糖尿病性白內障晶狀體上皮細胞的Fas、P53基因表達

王心淼,郜青葉,金子夜，馬大光，焦雪琴，狄旭

(內蒙古醫科大學附屬人民醫院眼科，呼和浩特 010020)

?

·論著·

糖尿病性白內障晶狀體上皮細胞的Fas、P53基因表達

王心淼,郜青葉,金子夜，馬大光，焦雪琴，狄旭

(內蒙古醫科大學附屬人民醫院眼科，呼和浩特 010020)

[摘要]目的探討糖尿病性白內障及老年性白內障晶狀體上皮細胞(LEC)的凋亡與Fas、P53基因的關系。方法在白內障超聲乳化手術中取糖尿病性及老年性白內障患者的晶狀體前囊膜標本45例，應用光鏡，電鏡觀察LEC的凋亡情況，應用RT-PCR定量檢測Fas蛋白，P53蛋白在白內障LEC中的表達。結果兩種白內障LEC中均有Fas，P53蛋白表達。Fas蛋白在糖尿病性白內障LEC中的表達平均是老年性白內障的13.34倍，P53蛋白在糖尿病性白內障LEC中的表達平均是老年性白內障的7.3倍，兩者差異有統計學意義(P<0.05)。結論兩種白內障LEC均出現凋亡，Fas、P53基因在糖尿病性白內障LEC凋亡中起重要作用。

[關鍵詞]糖尿病并發癥/白內障 ；上皮細胞/晶體；凋亡誘導因子；基因,p53

晶狀體上皮細胞(LEC)是晶狀體前囊膜的單層上皮細胞,是晶狀體內代謝最活躍的部位,擔負著晶狀體的生長、分化及損傷修復,在保護整個晶狀體的透明性和內環境穩定上起著重要作用[1-3]。Li等[4-6]于1995 年提出晶體細胞凋亡是非先天性白內障的共同基礎。一旦由于某些原因，如氧化作用、紫外線照射、Ca2+增高、血糖增高等因素損害了晶狀體上皮細胞的正常結構和功能，就可能導致晶狀體上皮細胞凋亡。我們對糖尿病性白內障晶體上皮細胞光鏡及電鏡的微觀研究及Fas、P53基因蛋白方面研究，從分子生物學角度研究糖尿病性白內障的防病機制。

1 對象與方法

1.1研究對象收集2012年5月至2014年5月在我院行白內障超乳手術的白內障患者43例(45眼)，其中糖尿病患者22例(23眼)，年齡53～85歲，平均年齡(70.0±4.3)歲，糖尿病病史5年以上(合并視網膜增殖性病變3例)大于白內障病史。入院前內科已確診為2型糖尿病，術前空腹血糖控制在8.3 mmol/L以下，尿糖轉陰。老年性白內障21例(22眼)，年齡55～82歲，平均年齡(68.5±2.7)歲，排除其他眼疾引起白內障的因素，白內障術前診斷標準：視力小于0.4(裸眼、矯正)，晶狀體混濁(核2～4級)，在“超乳”手術中由同一位術者完成連續環形撕囊取得中央部晶狀體前囊膜標本，直徑>5 mm。將糖尿病性和老年性白內障患者的晶體前囊膜標本各5例做RT-PCR監測，其余樣本做光鏡及電鏡檢測。

1.2方法

1.2.1光鏡標本制作取下晶狀體前囊膜標本，緩沖液沖洗干凈，平鋪于載玻片，濾紙吸除水分，干燥5 min，10%中性甲醛固定1 h，蘇木素伊紅染色，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.2.2電鏡儀器 H-700H日本日立透射電子顯微鏡。

1.2.3 RT-PCR定量檢測主要儀器及試劑：渦旋振蕩儀QL-902，離心機Centrifuge 5415D，分光光度計NANODROP 2000，熒光定量PCR儀ABI7500。TRNzol總RNA提取試劑，PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser，SYBR? Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus),ROX plus，DL2,000 DNA Marker，引物合成。

把晶狀體前囊膜標本放入已預冷的研缽中進行研磨，待組織樣本呈粉狀后加入Trizol總RNA提取試劑保存5 min加氯仿0.2 mL，用力震蕩，離心管充分混勻，室溫下放置5～10 min，用Trizol法提取總RNA，采用Nanodrop2000紫外分光光度計測量RNA純度及濃度，然后采用PrimeScript TM RT reagent Kit with gDNA Eraser進行cDNA反轉錄，將各樣品cDNA十倍稀釋后取2 μL做模板分別用于目的基因引物和內參基因引物進行擴充，同時在60～95 ℃進行溶解曲線分析，取5 mL RNA用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，凝膠自動成像儀保存圖像并定量分析，根據Real Time PCR原始檢測結果按照2-△△Ct相對定量計算公式計算出各樣品的目的基因相對定量結果即其他各樣品相對于對照樣品的基因mRNA轉錄水平的差異。

