非編碼RNA作為原發性肝癌分子標志物的研究進展

楊森，袁聲賢，周偉平，薛煥洲

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·文獻綜述·

非編碼RNA作為原發性肝癌分子標志物的研究進展

楊森1，袁聲賢2，周偉平2，薛煥洲1

（1.鄭州大學人民醫院/河南省人民醫院 肝膽胰外科，河南 鄭州 450003；2.東方肝膽外科醫院 肝外三科，上海 200438）

原發性肝癌是嚴重威脅生命健康的惡性腫瘤，病死率居高不下。進一步提高其早期診斷率，可使其病死率大大降低；另外，根據腫瘤的生物學特性，進行個體化的治療，也將有助于改善目前的治療狀況。這些都依賴于原發性肝癌早期診斷、分型和預后判斷等技術的提高。目前傳統的診斷標志物診斷效果還不理想，現有的分子分型和預后判斷體系離臨床應用也尚遠。近十年來，包括microRNA和lncRNA在內的非編碼RNA研究的迅速進展，給原發性肝癌的診斷、分型和預后判斷提供了新思路，顯示了較高的應用價值。本文就非編碼RNA在原發性肝癌診斷、分型和預后判斷方面的應用作一綜述。

肝腫瘤；非編碼RNA；診斷；分型；預后

肝癌是我國發病率和死亡率均較高并帶來沉重經濟社會負擔的一種惡性腫瘤，其治療效果仍不理想。因發現較晚而不能得到根治性切除是目前療效差的重要原因。東方肝膽外科醫院一項大宗病例的回顧性分析顯示，該院5 524例肝癌患者中腫瘤直徑小于3 cm的僅占13％［1］。因此早診早治療是提高肝癌療效、降低病死率極為重要的措施。而目前用于肝癌診斷的傳統標志物還不理想，尤其是早期診斷效果差，因而亟待開發方便、廉價、高效的新的標記分子，以提高肝癌的早期診斷水平。另外，利用分子分型的方法將肝癌分為生物特性不同的亞型，通過肝癌的分子標記評判肝癌的預后，將有利于開發肝癌的分子靶向藥物，有利于指導肝癌的個體化治療，進而提高肝癌的療效。既往用于肝癌分子分型或評判預后的標志物多集中在蛋白質，尚未發現能夠用于指導肝癌特定治療的分子亞型。近些年來，非編碼RNA在生命醫學領域受到越來越多的關注，并取得重大進展，讓人們對生命現象有了新的認知，對疾病的診斷與治療有了新的思路。本文就其在肝癌診斷、分型及預后判斷方面的應用作一綜述。

1 非編碼RNA簡介

現代生物學一個很讓人不解的現象是，用于編碼蛋白的約20 000個基因在人類基因組所占的比例還不足2％［2］。高通量芯片和測序技術的發展使得了解整個人類的轉錄組成為可能，人們發現，人類轉錄組的復雜性遠遠超過了蛋白編碼基因轉錄產物的集合，廣闊的人類基因組“黑暗地帶”均可轉錄，產生了大量的非編碼RNA［3-4］。

非編碼RNA有很多不同的類型，根據其序列的大小分為小非編碼RNA和長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）。小的非編碼RNA包括的類型有microRNA、piRNA和snoRNA等。其中microRNA在目前非編碼RNA中研究的最清楚，它是一種內源性單鏈小分子RNA，長度約22個核苷酸，可進行基因轉錄后水平的調節［5］。大量的研究表明microRNA是一類十分重要的調控分子，它們的異常表達與包括腫瘤在內的眾多疾病密切相關。長鏈非編碼RNA目前還沒有統一的定義一般認為它們是一類長度大于200 nt且沒有明顯開放閱讀框的非編碼RNA。最早報道的lncRNA-H19，其發現要早于microRNA［6］，但microRNA lin-14的發現使人們將目光迅速轉向microRNA。直到FANTOM和ENCODE等大規模轉錄組測序的開展，人們發現哺乳動物基因組存在大范圍轉錄活動，又加上一些新發現的lncRNA功能機制的闡明，lncRNA迅速成為近5年來生命醫學領域的研究熱點。對于數量龐大的lncRNA，學術界對其功能性還存在爭議［7］。可以肯定的是，lncRNA在生物體內存在時空特異性表達，在包括腫瘤在內的多種疾病中其表達譜發生了明顯的改變，已經發現了許多在疾病發生發展中起重要作用的lncRNA［8-10］。不同于microRNA相對單一的作用方式，lncRNA的作用機制十分復雜，目前發現的lncRNA可以從表觀遺傳、轉錄、轉錄后等多個水平發揮調控作用［11］。

