C型CD133和缺氧誘導因子-1α在胃癌組織中的表達及其預后價值

何志國，李盆洲，朱曬紅（中南大學湘雅三醫院普外科，湖南長沙410003）

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C型CD133和缺氧誘導因子-1α在胃癌組織中的表達及其預后價值

何志國，李盆洲，朱曬紅
（中南大學湘雅三醫院普外科，湖南長沙410003）

摘要：目的闡明CD133表達在胃癌中的臨床意義，并初步探討CD133與缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）表達的相關性。方法該研究納入長沙市第四醫院醫院189例胃癌患者，免疫組織化學法檢測CD133和HIF-1α的表達。根據免疫組織化學法結果將患者分為CD133陰性表達組、L型CD133陽性表達組和C型CD133陽性表達組，并比較3組患者的臨床病理特征、預后及HIF-1α表達。結果C型CD133陽性表達組與胃癌轉移、進展相關，L型CD133陽性表達組與胃癌轉移、進展無關。C型CD133陽性表達患者生存率顯著低于CD133陰性表達組患者，輔助化療組和根治性切除組的生存率也有同樣的結果。多元回歸分析顯示，細胞質表達的CD133是胃癌的獨立預后因素。L型CD133管腔表達患者HIF-1α陽性率較低，而C型CD133表達患者HIF-1α陽性率較高。結論C型CD133表達胃癌細胞是高潛能惡性腫瘤，該表現型與癌癥進程、化療耐藥性、復發性及差預后相關，與HIF-1α表達呈正相關，C型CD133細胞質可能是胃癌潛在的預后標志物。

關鍵詞：胃癌；CD133；預后；缺氧誘導因子-1α

CD133是分子量為120 kD的具有5個跨膜結構域的糖蛋白，是目前研究較多的腫瘤干細胞標志物。目前關于CD133的理論學說眾多，但其生物功能仍不明確。最初CD133作為造血干細胞和祖細胞的表面標志物出現。但近年來有報道表明，其也可作為實體瘤如腦癌、肺癌、肝癌、結腸癌、胰腺癌和前列腺癌的腫瘤干細胞標志物[1-2]。此外有大量報道表明，在肺癌、乳腺癌、肝細胞癌、結腸癌和胰腺癌中，CD133表達不僅與腫瘤進展有關，而且與耐藥性相關[3]。

缺氧環境對維持腫瘤干細胞性狀非常重要[4]。缺氧誘導因子-1α（hypoxia-inducing factor-1α，HIF-1α）是雷帕霉素信號通路中哺乳動物靶標的下游分子。HIF-1α通常由低氧血癥誘導表達，并作為轉錄因子發揮作用。HIF-1a作為可以調控CD133表達的因子受到廣泛關注，同時學者們對各種實體瘤中CD133和HIF-1α表達的相關性也進行研究。大多數研究表明，CD133和HIF-1α的表達存在相關性[5]，但也有報道表明存在乳腺癌細胞系中HIF-1α可下調CD133表達[6]。

本研究采用免疫組織化學法檢測臨床胃癌組織中CD133的表達，并分析CD133表達與預后的相關性，并探討CD133與HIF-1α表達的相關性。

1　資料與方法

1.1研究對象

選取2007年1月-2008年12月在長沙第四醫院普外科接受外科手術治療的189例原發性胃腺癌患者。其中男性133例，女性56例；年齡34～86歲，中位年齡70歲。104例伴上胃腸道出血（upper gastrointestinal bleeding，UGIB），85例不伴UGIB。患者術前經胃鏡活檢病理、CT或MRI檢查確診，臨床和病理資料完整。接受全胃切除術72例，遠端胃切除術99例，近側胃切除術11例，胃分段切除術7例，其中82例患者接受術后輔助化療。同時選擇胃癌組織癌旁正常胃黏膜組織作為對照組。

