改進HPLC法測定注射用丹參多酚酸鹽中丹酚酸B的含量Δ

吳 妍，耿魁魁，鄧曉媚，馬旖旎，陳 辰，劉 圣（安徽省立醫院藥劑科，合肥 230001）

改進HPLC法測定注射用丹參多酚酸鹽中丹酚酸B的含量Δ

吳 妍＊，耿魁魁，鄧曉媚，馬旖旎，陳 辰，劉 圣#（安徽省立醫院藥劑科，合肥 230001）

目的：改進注射用丹參多酚酸鹽中丹酚酸B含量的測定方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Hypersil ODS C18，流動相為甲醇-乙腈-甲酸-水（30∶10∶1∶59，V/V/V/V），流速為1.0 ml/min，檢測波長為286 nm，柱溫為25Ⅱ，進樣量為10 μl。結果：丹酚酸B檢測質量濃度線性范圍為0.1～3.2 mg/ml（r＝0.999 6）；精密度、穩定性、重復性試驗的RSD＜2.0%；加樣回收率為98.15%～100.23%（RSD＝0.58%，n＝9）。結論：改進的方法靈敏度更高、重復性更好，適用于測定注射用丹參多酚酸鹽中丹酚酸B的含量。

高效液相色譜法；注射用丹參多酚酸鹽；丹酚酸B；含量測定

丹參為唇形科鼠尾草屬植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根莖[1]，注射用丹參多酚酸鹽是由丹參提取的以丹酚酸B為主要活性成分的水溶性化合物[2-4]。該化合物有活血、化瘀、通脈的功效，可用于冠心病穩定型心絞痛癥見胸痛、胸悶、心悸者。目前，對丹參多酚酸鹽、丹參藥材及其制劑中相關成分的研究較多，且方法均較復雜[5-7]。因此，本課題組在前期正交試驗的基礎上[8]，改進了流動相，建立了以高效液相色譜法（HPLC）測定注射用丹參多酚酸鹽中丹酚酸B含量的方法，以期為注射用丹參多酚酸鹽的質量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-2010A HT型HPLC儀，包括紫外檢測器、四元低壓泵、自動進樣器、LabSolutions Version 5.51色譜工作站（日本Shimadzu公司）；PHS-3C型電子pH計（上海雷磁儀器廠）；FA2004B型萬分之一電子天平（上海精科天美科學儀器有限公司）；KJ-202型振蕩器（江蘇康健醫療用品有限公司）；TGL-16B型高速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

注射用丹參多酚酸鹽（上海綠谷制藥有限公司，批號：1507132、1603091，規格：100 mg/支）；0.9%氯化鈉注射液（安徽豐原藥業股份有限公司，批號：14072395，規格：250 ml/袋）；丹酚酸B對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號：115939-25-8，純度≥98%）；甲醇、乙腈為色譜純，甲酸為分析純，水為滅菌注射用水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil ODS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-乙腈-甲酸-水（30∶10∶1∶59，V/V/V/V）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：286 nm；柱溫：25Ⅱ；進樣量：10 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取丹酚酸B對照品適量，置于1.5 ml離心管中，加75%甲醇溶液1.0 ml，以1 000 r/min振蕩4 min后，以半徑為5.9 cm、轉速為1 000 r/min離心1 min，即得質量濃度為32 mg/ml的對照品貯備液。精密吸取上述貯備液100 μl，置于1.5 ml離心管中，加75%甲醇溶液溶解并稀釋至1.0 ml，混勻，即得。

2.2.2 供試品溶液 取樣品100 mg，置于125 ml量瓶中，加0.9%氯化鈉注射液溶解并定容，搖勻，即得。

2.2.3 陰性對照溶液 取0.9%氯化鈉注射液作為陰性對照溶液。

2.3 系統適用性試驗

精密吸取“2.2”項下對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。在此色譜條件下，丹酚酸B與其他成分分離較好，理論板數按丹酚酸B峰計≥2 000，且陰性對照在對照品主峰相應的保留時間處（7.48 min）無色譜峰出現，表明對測定無干擾。

2.4 線性關系考察

圖1 高效液相色譜圖A.對照品；B.供試品；C.陰性對照；1.丹酚酸BFig 1 HPLC chromatogramsA.reference substance；B.test sample；C.negative control；1.salvianolic acid B

精密吸取“2.2.1”項下對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 ml，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分質量濃度（x，mg/ml）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得丹酚酸B的回歸方程為y＝7 202 620x+30 990（r＝0.999 6）。結果表明，丹酚酸B檢測質量濃度線性范圍為0.1～3.2 mg/ml。

2.5 精密度試驗

精密吸取“2.2.1”項下對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果，丹酚酸B峰面積的RSD＝0.91%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩定性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：1507132）適量，分別于室溫下放置0、1、2、4、6、8 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，丹酚酸B峰面積的RSD＝0.42%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置8 h內穩定性良好。

2.7 重復性試驗

取同一批樣品（批號：1507132）適量，共6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量。結果，丹酚酸B的平均含量為78%，RSD＝1.35%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗

取已知含量的樣品（批號：1507132）10 mg，精密稱定，共9份，各置于10 ml量瓶中，分別加入低、中、高質量的丹酚酸B對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表1。