2結果

2.1光鏡和電鏡下顯示光鏡下觀察糖尿病性白內障部分LEC呈透明樣變性細胞顏色變淡，細胞內可見空泡，細胞密度較老年性白內障明顯下降，同Struck等[7]結果一致，凋亡細胞、變性細胞較老年性明顯增多。電鏡下兩種白內障患者LEC細胞形態大小不一，以扁平狀為主，內質網空泡變性，核固縮，胞漿濃縮，核膜皺褶呈不規則形，染色質分布不均勻，凋亡細胞與晶體囊膜結合疏松，有部分脫離。糖尿病性白內障LEC中可見凋亡小體，白內障LEC中未見到凋亡小體，糖尿病性LEC凋亡情況比老年性白內障更為嚴重。

2.2各樣品RealTimePCR檢測結果及分析計算出各樣品的目的基因相對定量結果，即其他各個樣品相對于對照樣品，目的基因mRNA轉錄水平的差異，結果數據見表1。

表1　Real Time PCR檢測相對定量結果

注：以糖樣本為對照樣本

3討論

本實驗電鏡下觀察到凋亡細胞體積縮小變形大多呈扁平狀，與晶體囊膜脫離，與周圍細胞間隙增大，線粒體腫大，細胞密度增加，核質濃縮，染色質分布不均，可見凋亡小體。糖尿病性白內障LEC細胞凋亡情況比老年性更為嚴重。

Fas、p53蛋白在促進白內障晶體上皮細胞凋亡中起重要作用，目前LEC導致白內障的發生已是人們關注的熱點，但從客觀上來說，對細胞凋亡過程中信號傳遞系統的認識還不夠全面，比較清楚的通路有細胞凋亡的膜受體通路，細胞色素C釋放和Caspases激活的生物化學通路。Fas是一種跨膜蛋白，與天然配對的Fasl結合，首先Fasl誘導受體三聚體化，然后再細胞膜上形成凋亡誘導復合物，內含帶有死亡結構域的Fas相關蛋白FADD，它是死亡信號轉錄中的一個連接蛋白，由兩部分組成，C端(死亡結構域即DD結構域)和N端(DED，死亡效應結構域)，DD結構域負責和Fas分子胞內段上的DD結構域結合，再以DED和Caspases8原域中的DED相互作用，聚合多個Caspases8分子，該分子隨由單鏈酶原轉化成有活性的單鏈蛋白Caspases，它作為酶原被激活后，可直接破壞細胞結構。滅活或者下調與DNA修復相關的酶、mRNA剪切蛋白和DNA交聯蛋白，由于這些蛋白功能被抑制，使細胞的增值與復制受阻并發生凋亡[8]，國內于永斌等[9]與國外Okamura等[10]比較了年齡相關性白內障和糖尿病性白內障晶狀體上皮細胞的凋亡情況發現在有增殖性視網膜病變 (DR)的囊膜樣本中，TUNEL陽性細胞的百分比明顯高于年齡相關性白內障組。P53為腫瘤抑制基因，野生型p53對細胞凋亡具有激發作用,而突變型p53則有抑制細胞凋亡的作用。在正常組織中野生型p53蛋白表達水平很低,當DNA損傷后,p53基因激活,p53蛋白增多,以終止細胞增生,使損傷DNA得以修復,保持細胞基因組的完整性;如果DNA修復失敗,p53蛋白持續升高,便可引起細胞凋亡當 p53基因發生突變時 ,突變的 p53蛋白不能引起細胞增殖的停滯或凋亡 ,導致細胞生長失控 ,腫瘤發生[11-12]。如表1中RT-PCR檢測結果所示，Fas蛋白與P53蛋白在兩種白內障中均可檢測到，糖尿病性白內障LEC中Fas蛋白相對定量平均是老年性白內障LEC中的13.22倍，p53蛋白在糖尿病性白內障LEC中的相對定量平均是老年性白內障LEC中的7.3倍，差異有統計學意義(P<0.05)，提示Fas與p53基因介導的細胞凋亡在白內障的形成中起著重要作用，電鏡下也證實糖尿病性白內障的凋亡情況比老年性白內障更為嚴重。

由于糖尿病性白內障形成的影響因素很多，本實驗結果提示我們糖尿病性白內障LEC發生凋亡的過程中房水中血糖升高可能有促進Fas、P53蛋白介導細胞凋亡的因素，如果這一因素被發現，就可以抑制Fas、P53蛋白介導細胞凋亡，減少和預防白內障的發生。

參考文獻

[1]葉任高.內科學[M].5版.北京：人民衛生出版社,2000:798.