1.2免疫組織化學法檢測CD133和HIF-1α

胃癌手術切除標本10%福爾馬林固定，石蠟包埋劑4μm連續切片。切片常規脫蠟、脫水后10mmol檸檬酸鈉（pH=6.0）中煮沸10 min，冷卻至室溫。10%馬血清封閉后滴加CD133一抗（1∶100稀釋）或HIF-1α一抗（1∶500稀釋），4℃孵育過夜。磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）沖洗切片，滴加二抗，室溫孵育30 min。3%雙氧水H2O2處理30 min滅活內源性過氧化物酶。將抗生物素蛋白-生物素-過氧化物酶復合物滴加至切片，二氨基聯苯胺（Diaminobenzidine，DAB）顯色。以出現棕黃色或棕色顆粒的細胞作為陽性細胞，CD133陽性部位在細胞漿或腺體，HIF-1α的陽性部位在胞膜，部分細胞漿也呈陽性。按陽性強弱的標準判斷光鏡下觀察陽性染色的細胞比例（5個高倍視野下的均數）：①染色細胞數＜10%為陰性；②染色細胞數10%～50%為陽性；③染色細胞數＞50%為強陽性。顯微攝像并用圖像分析儀進行光密度值檢測。

1.3雙標免疫組織化學法檢測CD133在胃癌細胞中的定位

通過CD133和細胞角蛋白8（Cytokeratin 8，CK8）免疫組織化學法雙標檢測、分析CD133在胃癌細胞中的表達定位。將CD133一抗（1∶100稀釋）和CK8一抗（1∶100稀釋）1∶1混勻，滴加至切片，4℃孵育過夜。PBS沖洗后，分別將堿性磷酸酶標記的抗鼠IgG和過氧化物酶標記的抗兔IgG二抗滴加至切片，室溫孵育，隨后分別用伏爾甘德克薩斯紅媒染和DAB試劑顯色。此外，采用同樣的方法檢測CD133和HIF-1α在胃癌細胞中的表達定位。

1.4統計學方法

采用SPSS 18.0統計軟件進行數據分析，用方差（One way，ANOVA）檢驗分析CD133蛋白表達水平與性別、年齡、癌細胞分化程度及臨床分期等各臨床病理參數的相關性；對胃癌CD133表達進行分層比較，了解CD133表達類型與胃癌預后的相關性。用單因素和多因素分析研究各因素對預后的影響，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1免疫組織化學法

CD133有L型和C型兩種表達類型，這兩種表達類型都在胃癌細胞中有表達（見圖1），分化型胃癌中CD133主要表達于胃腺體管腔（稱為L型CD133陽性表達），而在未分化型胃癌中CD133主要表達于胞漿（稱為C型CD133陽性表達）。同一個區域可能同時有L-型和C型CD133的表達。

本研究將在樣本中表達占優勢的類型定義為主要類型。高倍視野下，隨機選擇1 000個癌細胞評價CD133的表達，結果表明1 000癌細胞內CD133表達頻率為0.0%～18.3%。隨機選取6例胃癌組織樣本進行染色，結果發現CD133的表達率和表達類型比較，差異無統計學意義。本研究189例胃癌患者中128例（67.7%）有CD133表達，將陽性染色癌細胞＞5%定義為CD133表達陽性。189例患者中56例CD133陽性表達（29.6%），其中L型表達33例（17.4%），C型表達23例（12.1%）。

HIF-1α主要表達于癌細胞的細胞核（見圖2）。將陽性染色癌細胞＞5%定義為HIF-1α陽性。189例患者中107例（56.6%）HIF-1α陽性表達。

抗CD133抗體和抗角蛋白8抗體免疫組織化學法雙染色顯示，CD133在胞漿中主要表達于胞漿內管腔（intracytoplasmic lumen，ICL）（見圖3）。

免疫組織化學法檢測證實胃癌標本中有CD133 和HIF-1α表達。此外，HIF-1α表達陽性的細胞核中C型CD133表達占優勢（見圖4）。

2.2CD133表達的臨床病理意義

本研究首先探討胃癌中CD133表達的臨床病理學意義，CD133表達與臨床變量的相關性見表1。將患者根據CD133表達分為3組：CD133陰性表達組、L型CD133陽性表達組和C型CD133陽性表達組。C型CD133陽性表達組患者淋巴結轉移、腹膜轉移、血管侵潤和晚期腫瘤率顯著高于其他兩組。與L型CD133陽性表達組無相關性。本研究結果提示，細胞胞漿CD133表達與癌癥的進展程度相關。

