程序性細胞死亡4 mRNA在結直腸癌組織中的表達及意義*

李日恒，李爽，宋艷敏，張愛民，劉渤，胡光（.河北大學附屬醫院普外科，河北保定07000；.內蒙古興安盟人民醫院輸血科，內蒙古烏蘭浩特37400）

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程序性細胞死亡4 mRNA在結直腸癌組織中的表達及意義*

李日恒1，李爽2，宋艷敏1，張愛民1，劉渤1，胡光1
（1.河北大學附屬醫院普外科，河北保定071000；2.內蒙古興安盟人民醫院輸血科，內蒙古烏蘭浩特137400）

摘要：目的研究腹腔鏡結直腸癌根治術癌組織中程序性細胞死亡4（PDCD4）mRNA的表達，以及與結直腸癌臨床資料的相關性。方法收集2012～2014年腹腔鏡手術結直腸癌及癌旁正常組織標本54例，采用逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測結直腸標本中PDCD4 mRNA水平；分析PDCD4 mRNA水平與臨床資料的相關性。結果①結直腸癌組織中PDCD4表達降低甚至不表達，表達降低率為64.8%（35/54），△Ct值為（4.50±0.60）；正常組織中PDCD4高表達，△Ct值為（3.54±0.52），差異有統計學意義（P＜0.05）。②結直腸癌組織中PDCD4 mRNA水平與分化程度、有無淋巴結轉移、腫瘤浸潤深度有關，與性別、年齡、腫瘤部位無關；分化程度越低，有淋巴結轉移，浸潤越深，則PDCD4 mRNA表達更低。結論結直腸癌中PDCD4 mRNA表達下降，PDCD4 mRNA水平與性別、年齡、腫瘤部位無關，與分化程度、有無淋巴結轉移、腫瘤浸潤深度有關。

關鍵詞：腹腔鏡；結直腸癌；程序性細胞死亡4

Expression of PDCD4 mRNA in human colorectal cancer and its significance*

Ri-heng Li1, Shuang Li2, Yan-min Song1, Ai-min Zhang1, Bo Liu1, Guang Hu1
(1. Department of General Surgery, the Affiliated Hospital of Hebei University, Baoding, Hebei 071000, China; 2. Department of Blood Transfusion, Xingˊanmeng Peopleˊs Hospital, Ulanhot, Inner Mongolia 137400, China)

Abastract: Objective To study programmed cell death 4 (PDCD4) mRNA expression in colorectal cancer tissues from laparoscopic radical resection, as well as its relationship with the clinical data of colorectal cancer. Methods Specimens of colorectal cancer tissues and normal tissues adjacent to carcinoma from 54 cases were collected in laparoscopic surgery between 2012 and 2014. PDCD4 mRNA level was detected by RT-PCR in colorectal cancer specimens. The relationship between PDCD4 mRNA level and clinical data was analyzed. Results PDCD4 expression in the colorectal cancer tissues reduced or even was not seen, the rate of lowered PDCD4 expression was 64.8%(35/54) with△Ct (4.50±0.60); the normal tissues had high expression of PDCD4 with△Ct (3.54±0.52), the difference was statistically significant (P＜0.05). The PDCD4 mRNA level in the colorectal cancer tissues was correlated with the differentiation degree, lymph node metastasis and tumor infiltration depth, but not correlated with gender, age or tumor location. PDCD4 mRNA expression was lower in patients with lymph node metastases than those without ymph node metastasis. The lower the degree of differentiation and the deeper infiltration, the lower the PDCD4 mRNA expression. Conclusions PDCD4 mRNA expression lowers in colorectal cancers. PDCD4 mRNA level is not correlated with gender, age or tumor location, but correlated with degree of differentiation, lymph node metastasis and tumor infiltration depth.