2 非編碼RNA在肝癌中的診斷作用

提高肝癌的早期診斷率，無疑將會大大降低目前肝癌病死率。做到這一點，一是需要加強對高危人群的篩查，二是要提高目前的肝癌診斷技術，尤其是早期診斷技術。目前肝癌的診斷主要依賴影像學和血清標志物。各種影像學診斷方法各有優劣，但早期診斷效果不好。甲胎蛋白（AFP）是目前國內外應用最廣的用于肝癌診斷的血清標志物，但其敏感性和特異性仍不理想，特別是早期肝癌只有10％～20％的患者表現出血清甲胎蛋白異常［12-13］。因此，2011年歐洲肝病協會在制定新的肝癌診斷指南時，甚至都沒采用甲胎蛋白這一指標［14］。近些年來陸續發現了一些新的分子標志物，如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（GPC-3）、異常凝血酶原（DCP）、高爾基蛋白-73（GP-73），這些標志物單獨或聯合使用，在一定程度上提高了肝癌的診斷效果。這些分子標志物均是蛋白質，而近些年非編碼RNA研究的迅速進展，為尋找新型肝癌診斷標志物提供了新線索。

大量的研究顯示，人體血液中穩定存在大量的microRNA，且在肝癌中其表達譜發生了明顯的改變［15-16］，提示microRNA有可能作為新型的分子標志物用于肝癌的診斷。國內外學者在這方面做了大量探索。Yamamoto等［17］最早報道了microRNA在肝癌患者血清中的改變。他們發現miR-500在肝癌患者術前的血清中升高，術后恢復正常，提示其是肝癌診斷中一個潛在的標志物。Qu等［16］回顧性的在105例肝癌患者、107例慢性肝病患者以及71例正常人的血清中檢測了miR-16、miR-195、miR-199a的表達，結果顯示單個標志物對肝癌的診斷敏感性大小依次為miR-16、miR-199a、AFP、DCP、AFP-L3％、miR-195，聯合使用miR-16、AFP、DCP、AFP-L3％產生最好的診斷效果，敏感性為92.4％，特異性為78.5％。miR-16可以顯著改善3個傳統標志物的診斷敏感性和特異性。Zhou等［18］利用含量為723的microRNA芯片在包含正常人、慢性乙肝患者、肝硬化患者和肝癌患者的137例患者的血清中篩查，然后在407例患者的隊列建立模型，接著在另一個包含390例患者的隊列驗證，最終確定了一個用于肝癌診斷的microRNA組（miR-122、miR-192、miR-21、miR-223、miR-26a、miR-27a、miR-801），它在建模隊列和驗證隊列的AUC值分別可以達到0.864和0.888，而且其診斷的準確性不受肝癌巴塞羅那分期的影響，對0期的AUC值可達0.888。另外該模型可以很好的將肝癌患者與正常人、慢性乙型肝炎患者和肝硬化患者區分開，該研究成果有潛在的臨床應用價值。以上研究說明microRNA是很有前景的肝癌診斷標志物。

和microRNA一樣，lncRNA表達譜在眾多腫瘤中也表現出顯著的改變，因而也有潛在診斷價值。例如，lncRNA PCA/ DD3被發現在前列腺癌特異性的高表達，并且在尿中可以檢測到，聯合傳統的PSA檢查以及其它的臨床信息可以提高前列腺癌的診斷準確性［19］。另外，Panzitt等［20］發現了一條在肝癌中特異性升高的lncRNA HULC，并且發現該lncRNA可以在人體血液中檢測到，是一個肝癌潛在的診斷標志物。Xie等［21］研究發現HULC可在63％的肝癌患者中檢測到，但并未提及其在肝癌診斷中的特異性和敏感性。另外，Tang等［22］研究發現聯合使用RP11-160H22.5、XLOC-014172及LOC149086診斷肝癌，AUC值可達0.896，敏感性和特異性分別可達82％和73％。Lu等［23］的研究鑒定了另外1條lncRNA-AF085935作為肝癌診斷的潛在標志物，其不僅可以區分健康人和肝癌患者還可以區分慢性乙肝患者和肝癌患者，其AUC值分別可達0.96和0.86。相比microRNA，目前lncRNA在肝癌診斷方面的研究還比較少，其診斷價值還需進一步研究。

3 非編碼RNA在肝癌分型和預后判斷方面的應用

當前臨床工作中，主要利用肝癌患者的一些臨床病理指標如腫瘤大小、腫瘤數目、有無血管侵犯和子灶等，來給肝癌分期分型，用于評判轉移、復發和生存等預后信息，進而指導患者治療方案的選擇［24］。但隨著肝癌早期診斷率的提高，這些臨床病理指標，在評判預后和分型方面顯得不足。大量的研究顯示，肝癌存在高度的異質性，不同的肝癌在發生發展過程中伴隨著不同信號通路的改變［25］。因而利用不同的分子標志物將肝癌分為生物學性質不同的亞型，將有助于評判肝癌的預后，有助于開發分子靶向性藥物，進而采取靶向性、個體化治療，這是未來肝癌治療的發展方向。為此，國內外學者做了很多努力，根據肝癌的基因組、轉錄組的不同，提出了多個肝癌的分子亞型，如Wnt亞型、增殖亞型、炎癥亞型［13，26-27］。