2.3CD133表達的預后意義

圖1　兩種類型的CD133在胃癌組織中的表達（×200）

圖2　HIF-1α在胃癌組織中表達（×400）

圖3　免疫組織化學法雙染（×400）

圖4　CD133和HIF-1α在胃癌組織中的表達（×400）

圖5　CD133陰性表達組與CD133陽性表達組的5年期總生存率比較

本研究分析CD133表達與胃癌患者預后的相關性。CD133陰性表達組5年期總生存率為66.6%，CD133陽性表達組5年期總生存率為46.3%，兩組比較差異有統計學意義（P=0.004）（見圖5）。將CD133陽性表達組分為C型CD133陽性表達組和L型CD133陽性表達組，兩組5年期總生存率分別為62.5%和22.7%，CD133陰性表達組和L型CD133陽性表達組5年期總生存率比較，差異無統計學意義（P=0.603）；CD133陰性組和C型CD133陽性表達組5年期總生存率比較，差異有統計學意義（P=0.001）（見圖6）。Ⅰ、Ⅱ期胃癌患者中，C型CD133陽性表達組5年期總生存率為60.0%，CD133陰性表達組與C型CD133陽性表達組5年期總生存率比較，差異無統計學意義（P=0.191）（見圖7）。Ⅲ、Ⅳ期胃癌患者中，C型CD133陽性表達組5年期總生存率為11.7%，CD133陰性表達組和C型CD133陽性表達組5年期總生存率比較，差異有統計學意義（P= 0.017）（見圖8）。對C型CD133陽性表達、L型CD133陽性表達、T分類、NT分類、PT分類及HIF-1α表達進行多因素Cox分析，發現C型CD133陽性表達是胃癌的獨立預后因素（見表2）。

表1　胃癌中CD133表達的臨床病理學意義　例（%）

表2　多元回歸分析CD133表達與患者總生存期的相關性

2.4CD133表達與化學藥物治療抵抗及復發的相關性

本研究進一步分析CD133表達與化學藥物治療（以下簡稱化療）抵抗及復發的相關性。分析CD133表達與接受輔助化療及根治性切除患者疾病特異性生存率。CD133陰性表達組與L型CD133陽性表達組比較差異無統計學意義（P =0.341）；CD133陰性表達組與C型CD133陽性表達組比較差異有統計學意義（P=0.001）（見圖9）。CD133陰性表達組與L型CD133陽性表達組比較差異無統計學意義（P=0.563）；CD133陰性表達組與C型CD133陽性表達組比較差異有統計學意義（P =0.013）（見圖10）。因此C型CD133陽性表達組患者生存率明顯低于其他組。

圖6　C型CD133陽性表達組、L型CD133陽性表達組及CD133陰性表達組的5年期總生存率比較

圖7?、?、Ⅱ期患者CD133陰性表達組與C型CD133陽性表達組的5年期總生存率比較

圖8?、?、Ⅳ期患者中CD133陰性表達組與C型CD133陽性表達組的5年期總生存率比較

圖9　82例接受輔助化療及胃癌根治性切除術患者的疾病特異性生存率

圖10　144例接受腫瘤根治切除術且切緣陰性患者的疾病特異性生存率

2.5CD133與HIF-1α表達的相關性

本研究最后分析CD133與HIF-1α表達的相關性。CD133陽性表達組與CD133陰性表達組的HIF-1α表達比較差異無統計學意義。但是根據表達類型比較時，發現L型的HIF-1α陽性率偏低，而C型偏高。3組HIF-1α表達率比較，差異有統計學意義（見圖11）。有報道，HIF-1α表達是胃癌的預后不良因素。本研究也發現HIF-1α陽性組的總體生存率顯著低于陰性組。根據CD133表達將HIF-1α陽性組進行分類，發現CD133和HIF-1α陽性患者的預后差，在不考慮CD133表達時，也得到同樣的結果（見表3）。