[2]葛堅.眼科學(7年制規劃教材) [M]. 北京：人民衛生出版社，2005：186.

[3]劉兆榮,修方偉.糖尿病患者的老年白內障晶體上皮細胞超微結構及酶組織化學變化的研究[J].中國實用眼科雜志,2002，20(10)：770-772.

[4]Li WC,Kuszak JR,Dunn K,et al.Lens epithelial cell apoptosis appears to be a common cellular basis f or non-congenital cataract developm ent in human and animals[J].J Cell Biol,1995,130(1): 169-181.

[5]Li WC,Spector A.Lens epithelial cell apoptosis is an early event in the development of UBV-induced cataract[J].Free Radic Biol Med,1996,20(3): 301-311.

[6]Li WC,Kuszak JR,Wang GM ,et al,Calcimycin-induced lens epithelial cell apoptosis contributes t o cataract formation[J].Exp Eye Res,1995,61(1): 91-98.

[7]Struck HG ,Heider C ,Lautenschlager C.Changes in the lens epithelium of diabetic and non -diabetic patients with various forms of opacities in senile cataract[J].Klin Monatsbl Augenheilkd,2000,216(4): 204-209.

[8]粱曉陽，劉洛同，明揚，等.人腦膠質瘤中 Fas、Caspase-8 的表達[J].海南醫學，2014，25(7)：947-949.

[9]于永斌，王林，關立南.地塞米松和 RU-486 作用人晶狀體上皮細胞后糖皮質激素受體和 Caspase-3 的表達變化[J].哈爾濱醫科大學學報，2013，47(6)：511-516.

[10] Okamura N,Ito Y,Shibata MA,et al.Fas-mediated apoptosis in human lens epithelial cells of cataracts associated with diabetic retinopathy[J].Med Electron Microsc,2002,35(4): 234-241.

[11] Qin Y,Zhao J,Min X.MicroRNA-125b inhibits lens epithelial cell apoptosis by targeting p53 in age-related cataract[J].Biochim Biophys Acta,2014,1842(12 Pt A):2439-2447.

[12] Meikrantz W,Schlegel R.Apoptosis and the cell cycle[J].J Cell Biochem,1995,58(2):160.

Diabetic cataracts cataract lens epithelial cell apoptosis and the expression of Fas,P53 geneWangXinmiao,GaoQinmiao,JinZiye，MaDaguang,JiaoXueqin,DiXu(DepartmentofOphthalmology，theAffiliatedPeople’sHospitalofInnerMongoliaMedicalCollege，Huhhot010020，China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the relationship between lens epithelial cells (LEC) apoptosis of the diabetic cataract and senile cataract and Fas,P53 gene.MethodsAnterior lens capsules specimens 45 cases were took from diabetic and senile cataract patients in the cataract ultrasonic emulsification operation,using light and electron microscopic to observing apoptosis of LEC,and applying RT-PCR to detect quantitatively expression of Fas protein and Bax protein in cataract LEC.ResultsTwo kinds of cataract in the LEC had both protein expression of Fas and P53.Fas protein expression in diabetic cataract LEC was 13.34 times in senile cataract.P53 protein expression in diabetic cataract LEC was 7.3 times in senile cataract,there were significant differences (P<0.05).ConclusionFas and P53 genes may play an important role in cataract LEC apoptosis.

[Key words]Diabetes complications/cataract；Epithelial cells/lens,crystalline；Apoptosis inducing factor；Genes,p53

(收稿日期：2015-06-11)

Corresponding author:Jin Ziye,Email：jinziye1978@126.com

中圖分類號:R587.26

文獻標識碼:A

DOI:10.3969/J.issn.1672-6790.2016.01.012

作者簡介：王心淼，主治醫師，Email: 1977king@163.com通信作者：金子夜，醫師，Email:jinziye1987@126.com

基金項目:內蒙古科技廳2011年度自治區應用研發資金計劃(20110501)