Keywords:laparoscope; colorectal cancer; programmed cell death 4

結直腸癌的發生是多因素、多步驟共同作用的結果，癌基因與抑癌基因表達失衡發揮重要作用。隨著分子水平的發展，結直腸癌發病機制的研究有很大進展，為結直腸癌的診斷和治療提供更為確切的理論依據[1]。腹腔鏡結直腸癌根治術已經作為一種常規手術方式應用于臨床[2-3]。

程序性細胞死亡4（programmed cell death 4，PDCD4），是與細胞凋亡相關的抑癌基因，PDCD4參與細胞的轉錄、翻譯及多種信號通路，來發揮抑制腫瘤生長的作用[4-6]。已經證實PDCD4在結直腸癌、肝癌、肺癌、腦膠質瘤等多種腫瘤組織中表達降低，PDCD4表達水平與多種腫瘤患者的預后有關，高表達的PDCD4還能增加化療藥物的敏感性，本文目的是探討結直腸癌組織中PDCD4轉錄水平的表達，以及與結直腸癌臨床資料的相關性。

1　資料與方法

1.1病例資料

選取2012～2014年在河北大學附屬醫院普通外科行腹腔鏡結直腸癌根治術的患者54例，取其結直腸癌及癌旁正常組織標本。納入標準：患者術前未接受放射、化學及免疫治療，未發生遠處轉移。收集癌組織時，除已發生壞死的腫瘤組織外，取距癌組織邊緣＞10 cm的癌旁正常組織，取全層，診斷結果由術后病理檢查確定。其中男性32例，女性22例；年齡36～82歲，平均59.69歲；直腸癌19例，結腸癌35例。

1.2保存方法

腹腔鏡結直腸癌根治術中即刻取標本置于液氮中，-80℃冰箱內保存時間≤6個月，手術操作過程嚴格按照直腸系膜全切除（total mesoreetal exeision，TME）原則進行操作。

1.3試劑與儀器

1.3.1主要試劑Omega E.Z.N.A.TM總RNA提取試劑盒、Vazyme Hiscript第一鏈cDNA合成試劑盒、Vazyme Hiscript qRT PCR熒光定量試劑盒、去RNA酶的EP管、槍頭、8聯排、β-actin和PDCD4引物由石家莊市惠友生物科技有限公司提供，β-actin引物、PDCD4普通引物根據Primer Premier 5.0軟件設計，并通過Pubmed Blast檢測其特異性，由上海生工生物工程股份有限公司合成。實驗中RNA提取及核酸電泳過程中所需的氯仿、無水乙醇、75%無水乙醇、5×loading buffer、gelred染液、瓊脂糖、1×TAE液、DNA Marker等由河北大學附屬醫院中心實驗室提供。

1.3.2主要儀器高速冷凍離心機（Thermo Sorvall ST16R型，德國Thermo Electron LED GmbH Am Kalkberg公司），微量高速冷凍離心機（FRESC021型，德國Thermo Fisher Scientific公司），全波長酶標儀（EPOCH型，美國基因有限公司），全自動凝膠成像儀（Champ Gel 5000型，北京賽智創業科技有限公司），普通聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）儀器（Veriti型，美國Applied Biosystems公司），實時熒光定量PCR儀（7300型，美國Applied Biosystems公司），渦旋振蕩器（Vortex-5型，美國其林貝爾儀器制造有限公司），全自動雪花制冰機（IMS-200型，北京德天佑科技發展有限公司）。

1.4方法

1.4.1組織總RNA的提取取約30 mg組織，根據Omega E.Z.N.A.TM總RNA試劑盒說明書提取總RNA，取產物2μl于1%瓊脂糖凝膠中電泳，紫外線下觀察并記錄結果。以顯示3條條帶且條帶清晰為RNA無明顯降解。同時在酶標儀檢測含量（2 000 ng/μl）及比值（A260/A280光度值：1.9～2.0）合適后進行逆轉錄，中途不能及時完成時將產物放置入-20℃或-80℃冰箱冷凍保存，保存時間≤3個月。