圖11　CD133與HIF-1α表達的相關性

表3　CD133與HIF-1α表達的相關性

3　討論

本研究結果表明，胃癌組織中CD133蛋白的陽性表達率為30%，且CD133在胃癌中主要以腺管腔細胞膜表面表達，包括管腔表達（L型）和胞漿表達（C型）。L型表達在分化胃癌中常見，C型在未分化胃腺癌中常見，而在部分組織中，兩種類型均可見。L型CD133最早在大腸癌中發現，而C型CD133最早在胰腺癌中發現[7]。

Ishigami[8]和Zhao等[9]也檢測胃癌組織臨床樣本中CD133的表達，但是并未區分CD133的表達類型。其研究表明，胃癌中CD133表達是癌癥進展、預后、浸潤深度和淋巴結轉移的危險因子。Sasaki等[10]也證實原發性肝癌中CD133的表達類型主要是C型，未發現L型CD133表達，且C型CD133表達與肝癌惡性程度和預后相關。同樣，接受術前放、化療的直腸癌患者C型CD133表達與局部復發和預后有一定相關性。該報道表明，C型CD133表達可能參與腫瘤惡化進程。本研究結果表明，C型CD133表達是胃癌進展、淋巴結轉移、腹膜侵潤及血管浸潤等的重要危險因素。多元回歸分析表明，C型CD133表達是胃癌患者的獨立預后因素。但是本研究未發現L型CD133表達與胃癌惡性程度的相關性。

本研究進一步探討CD133與治療抵抗、腫瘤復發的相關性。輔助化療組和根治性切除術組存活率是研究腫瘤耐藥性和復發的主要指標。在該患者中，C型CD133陽性表達組存活率顯著下降。該發現表明C型CD133陽性表達組更可能與腫瘤復發相關。總之，C型CD133陽性表達與腫瘤進展（主要是轉移）及預后相關，并與未分化腫瘤的治療抵抗性相關，更易復發。

最后，對CD133和HIF-1α表達相關性的研究表明，L型CD133陽性表達組的HIF-1α表達率低，與Matumoto等[11]的報道結果相符。然而，C型CD133陽性表達組的HIF-1α表達率較高，這與其他器官的報道結果相似。本研究表明，C型CD133陽性表達的高度惡性腫瘤中，HIF-1α可能上調其表達。事實上，本研究也發現HIF-1α表達的胃癌組存活率低。而在HIF-1α表達組，CD133陽性患者的生存率更低。這可能是HIF-1α上調細胞質CD133表達引起的。然而本研究已經根據CD133表達型分出HIF-1α陽性、CD133陽性差預后組，不同表型間的存活率比較差異有統計學意義。這可能是由于L型CD133陽性表達組內，HIF-α表達型仍表現出c型CD133表達。

本研究證實CD133與HIF-1α相關，HIF-1α的表達隨缺氧而升高，CD133于細胞質中進行表達或聚集，腫瘤干細胞樣功能導致腫瘤惡化。另外釋放缺氧狀態，即通過降低HIF-1α促進細胞質中CD133的釋放，可能促進腺管的形成。因此抑制HIF-1α的表達能夠改善胃癌預后。本研究表明, CD133表達與胃癌淋巴結轉移、腹膜轉移、化療耐藥性、復發及預后差相關。胃癌組織中C型CD133表達作為新的預后因子，將對未來胃癌的研究產生積極作用。此外，本研究還發現HIF-1α表達與CD133表達相關，HIF-1α也是胃癌潛在的預后因素。

參考文獻：

[1]訾曉淵.一種新型腫瘤干細胞標記物CD133[J].癌變.畸變.突變, 2009, 21(2): 159-160.

[2] Grosse-Gehling P, Fargeas CA, Dittfeld C, et al. CD133 as a biomarker for putative cancer stem cells in solid tumours: limitations, problems and challenges[J]. The Journal of Pathology, 2013, 229(3): 355-378.

