有菌株可表現為黏液狀，菌落周圍可見環繞著草綠色溶血環。因該菌可產生自溶酶，培養或放置24 h以上的培養物還會由于肺炎鏈球菌的自溶作用而使菌落中央塌陷邊緣隆起，呈臍窩狀，是一種典型的形態表現。肺炎鏈球菌還有一個特點就是經人工培養后莢膜逐步消失[20]。

2.2肺炎鏈球菌菌種的鑒定實驗該菌落在普通瓊脂培養基上呈綠色，易與草綠色鏈球菌混淆，所以實驗室常采用以下常規鑒定方法。①膽汁溶菌試驗：該試驗的原理是基于膽鹽能夠通過活化肺炎鏈球菌的自溶酶而溶解肺炎鏈球菌，但它不能溶解草綠色鏈球菌。常用的方法包括試管法、平板法和玻片法等。其中試管法更為常用，具體操作是取2滴10%去氧膽酸鈉溶液加入在1 mL待鑒定菌的18～24 h培養液中，于35 ℃下孵育5~10 min后進行鑒定，菌管內液體由混濁變為透明者為陽性，若仍渾濁為陰性；平板法是取一個接種環，取2%去氧膽酸鈉溶液加于血平板待鑒定菌的菌落上，于35 ℃下孵育15～30 min，菌落溶解消失者為陽性，未消失或未完全消失者為陰性；最后玻片法是分別取1滴血培養液加至2張玻片上，在其中1張玻片上加入1滴10%去氧膽酸鈉，在另一張玻片上加入1滴生理鹽水，予以自然干燥處理，干燥后進行革蘭染色，再油鏡下觀察，如發現球菌完全被溶解，而對照玻片上顯示細菌完全未溶解或部分溶解為陽性結果[18]。②奧普托欣試驗：也是與其他草綠色鏈球菌相鑒別的手段。具體方法是用接種環將單個待鑒定菌落均勻涂于血平板上，用含量為5 μg的奧普托欣紙片貼于接種區中央，在35 ℃下行需氧培養，并過一夜后觀察，如果抑菌圈>18 mm為陽性。

2.3肺炎鏈球菌菌型鑒定一些特殊血清型的肺炎鏈球菌(如血清型3和37)生長形態不典型，需要做進一步菌型鑒別，常用的方法有：①莢膜腫脹試驗也稱為Quellung試驗，用新鮮的標本懸液與等量不稀釋的肺炎球菌分型診斷血清混合后，覆以蓋玻片，在油鏡下觀察，標本中肺炎球菌若與同型免疫血清相遇，其莢膜將顯著增大。②凝集試驗，將可疑肺炎球菌與已知標準分型的血清作玻片凝集試驗，若細菌凝集成堆，則為同型肺炎球菌。

3肺炎鏈球菌的實驗室新近診斷方法

以上傳統培養方法要求實驗室具備一定的條件，對實驗人員的技術要求高，但因試驗步驟繁多，不確定因素較多，故而試驗敏感性差，并且獲得檢驗結果需要時間長，為臨床肺炎鏈球菌感染的診斷帶來困難，所以近年來一些快速簡便敏感性較高的檢測方法逐漸顯現優勢。

3.1ICTICT是一種檢測肺炎鏈球菌可溶性抗原的快速方法,目前在我國尚未廣泛應用于臨床。其檢測抗原為C-polysaccharide(PnC)抗原,位于細菌細胞壁的C多糖中,為肺炎球菌各血清型所共有。由于ICT以尿樣作為檢測對象,所以又稱尿抗原檢測法。美國Binax,Inc公司生產Binax NOW Streptococcus pneumoniae Test試劑盒目前在國外應用較為廣泛，并有較多文獻研究其敏感性、特異性。Binax NOW試劑的臨床敏感性和特異性，在美國多家機構及中心進行了較大樣本的研究。其中包括回顧性研究和前瞻性研究，回顧性研究用標準方法推算Binax NOW試驗性能，敏感性是86%、特異性為94%、總準確度是93%，95%可信區間分別是71%~94%、91%~96%、90%~95%。前瞻性研究用Binax NOW試驗對住院患者和門診患者進行了同等測試，門診性能：敏感性90%、特異性78%、準確度80%，95%可信區間分別是70%~97%、70%~85%、72%~86%。住院性能：敏感性90%、特異性71%、準確度73%，95%可信區間分別是60%~98%、59%~80%、62%~82%。該試劑敏感性能數據指標還作出血清型評估：代表23個肺炎鏈球菌血清型的44株分離菌株引起了美國乃至全世界90%以上肺炎球菌感染。它們都在培養基上生長且在105細胞/mL時Binax NOW試驗陽性。尿液檢測限把1∶250稀釋度作為Binax NOW試驗的檢測限。該試劑交叉反應性指標尿液檢測回顧性研究中從338位陰性患者中分離出270種微生物，當用純培養進行測試時，這些微生物在Binax NOW試驗中均未產生交叉反應性。全微生物檢測為了確定Binax NOW試驗的分析特異性，收集了144份交叉反應物，包括與肺炎有關的微生物和可能作為正常菌群在泌尿生殖道發現的微生物，以及引起尿道感染的微生物。所有微生物都在106~109CFU/mL用Binax NOW試驗進行了評估，在144例微生物中有143例無交叉反應性，唯一陽性的微生物是緩和鏈球菌，由于它和Binax NOW試驗有共同抗原，交叉反應是可預期的。干擾物質檢測用Binax NOW肺炎鏈球菌試驗對白細胞數(每低倍鏡視野的數量)、紅細胞數(每低倍鏡視野的數量)、蛋白(5 g/L)、糖(>20 g/L)、混濁度升高的尿液標本進行了評估，發現對試驗性能沒有造成影響。重復性研究分別在3家床邊護理機構用一組含陰性、弱陽性、陽性、強陽性的單盲編碼標本對Binax NOW肺炎鏈球菌抗原檢測試劑盒(膠體金法)進行單盲研究。含有硼酸和不含硼酸的樣本都進行了測試。參與者在3 d內對每一標本進行多次測試。359份測試標本中有357份(99.4%)產生了預期結果。此試劑盒在成人診斷中有較好的敏感性和特異性,而在兒童中特異性差異較大，可以作為診斷成人肺炎球菌性CAP的有效方法之一。Monno等[21]選取2007年1月—2012年2月1 414例CAP患者做的回顧性研究顯示，該方法敏感性高于痰培養、血培養。Genné等[5]選取67例CAP成年患者與81例健康者作對照后獲得尿肺炎鏈球菌抗原檢測試劑的敏感性為64.3%，特異性為98.8%。