1.4.2逆轉錄根據酶標儀結果調整RNA含量，根據Vazyme Hiscript第一鏈cDNA合成試劑盒說明書進行逆轉錄，體系為Oligo dT 1μl，總RNA 1μg，RNase free ddH2O 6μl混合反應物，65℃預熱10min，冰上驟冷2min。隨后加入2×RT Mix 10μl，Hiscript Enzyme Mix 2μl，在25℃預變性5 min、42℃變性30 min、85℃退火5 min的反應條件下進行處理，反應結束后產物模板cDNA進行分裝稀釋，放置于-20℃冰箱內，保存時間≤6個月，待行PCR反應。

1.4.3逆轉錄-聚合酶鏈反應通過Primer Premier 5.0進行引物設計，NCBI Blast進行引物特異性檢測。PDCD4正向引物：5′-TGGGAGTGACGCCCTTAG A-3′，反向引物：5′-TCCACCTCCTCCACATCATACA-3′，產物長度171 bp；內參基因β-actin正向引物：5′-GTGGACATCCGCAAAGAC-3′，反向引物：5′-AA AGGGTGTAACGCAACTAA-3′，產物長度302 bp。逆轉錄-聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）反應體系20μl：模板cDNA 2μl，Mix 10μl，Rox 2μl，正、反向引物2μl，滅菌蒸餾水4μl。反應條件：95℃預變性5 min；95℃變性10 s，60℃退火32 s，共40個循環；95℃預變性15 s，60℃變性60 s，95℃退火15 s。擴增后的產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外分析儀上分析并記錄圖像結果。

1.5統計學方法

采用SPSS 16.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，用t檢驗，計數資料以率表示，并行χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1結直腸癌組織中PDCD4 mRNA的表達

PCR擴增及瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，actin 302 bp，PDCD4 171 bp，癌組織中PDCD4表達降低甚至不表達，表達降低率為64.8%（35/54），△Ct值為（4.50±0.60），正常組織中高表達△Ct值為（3.54± 0.52），差異有統計學意義（P=0.036）。△Ct值越高，表明相對擴增數多，相對表達量越低。見圖1～3。

2.2PDCD4 mRNA水平與結直腸癌臨床特征的相關性

結直腸癌組織中PDCD4 mRNA水平與性別、年齡、腫瘤部位無關，與分化程度、有無淋巴結轉移、腫瘤浸潤深度有關。分化程度越低、淋巴結轉移、浸潤越深，則PDCD4 mRNA表達越低。見附表。

圖1　PDCD4 mRNA擴增曲線

圖2　PDCD4 mRNA凝膠電泳結果

圖3　PDCD4 mRNA的表達

附表　臨床特征與結直腸癌組織中PDCD4 mRNA水平的相關性

3　討論

結直腸癌的發病率和死亡率日趨上升，嚴重危害人類的生命健康。手術切除仍是治療結直腸癌的主要手段。在完全堅持TME原則的前提下，與傳統開腹手術比較，腹腔鏡結直腸癌根治術具有切口小、患者痛苦少、恢復快等優點。

人類PDCD4首先從膠質瘤細胞中分離出來，其蛋白主要由N端、C端及兩個保守的α-helical MA-3區域組成，2個MA-3對于綁定eIF4A和RNA移位是必不可缺的。MA-3區域與eIF4GI、eIF4GII有關的ATP依賴的RNA解螺旋酶eIF4A蛋白的相互作用有關。PDCD4的氨基酸序列中也包含多個磷酸化位點，PDCD4調節轉錄的過程可能更為復雜[7]。