[3] He J, Shan Z, Li L, et al. Expression of glioma stem cell marker CD133 and O-6-methylguanine-DNA methyltransferase is associated with resistance to radiotherapy in gliomas[J]. Oncology Reports, 2011, 26(5): 1305-1313.

[4]李丕嵩,李建一,張文海.血管生成擬態在惡性腫瘤的研究進展[J].國際腫瘤學雜志, 2014, 41(11): 824-827.

[5] Iida H, Suzuki M, Goitsuka R, et al. Hypoxia induces CD133 expression in human lung cancer cells by up-regulation of OCT3/4 and SOX2[J]. International Journal of Oncology, 2012, 40(1): 71-79.

[6] Qu H, Han M, Fan Y, et al. Effect of blocking the PI3K/Aktsignalling pathway on cell proliferation of the aggregated breast cancer stem cells in microspheres under hypoxia microenvironment[J]. Tumor, 2013, 33(1): 36-41.

[7] Collins AT, Berry PA, Hyde C, et al. Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells[J]. Cancer Res, 2005, 65: 10946-10951.

[8] Ishigami S, Ueno S, Arigami T, et al. Prognostic impact of CD133 expression in gastric carcinoma[J]. Anticancer Res, 2010, 30: 2453-2457.

[9] Zhao P, Li YZ, Lu YL. Aberrant expression of CD133 protein correlates with Ki-67 expression and is a prognostic marker in gastric adenocarcinoma[J]. BMC Cancer, 2010, 10: 218.

[10] Sasaki A, Kamiyama T, Yokoo H, et al. Cytoplasmic expression of CD133 is an important risk factor for overall survival in hepatocellular carcinoma[J]. Oncol Rep, 2010, 24: 537-546.

[11] Matumoto K, Arao T, Tanaka K, et al. mTOR signal and hypoxia-inducible factor-1 alpha regulate CD133 expression in cancer cells[J]. Cancer Res, 2009, 69: 7160-7164.

（童穎丹編輯）

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《中國現代醫學雜志》編輯部

Expression of CD133 and hypoxia inducible factor-1α in gastric cancer and clinical significance

Zhi-guo He, Pen-zhou Li, Shai-hong Zhu
(Department of General Surgery, the Third Xiangya Hospital, Central South University, Changsha, Hunan 410003, China)

Abstract:Objective To clarify the clinical role of CD133 expression in gastric cancer and to investigate the correlation between CD133 expression and hypoxia inducible factor (HIF)-1α expression. Methods Totally 189 gastric cancer patients who underwent gastrectomy in the Fourth Hospital of Changsha City were studied. CD133 and HIF-1α expressions were examined using immunohistochemical staining. Fifty -six cases were CD133-positive, and they were divided into two expression types: luminal expression of the gland and cytoplasmic expression. The clinicopathological variables, prognosis and HIF-1a expression were compared among the three groups of different CD133-expression types. Results The expression of CD133 in the cytoplasm was correlated to metastasis and tumor progression. However, this relationship was not observed with luminal expression type of the gland. The survival rate in the patients with cytoplasmic CD133 expression was significantly lower than that in the CD133-negative group. The same relationship was observed in the survival rate of the adjuvant chemotherapy group and the curative resection group. Multivariate analysis revealed that the expression of CD133 in the cytoplasm was an independent prognostic factor for gastric cancer. HIF-1α positive rate was higher in the patients with cytoplasmic CD133 expression than in those with luminal CD133 expression. Conclusions Gastric cancer cells with CD133 expression in the cytoplasm have high potential for malignancy, and this phenotype is associated with cancer progression, chemotherapy resistance, recurrence and poor prognosis. Cytoplasmic expression of CD133 may be a useful prognostic marker for gastric cancer. A sig－book=28,ebook=34nificant correlation is observed between HIF-1α expression and the immunohistochemical staining pattern of CD133.

Keywords:gastric cancer; CD133; prognosis; hypoxia inducible factor-1α

收稿日期：2015-04-21

文章編號：1005-8982（2016）03-0027-07

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.03.006

中圖分類號：R735.2

文獻標識碼：A