microRNA在肝癌分子分型和預后判斷方面顯示出良好的前景。Budhu等［28］在241個肝癌患者的癌與癌旁中檢測microRNA的表達譜，在另外131例肝癌患者的隊列中建立了一個包含20個microRNA的肝癌轉移標簽，可以很好的預測肝癌患者術后復發轉移風險。Ji等［29］在241個肝癌患者的隊列中來尋找肝癌相關的 microRNA，并在另外一個獨立的隊列驗證，檢測其與患者生存和干擾素反應性的相關性。他們發現miR-26表達水平不同的腫瘤表現出完全不同的轉錄組類型，腫瘤miR-26表達低的患者具有生存率較差，但對干擾素反應性較好。該研究是一個前瞻性的隨機對照研究，具有較高的說服力。Toffanin等［30］在89例肝癌樣本中檢測microRNA表達譜，將肝癌分為3個亞型：無翅型MMTV整合位點型（36％）、干擾素相關型（33％）和增殖型（31％）。除此之外，還有大量的microRNA被發現與肝癌的預后相關。

lncRNA雖是一個新興的研究領域，但已有大量的研究顯示其與肝癌患者的預后明顯相關。Ishibashi等［31］報道肝癌中表達HOTAIR的患者比不表達HOTAIR的患者預后要差。Lai等［32］報道肝癌中lncRNA MALAT1的高表達提示著患者肝移植術后的高復發風險。Zhang等［33］報道lncRNA SNHG15是肝癌的一個潛在預后因子。第二軍醫大學醫學遺傳實驗室是國內最早開展lncRNA研究的單位之一，Yang等［34］做了第一個肝癌的lncRNA表達譜芯片，發現肝癌的lncRNA表達譜相比癌旁組織發生了明顯改變，從這些表達差異的lncRNA中找到了數個跟肝癌預后密切相關的lncRNA。他們報道了一條新的lncRNA（命名為HEIH），發現它在肝癌中表達顯著上調，并且其表達量與肝癌的總體生存率相關。東方肝膽外科醫院的Yuan等［35］也從該芯片找到一條新的lncRNA（命名為MVIH），在215個肝癌樣本中檢測了它的表達，發現它是肝癌復發的獨立的危險因素。該實驗室的Yuan等［36］則發現了一條受TGF-β調控的lncRNAATB，其在肝癌的轉移灶中升高，促進肝癌的侵襲轉移，與肝癌患者的預后密切相關。總的來講，lncRNA在肝癌分型預后方面的研究還比較少，也缺乏大樣本、前瞻性的隨機對照研究，但其在這方面的潛質，已受到越來越多的關注。

4 問題與展望

肝癌的發生發展過程往往涉及多條信號通路的改變，單一的分子在肝癌診斷、分型和預后判斷的作用有限，在將來，將DNA、蛋白質和非編碼RNA等眾多分子進行適當的組合，可能會提高肝癌診斷、分型和預后判斷的準確性［37］。另外當前的研究比較分散，各研究小組在選用樣本數量、疾病背景、地域分布等方面差別較大，研究結果重疊較小，因而將各小組的結果進行整合分析，進行多中心、大樣本的前瞻性隨機對照研究，將有助于加快從實驗室到臨床的步伐，盡早造福廣大患者。

診斷用腫瘤標志物不僅用于腫瘤的早期診斷及定性，對于腫瘤復發轉移的早期診斷同樣意義重大。一般而言，某標志物如果能用于腫瘤的早期診斷及定性，也能用于腫瘤的復發的監測，如AFP、CA19-9等，故推測如某非編碼RNA能夠用于肝癌的早期診斷，應該也能用于肝癌復發轉移的早期診斷。而目前的研究主要集中在非編碼RNA在肝癌早期診斷的作用上，少有文獻報道其直接用于肝癌復發轉移的診斷上（僅有少量文獻報道某lncRNA可以區分腫瘤是否伴隨遠處轉移［38］），該方面仍需進一步的研究。

目前的研究顯示，lncRNA可以在血液、尿液、唾液等人體體液中穩定存在［39-40］，而且多以脂質體（exosome）內容物的形式存在［41］，可以通過PCR、分子雜交、測序等常規技術進行檢測。但是，它們在體液中的絕對含量往往較低，而且標本收集儲存方法的不當常引起其檢測的準確性。進一步技術的改進，將有助于其在臨床中的應用。

后基因組時代的到來，人們意識到生命活動遠比想象的要復雜，遠遠不是幾個公式，幾條通路就能將其描述清楚的。近些年來逐漸興起的非編碼RNA研究，使科學家們意識到生命活動是由一個由蛋白質和非編碼RNA等組成的極為復雜的網絡所調控的。對于數量龐大的非編碼RNA，尤其是lncRNA，人們目前所知道的只是冰山一角，有巨大的研究空間。

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（本文編輯：張和）

R604

A DOI:10.11952/j.issn.1007-1954.2016.05.022

2016-06-01

國家科技重大專項項目（2012ZX10002010）。

楊森（1986-），男，河南民權人，主治醫師，碩士。

簡介］薛煥洲，主任醫師，博士生導師，E-mail：xhzzzu@163.com。