2.9 樣品含量測定

取2批樣品各適量，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算丹酚酸B的含量。結果，2批樣品（批號：1507132、1603091）中丹酚酸B的平均含量分別為77.73%、79.21%，RSD分別為1.33%、1.43%（n＝3）。

3 討論

表1 加樣回收率試驗結果（n＝9）Tab 1 Results of recovery test（n＝9）

3.1 流動相的選擇

本課題組在預試驗時分別采用甲醇-5 mmol/L磷酸二氫鉀[9]、乙腈-0.03%磷酸[10]、甲醇-乙腈-水為流動相。結果，前兩種溶液作為流動相時丹酚酸B峰存在拖尾現象，理論板數較低，且保留時間相對較短；而甲醇-乙腈-水作為流動相時丹酚酸B峰稍有拖尾。筆者在后者基礎上進行改進，加入甲酸，結果丹酚酸B峰形改善。因此，本試驗最終選擇甲醇-乙腈-甲酸-水（30∶10∶1∶59，V/V/V/V）作為流動相。

3.2 對含量測定結果的分析

丹酚酸B又稱丹酚乙酸（Salianic acid B）[10]，按照注射用丹參多酚酸鹽的質量標準（YBZ09012005-2010Z-2013）丹參乙酸鎂含量應達80.0%～90.0%，因丹參乙酸鎂為丹酚酸B的鎂鹽存在形式，且丹參乙酸鎂含量＝丹酚酸B含量×1.03[3]，故注射用丹參多酚酸鹽中丹酚酸B含量應達到77.67%～87.38%。從本研究結果來看，各批次樣品中丹酚酸B含量的檢測結果均符合質量標準，但含量還是相對較低。

綜上所述，改進的方法靈敏度更高、重復性更好，適用于測定注射用丹參多酚酸鹽中丹酚酸B的含量。

[1] 高元峰，陳虎，王銀輝，等.丹酚酸B對大鼠離體心臟缺血再灌注損傷的保護作用[J].中國藥房，2013，24（43）：4 047.

[2] 趙業清，朱慧娟，文九芳.丹參多酚酸鹽注射液治療冠心病心絞痛的系統評價[J].現代中西醫結合雜志，2012，21（16）：1 722.

[3] 趙瓊，任大偉，楊瑞花，等.丹參不同產地加工方法對丹參多酚酸鹽質量的影響[J].中華中醫藥雜志，2013，28（3）：645.

[4] 吳笛，葉秋雄，李楚源.一測多評法測定復方丹參片中5種酚酸類成分的含量[J].中國新藥雜志，2013，22（18）：2 130.

[5] 李安平，楊錫，丁永輝，等.HPLC法同時測定丹參注射液中8種成分[J].蘭州大學學報：醫學版，2012，38（3）：34.

[6] 薛靜，葉正良，李德坤，等.HPLC同時測定丹參多酚酸中丹酚酸D、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的含量[J].中國實驗方劑學雜志，2013，19（3）：70.

[7] 厲瑤，郭正泰，龔行楚，等.丹參紅花混煎液中丹參素、羥基紅花黃色素A、迷迭香酸、紫草酸和丹酚酸B的HPLC測定方法[J].中國中藥雜志，2013，38（11）：1 653.

[8] 耿魁魁，劉圣，吳妍.正交實驗法優選注射用丹參多酚酸鹽調配技術[J].中成藥，2015，37（1）：220.

[9] 趙瓊，孫仁弟，楊瑞花，等.不同產地丹參藥材對丹參多酚酸鹽質量的影響[J].上海醫藥，2014，35（9）：53.

[10] 黃鐵英，石蘇英，周黎琴.注射用丹參多酚酸鹽的穩定性再評價[J].中國生化藥物雜志，2016，36（3）：157.

Content Determination of SalvianolicAcid B in Salvianolate Injection by Improved HPLC

WU Yan，GENG Kuikui，DENG Xiaomei，MA Yini，CHEN Chen，LIU Sheng（Dept.of Pharmacy，Anhui Provincial Hospital，Hefei 230001，China）

OBJECTIVE：To improve the method of content determination of salvianolic acid B in Salvianolate injection. METHODS：HPLC method performed on the column of Hypersil ODS C18with mobile phase of methanol-acetonitrile-methanoic acid-water（30∶10∶1∶59，V/V/V/V）at a flow rate of 1.0 ml/min，detection wavelength was 286 nm，column temperature was 25Ⅱ，and injection volume was 10 μl.RESULTS：The linear range of salvianolic acid B was 0.1-3.2 mg/ml（r＝0.999 6）；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2%；recovery was 98.15%-100.23%（RSD＝0.58%，n＝9）.CONCLUSIONS：The improved method is more sensitive and reproducible，and suitable for the content determination of salvianolic acid B in Salvianolate injection.

HPLC；Salvianolate injection；Salvianolic acid B；Content determination

R917

A

1001-0408（2016）36-5135-03

2016-01-15

2016-08-19）

（編輯：劉 柳）

安徽省衛生計生委中醫藥科研課題（No.2014zy20）

＊主管藥師。研究方向：臨床藥學。電話：0551-62284181。E-mail：aydwy@126.com

#通信作者：主任中藥師。研究方向：臨床藥學與藥劑學。電話：0551-62284029。E-mail：lslcclhl@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2016.36.30