PDCD4在不同組織中的作用機制不同。易波等[8]研究顯示，PDCD4可能通過上調死亡相關蛋白5表達來誘導大腸癌細胞的凋亡。PDCD4還能在一定程度上抑制細胞浸潤轉移，PDCD4-siRNA敲除的結直腸癌HT-29細胞能明顯促進結直腸癌細胞的分化，且能明顯提高c-Jun磷酸化以及eIF4E、Fas相關性死亡結構域蛋白樣白細胞介素轉變酶抑制蛋白的表達；AKt/Pr激酶B可促使PDCD4的Ser67、Ser457位點發生磷酸化，引起PDCD4發生核轉錄，使活化劑蛋白1（activator protein 1，AP1）調控的轉錄功能下降，同時影響腫瘤轉移[9]。Yang[10]和Wang等[11]證實PDCD4蛋白能抑制人類結腸RKO細胞中c-Jun的激活，引起抑制轉錄蛋白AP1的失活，抑制細胞的惡性轉化及血管形成。在結直腸癌細胞HT-29中，PDCD4缺失，刺激AP1依賴的轉錄，誘導c-Jun蛋白表達水平的升高。PDCD4能抑制JNK的活性，從而抑制c-Jun的磷酸化，阻止eIF4E的磷酸化，使金屬蛋白酶MMP-9和MMP-2表達降低，抑制細胞轉移；逆轉其磷酸化反應后，金屬蛋白酶MMP-9和MMP-2表達增加，促進細胞轉移[12]。

Zhen等[13]在研究鼻咽癌細胞時證實PDCD4在8種鼻咽癌細胞株中表達降低，其表達下降與進展和不良預后成正相關，同時與腫瘤大小、淋巴結轉移、臨床分期密切相關；隨著分期的增高，PDCD4表達下降的趨勢越明顯。不論TNM分期如何，PDCD4的高水平表達能顯著改善患者預后。例如在早期肺癌組織中，與正常組織相比，PDCD4 mRNA和PDCD4蛋白的表達水平明顯降低，PDCD4的表達水平與年齡、性別及有無遠處轉移無明顯相關，但與腫瘤大小、淋巴結轉移、臨床分期及預后相關，差異有統計學意義。PDCD4達水平降低的程度越大，腫瘤惡性程度越高，但在非小細胞癌中，PDCD4表達水平與臨床參數無相關。而給K-ras缺失的裸鼠吸入氣溶膠PDCD4能顯著抑制細胞增殖和腫瘤進展過程，并促進凋亡[14]。本研究收集腹腔鏡結直腸癌根治術組織標本，對標本進行檢測，分析PDCD4 mRNA水平與結直腸癌的相關性。結果顯示，結直腸癌組織中PDCD4 mRNA水平降低，說明轉錄水平調節受影響，結直腸癌組織中PDCD4 mRNA水平與性別、年齡、腫瘤部位無關，與分化程度、有無淋巴結轉移、腫瘤浸潤深度有關。分化程度越低、淋巴結轉移、浸潤越深，則PDCD4 mRNA表達越低。這與鼻咽癌和早期肺癌的研究結果相似，卻與非小細胞癌的研究結果不一致?？紤]為PDCD4在不同的組織中表達量不同，發揮的機制不同，導致這種組織上的差異。薛迪新等[15]證實結直腸癌中PDCD4蛋白的表達與腫瘤浸潤深度、無淋巴結轉移和臨床分期有關，而與年齡、部位、腫瘤大小及有無遠處轉移無關，PDCD4蛋白表達水平下調提示結直腸癌預后不良，大腸癌組織中PDCD4蛋白表達缺失可促進結直腸癌細胞增殖。與轉錄前比較，轉錄后恢復PDCD4蛋白的表達水平能更好地治療大腸癌。

有學者提出恢復轉錄后PDCD4蛋白水平比恢復轉錄前水平對治療結直腸癌更為重要。蛋白發揮功能必須通過基因轉錄、翻譯的過程，如果轉錄抑制，翻譯就無法進行，因此了解PDCD4在結腸癌組織中的轉錄水平才能為重新表達提供依據。PDCD4轉錄水平的異常調控影響結直腸癌的發生、發展，這為結直腸癌的診斷和治療提供依據。

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（申海菊編輯）

*基金項目：河北省科技計劃項目（No：132777248）

收稿日期：2015-05-04

文章編號：1005-8982（2016）03-0018-05

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.03.004

中圖分類號：R735.3

文獻標識碼：A