MIF抑制劑ISO-1在妊娠大鼠重癥急性胰腺炎肺損傷中的作用

李晨，王衛星，左騰，石喬，王鵬，趙亮，梅方超

(武漢大學人民醫院肝膽腔鏡外科，湖北武漢430060)

MIF抑制劑ISO-1在妊娠大鼠重癥急性胰腺炎肺損傷中的作用

李晨，王衛星，左騰，石喬，王鵬，趙亮，梅方超

(武漢大學人民醫院肝膽腔鏡外科，湖北武漢430060)

目的探討巨噬細胞移動抑制因子(MIF)在孕鼠重癥急性胰腺炎(SAP)肺損傷中的作用。方法30只晚期SD孕鼠使用隨機數字表法隨機分為孕鼠組(SO組)、孕鼠SAP組(SAP組)和孕鼠MIF抑制劑ISO-1預處理組(ISO-1組)，每組均為10只。逆行膽胰管注射5%?；悄懰徕c制備SAP模型。術后12 h處死大鼠取血檢測血清淀粉酶(AMY)。取胰腺組織及肺組織行病理學檢查并評分，免疫組化檢測肺組織中MIF、核因子κB(NF-κB)及腫瘤壞死因子α(TNF-α)表達。結果SAP組孕鼠的血清淀粉酶(AMY)、胰腺及肺組織病理評分較SO組均有顯著增高，差異有統計學意義(P＜0.05)；SAP組孕鼠肺組織中的MIF、NF-κB及TNF-α表達較SO組也顯著增強，差異有統計學意義(P＜0.05)。ISO-1組上述指標較SAP組均有顯著改善，差異有統計學意義(P＜0.05)。MIF的表達與NF-κB及TNF-α的表達均呈正相關，相關系數分別為r=0.815和r=0.787，P＜0.05。結論MIF抑制劑ISO-1對孕鼠急性重癥胰腺炎肺損傷具有一定的保護作用，其部分機制可能與抑制NF-κB及TNF-α的激活有關。

妊娠合并急性胰腺炎；肺損傷；巨噬細胞移動抑制因子；核因子-κB；腫瘤壞死因子-α

妊娠合并急性胰腺炎(Acute pancreatitis in pregnancy，APIP)是妊娠合并外科急腹癥的首位病死原因[1]，發病率為1/3 000～1/1 000[2]，具有起病急、發展快、易出現多臟器功能衰竭和病死率高的特點。有報道APIP并發肺損傷(ALI)、急性呼吸窘迫綜合征(Acute respiratory distress syndrome，ARDS)及多器官功能障礙綜合征(Multiple organ dysfunction syndrome，MODS)在APIP中的發生率高達60%[3]。目前關于APIP的實驗研究較少，本研究旨在探討巨噬細胞移動抑制因子(MIF)在孕鼠重癥急性胰腺炎(SAP)肺損傷發病機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組妊娠晚期SD大鼠30只，孕期16～17 d，體重330～380 g，由武漢大學動物實驗中心提供。使用隨機數字表法隨機分為三組：孕鼠組(SO組)，孕鼠SAP組(SAP組)，孕鼠MIF抑制劑ISO-1預處理組(ISO-1組)，每組均為10只。

1.2 主要試劑牛磺膽酸鈉購自美國Sigma公司，MIF抑制劑ISO-1購自美國Santa Cruz公司，MIF抗體、TNF-α抗體購自美國Abcam公司，NF-κB抗體購自美國CST公司。

1.3 動物模型制作與處理實驗前大鼠禁食12 h，自由飲水。麻醉動物取仰臥位，碘伏棉球消毒腹部后鋪洞巾，無菌操作下上腹正中切口入腹，肝門處分離出膽總管后，以無損傷血管夾夾閉。使用4.5#注射針頭穿十二指腸壁，經十二指腸大乳頭逆行穿刺進入膽胰管，以無損血管鉗夾閉近乳頭處的膽胰管與穿刺針。以微量注射泵向膽胰管恒速(0.1 ml/min)注入5%?；悄懰徕c(1 ml/kg)。注射完畢后，抽出針頭的同時原位夾閉膽胰管5 min，確認周圍胰腺組織立即出現水腫、出血、壞死后松開無損傷血管夾，逐層縫合關閉腹腔，SAP造模完畢。SO組孕鼠開腹后僅翻動十二指腸和胰腺后關腹。SO組及SAP組術前30 min經腹腔注射5%DMSO(2 ml/kg)，ISO-1組術前30 min腹腔注射溶解ISO-1(7.0 mg/kg)的5%DMSO(2 ml/kg)溶液。大鼠蘇醒后禁食不禁水，分籠喂養。