但Binax NOW檢驗方法有一定的局限性：①Binax NOW肺炎鏈球菌抗原檢測試劑盒(膠體金法)僅用尿液和腦脊液標本驗證過，其他可能含有肺炎鏈球菌抗原的標本(如血漿或其他體液)尚未進行過評價。②Binax NOW試驗陰性不能排除肺炎鏈球菌感染，因此應與培養結果、血清學或其他抗原檢測方法學結合作出準確診斷。③未對服用抗生素超過24 h的患者或新近完成抗菌治療的患者用Binax NOW肺炎鏈球菌抗原檢測試劑盒(膠體金法)進行過評價，也未對非處方藥對肺炎球菌性腦膜炎患者的影響進行確定。④使用肺炎鏈球菌疫苗后48 h內可能對尿液中 Binax NOW肺炎鏈球菌抗原檢測試劑盒(膠體金法)造成假陽性結果。疫苗對肺炎球菌腦膜炎患者的影響未做確定。因此，建議使用肺炎鏈球菌疫苗后5 d內不要進行Binax NOW肺炎鏈球菌檢測。⑤Binax NOW試驗對小兒尿液的準確性還未得到證實，另對小兒腦脊液的性能已得到了證實。

3.2ELISAELISA特異性好,敏感性高,是具有較好應用前景的方法之一。采用ELISA 檢測尿樣中完整形態的肺炎球菌溶血素分子，與ICT相比有相似的敏感性[22]，但操作方法與結果獲得不如ICT方便快捷。

3.3LPATLPAT操作簡便、結果快速,是較早用于檢測肺炎球菌的血清學方法，但LPAT存在較多假陽性結果,結果分析帶有主觀性,其檢測的PCA抗原為特異型抗原,檢測不同血清型肺炎球菌需要不同抗體,而ICT檢測的PnC 抗原為各血清型所共有。因此,與ICT 相比,LPAT 還存在局限性,不能用于肺炎球菌各血清型的檢測[9]。

3.4PCRPCR敏感性高、特異性強,特別是實時定量PCR方法。實時定量PCR 可重復定量檢測擴增產物,在擴增的每個循環中至少收集一次熒光數據,對擴增產物進行實時監控,從而增加了PCR特異性和敏感性。但是與ICT相比,PCR仍是一種相對復雜、費時的檢測方法,全過程需10 h左右,還未完全標準化,因而尚未成為肺炎球菌的臨床診斷方法,主要作為實驗室研究的技術方法[9]。

此外，還有環介導恒溫擴增技術快速檢測痰標本肺炎鏈球菌的方法[23]，血液中肺炎鏈球菌的建立擴增片段長度多態性快速檢測方法等[24]。近年來Sawa等[25]在動物實驗中證實，抗體檢測核糖體蛋白L7/L12有可能成為一種新的有發展前景的檢測手段；Hotomi等[26]提出ODK-0901多克隆抗體檢測肺炎鏈球菌引起的急性中耳炎和急性鼻竇炎比肺炎鏈球菌尿抗原檢測更有價值，尤其對于兒童患者。

4結語

肺炎鏈球菌檢測有諸多方法，但就其快速、簡單的特性首選是ICT，在各國臨床醫生工作和研究中尿肺炎鏈球菌抗原檢測已十分普及，該檢測手段與傳統實驗比較有更高的敏感性和特異性[5]；同時為臨床醫師選擇抗生素提供了良好地依據，減少了患者的診治費用。目前由于抗生素的不規范使用，臨床醫生初次診治CAP患者時其多已使用一種或多種抗生素，所以使用抗生素后對肺炎鏈球菌抗原檢測敏感性的影響尚需進一步研究，以便為臨床醫生檢測患者時提供可靠依據，提高肺炎鏈球菌性肺炎的診斷率。

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(本文編輯：趙麗潔)

·綜述·

[中圖分類號]R515.9

[文獻標志碼]A

[文章編號]1007-3205(2016)02-235-05

通訊作者*。E-mail:tjzyycz@sina.com

[作者簡介]劉美蓉(1978-)，女，河北景縣人，天津醫院主治醫師，醫學碩士，從事普內科疾病診治研究。

[收稿日期]2014-06-04；[修回日期]2014-06-24