1.4 標本獲取各組大鼠依照時間于術后12 h處死，下腔靜脈穿刺取血，2 000 r/min離心血清15 min后凍存備用。取適量胰頭、右肺上葉組織，4%多聚甲醛固定，常規石蠟包埋、切片，取部分肺組織-80℃保存備用。

1.5 指標檢測

1.5.1 生化指標檢測采用全自動多功能生化分析儀檢測大鼠血清淀粉酶(AMY)水平(武漢大學人民醫院檢驗科)。

1.5.2 HE染色觀察胰腺及肺組織病理變化將胰腺及肺組織固定包埋后切片，HE染色并進行光鏡觀察。胰腺病理評分參照文獻[3]，根據胰腺是否出現水腫、壞死、出血和脂肪壞死、炎癥和血管炎性細胞浸潤進行病理學評分。肺損傷組織學評分參照文獻[4]，根據肺泡壁水腫程度、中性粒細胞和單核細胞的浸潤程度以及間質和肺泡腔出血范圍來判斷肺損傷的程度。

1.5.3 免疫組織化學染色各組取肺組織切片，脫蠟水化后行抗原修復，阻斷內源性過氧化氫酶，一抗二抗孵育、鏈霉素抗生物素-過氧化物酶依次孵育后，DAB顯色。觀察MIF、NF-κB及TNF-α表達，并使用Image pro-Plus6.0軟件進行累計光密度(IOD)值測量，進行表達半定量分析。

2 結果

2.1 胰腺生化及病理學檢查SAP組大鼠血清AMY水平較SO組顯著升高。ISO-1組AMY水平與SO組相比升高明顯(P＜0.05)，但與SAP組相比較，淀粉酶水平明顯降低，差異有統計意義(P＜0.05)。胰腺病理觀察，SO組胰腺小葉結構完整，無明顯病理改變或僅見輕度水腫。SAP組胰腺切片可見胰腺不同程度的水腫、出血及片狀壞死，腺葉間隙增寬和炎性細胞浸潤，病理評分較SO組顯著增加(P＜0.05)；ISO-1組胰腺腺泡輕度水腫，間質內有少量出血及炎性細胞浸潤，病理評分較SAP組大鼠顯著降低(P＜0.05)，見表1。

2.2 肺組織病理改變與評分SO組肺組織結構清晰，肺泡壁完整，肺間質無滲出。SAP組肺間隔增寬，大量炎癥細胞浸潤，肺泡腔內大量滲出物，肺泡腔塌陷，局灶性實變，病理評分較SO組大鼠顯著升高(P＜0.05)。ISO-1組肺間質增寬，充血水腫，有少量炎性細胞浸潤，病理評分較SAP組大鼠顯著降低(P＜0.05)，見表1及圖1。

注：與SO組比較，aP＜0.05；與SAP組比較，bP＜0.05。

2.3 免疫組織化學檢查肺組織中MIF、NF-κB及TNF-α表達采用免疫組織化學染色法染色，SAP組孕鼠肺組織中MIF、NF-κB及TNF-α的表達明顯增加，IOD值較SO組顯著升高；ISO-1組孕鼠肺組織中MIF、NF-κB及TNF-α的表達顯著少于SAP組，IOD值顯著降低；各組間差異有統計學意義(P＜0.05)，見圖2、圖3、圖4。

圖1 各組大鼠肺組織病理改變(HE×200)

圖2 各組大鼠肺組織中MIF的表達(×200)注：A：SO組；B：SAP組；C：ISO-1組；D：MIF IOD值。

圖3 各組大鼠肺組織中NF-κB的表達(×200)注：A：SO組；B：SAP組；C：ISO-1組；B：NF-κB IOD值。

圖4 各組大鼠肺組織中TNF-α的表達(×200)注：A：SO組；B：SAP組；C：ISO-1組；D：TNF-α IOD值。

2.4 相關性分析各組孕鼠肺組織中MIF的表達與NF-κB的表達呈正相關，相關系數為r=0.815，P值小于0.01；各組孕鼠肺組織中MIF的表達與TNF-α的表達呈正相關，相關系數為r=0.787，P＜0.05。

3 討論

近年來，隨著生活水平的提高和飲食結構的改變，APIP的發病率有升高的趨勢，其不僅影響妊娠進展及胎兒成長，還極易伴發全身炎癥反應綜合征(SIRS)、ARDS、MODS，增加母嬰圍產期的死亡率[5]。因此筆者研究MIF在APIP肺損傷中的作用對于保護APIP母嬰在圍產期的安全具有重要意義。

本實驗結果顯示，SAP組孕鼠血清AMY水平及胰腺、肺組織病理學評分較SO組顯著升高，提示APIP合并肺損傷模型建立成功，APIP中胰腺和肺損傷程度呈正相關；免疫組化結果顯示SAP組孕鼠肺組織中MIF、NF-κB及TNF-α的表達較SO組顯著升高，提示APIP發病過程中肺組織中MIF及炎癥因子表達增加，與肺損傷程度密切相關。

近年來，MIF已被證實在SAP[6-7]、ARDS[8-9]及膿毒癥休克等危重疾病的致病機制中起著關鍵作用。MIF是集細胞因子、趨化因子、神經-內分泌激素和生物酶特性于一身的多效能蛋白分子，可抑制巨噬細胞的游走，促進巨噬細胞在炎癥局部浸潤、增生、分泌一些細胞因子，如IL-1 β、IL-6、IL-8、TNF-α和IFN-γ等[10]。TNF-α是SAP中的一個最早升高并起核心作用的促炎因子，Calandra等[11]報道TNF-α會反過來促進巨噬細胞分泌MIF，TNF-α和MIF協同作用于前炎癥反應環路，導致SAP病情的加重。NF-κB是一類能與多種細胞基因的啟動子或增強子κB位點發生特異性結合并啟動基因轉錄的蛋白質，在調控多種炎性細胞因子的表達上起著關鍵作用。APIP合并肺損傷時，肺組織NF-κB的激活可引起多種促炎蛋白表達，包括細胞因子(IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、TNF-α等)和黏附分子(ICAM-1、P-selectin)等，從而導致肺損傷。Daun等[12]研究發現，MIF可以通過抑制糖皮質激素對IκB-α表達的上調，對抗激素在NF-kB/IκB-α信號轉換通路中的效應，進而阻斷其對炎癥因子表達的限制作用，說明MIF可對NF-κB的激活進行調控。

筆者在實驗中應用選擇性MIF互變異構酶活性抑制劑ISO-1，觀察其對APIP肺損傷的作用。實驗結果表明，ISO-1組孕鼠血清淀粉酶水平下降，胰腺、肺組織病理改變減輕，肺組織中MIF、NF-κB及TNF-α的表達水平下降。說明ISO-1對APIP孕鼠肺損傷具有一定的保護作用，其部分機制可能與抑制NF-κB及TNF-α的激活有關。

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Effects of MIF inhibitor ISO-1 on lung injury in rat models of acute pancreatitis in pregnancy.

LI Chen,WANG Wei-xing,ZUO Teng,SHI Qiao,WANG Peng,ZHAO Liang,MEI Fang-chao.Department of Hepatobiliary Surgery, People's Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060,Hubei,CHINA

ObjectiveTo explore the effects of ISO-1(macrophage migration inhibitory factor,MIF)on lung injury in pregnant rats with severe acute pancreatitis(SAP).MethodsThirty pregnant SD rats were randomly divided into the sham operation(SO)group,SAP group,and ISO-1 group,with 10 rats in each group.SAP model was established by retrograde injection of 5%sodium taurocholate into the biliopancreatic duct.The level of serum amylase and histopathological scores of pancreatic and lung tissues were determined.MIF,NF-κB and TNF-α activity in the lung was examined by immunohistochemical methods.ResultsSerum level of amylase(AMY),histopathological scores of pancreatic and lung tissues and activities of MIF,NF-κB,TNF-α in SAP group increased significantly as compared with those in SO group(P＜0.05),and the microscopic lung injuries were gradually aggravated with disease progression(P＜0.05).In ISO-1 group,all the above mentioned indexes were reduced significantly in comparison with those in the SAP group(P＜0.05).Intrapulmonary levels of MIF was positively associated with the expression of NF-κB and TNF-α(r= 0.815,r=0.787,P＜0.05).ConclusionMIF inhibitor ISO-1 protects lung from injury in pregnant rats with SAP.It was suggested that MIF was one of the mechanisms in acute pancreatitis in pregnancy with lung injury and may correlate with the activations of NF-κB and TNF-α.

Acute pancreatitis in pregnancy;Lung injury;Macrophage migration inhibitory factor(MIF);Nuclear factor-κB(NF-κB);Tumor necrosis factor-α(TNF-α)

R-332

A

1003—6350（2016）02—0180—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.02.003

2015-10-18)

國家自然科學基金（編號：81370562）；湖北省衛生廳科研基金重點資助項目（編號：JX6A07）；天晴肝病扶持基金（編號：TQCB20140182）

王衛星。E-mail:sate.llite@163.com