土茯苓藥材HPLC指紋圖譜研究及主成分的含量測定

張永貴，趙 力，楊小英（寧夏醫科大學總醫院，銀川 750004）

土茯苓藥材HPLC指紋圖譜研究及主成分的含量測定

張永貴＊，趙 力，楊小英#（寧夏醫科大學總醫院，銀川 750004）

目的：建立土茯苓藥材的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜及同時測定其中落新婦苷、白藜蘆醇含量的方法。方法：采用HPLC法。色譜柱為Zorbax SB-C18，流動相為甲醇-0.2%乙酸溶液（梯度洗脫），流速為1.0 ml/min，檢測波長為306 nm，柱溫為30Ⅱ，進樣量為20 μl。以落新婦苷為參照物，對13批樣品HPLC圖譜采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2004 A版）進行相似度評價。結果：13批樣品HPLC圖譜有12個共有峰，相似度均＞0.90。落新婦苷、白藜蘆醇檢測質量濃度線性范圍分別為6.65～425.6、1.72～110 μg/ml（r均為0.999 9）；精密度、穩定性、重復性試驗的RSD＜3.0%；加樣回收率分別為97.30%～102.30%（RSD＝1.97%，n＝6）、98.12%～104.02%（RSD＝2.57%，n＝6）。結論：該研究所建指紋圖譜可為土茯苓藥材的鑒別和質量評價提供參考；該測定方法操作簡便，精密度、穩定性、重復性良好，可用于土茯苓藥材中落新婦苷和白藜蘆醇含量的同時測定。

土茯苓；落新婦苷；白藜蘆醇；指紋圖譜；含量測定

土茯苓系常用中藥，為百合科植物光葉菝葜Smilax rhizoma的干燥根莖，有除濕、解毒、通利關節之功效[1]。菝葜屬約有300種，我國約有60種，主產于四川、貴州[2]。由于同屬植物品種繁多、形態相近，導致土茯苓藥材市場比較混亂，難以科學地評價其真偽優劣。土茯苓中主要含有落新婦苷、黃杞苷、白藜蘆醇等成分，2015年版《中國藥典》（一部）規定了土茯苓中落新婦苷的含量要求。本試驗通過建立土茯苓藥材高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜并對其中有效成分落新婦苷和白藜蘆醇含量進行同時測定，旨在為該藥材質量評價提供科學依據。

1 材料

1.1 儀器

1100型HPLC儀，包括四元梯度泵、在線脫氣機、柱溫箱、自動進樣器、DAD二極管陣列檢測器（美國Agilent公司）；KQ2200DE型數控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率：250 W，頻率：40 kHz）；5804R型低溫離心機（美國Eppendorf公司）；VORTEX-2GENIE型渦旋儀（美國Scientific公司）；DV215CD型電子分析天平（美國Ohaus公司）；LD-100型粉碎機（長沙市常宏制藥機械設備廠）。

1.2 試劑

落新婦苷對照品（寶雞市辰光生物科技有限公司，批號：20130608，純度：98%）；白藜蘆醇對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111535-200301，純度：98%）；甲醇為色譜純，冰乙酸為分析純，水為超純水。

1.3 藥材

13批土茯苓藥材分別購自醫院、零售藥店及個體診所（見表1），經寧夏醫科大學總醫院楊小英主任藥師鑒定為真品。

表1 土茯苓藥材來源Tab 1 Source of S.rhizoma

2 方法與結果

2.1 指紋圖譜的建立

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）-0.2%乙酸溶液（B），梯度洗脫（洗脫程序見表2）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：306 nm；柱溫：30Ⅱ；進樣量：20 μl。

2.1.2 溶液的制備 （1）混合對照品溶液。精密稱取落新婦苷、白藜蘆醇對照品適量，加甲醇制成落新婦苷、白藜蘆醇質量濃度分別為532、550 μg/ml的混合對照品溶液。（2）供試品溶液。取樣品粉末過80目篩，稱取約1 g，精密稱定，置于10 ml量瓶中，加75%甲醇10 ml，精密稱定質量，超聲處理30 min，取出放冷至室溫，加75%甲醇補足減失的質量，以半徑為12.5 cm、14 000 r/min離心10 min，取上清液，即得。

表2 梯度洗脫程序Tab 2 Gradient elution program

2.1.3 方法學考察 （1）精密度試驗。取“2.1.2”項下混合對照品溶液適量，按“2.1.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，以落新婦苷峰的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對保留時間和相對峰面積。結果，各共有峰相對保留時間的RSD＜2.49%，相對峰面積的RSD＜4.71%（n＝6），表明儀器精密度良好。（2）穩定性試驗。取“2.1.2”項下供試品溶液（編號：S1）適量，分別于室溫下放置0、3、6、9、12 h時進樣測定，以落新婦苷峰的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對保留時間和相對峰面積。結果，各共有峰相對保留時間的RSD＜2.82%，相對峰面積的RSD＜4.96%（n＝5），表明供試品溶液在室溫下放置12 h內基本穩定。（3）重復性試驗。精密稱取同一批樣品（編號：S1）適量，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，以落新婦苷峰的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對保留時間和相對峰面積。結果，各共有峰相對保留時間的RSD＜3.52%，相對峰面積的RSD＜5.00%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.1.4 指紋圖譜的建立與對照圖譜的生成 （1）指紋圖譜的建立。取13批樣品粉末適量，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，得特征指紋圖譜，詳見圖1。

（2）對照圖譜的生成。采用國家藥典委員會發布的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2004 A版）對13批樣品HPLC圖譜進行圖譜擬合，選取時間窗寬度為0.1 min，采用中位數法，經過多點校正后自動匹配，生成對照圖譜，詳見圖2。結果表明，13批樣品HPLC圖譜整體特征相似，具有12個共有峰，其中峰8為落新婦苷，含量高、分離度好，所以選擇峰8為參照峰。

圖1 13批樣品高效液相色譜指紋圖譜Fig 1 HPLC chromatograms fingerprint of 13 batches of samples

（3）相對保留時間和相對峰面積分析。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2004 A版）對13批樣品HPLC圖譜進行比較分析。13批樣品HPLC圖譜12個共有峰的相對保留時間和相對峰面積見表3、表4。

圖2 13批樣品高效液相色譜對照圖譜Fig 2 HPLC chromatograms control of 13 batches of samples

（4）相似度評價。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2004版）對13批樣品HPLC圖譜進行比較分析并計算各樣品HPLC圖譜與對照圖譜的相似度，結果均＞0.90，詳見表5。

2.2 落新婦苷、白藜蘆醇的含量測定

2.2.1 系統適用性試驗 取“2.1.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液各適量，分別按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖3。結果，理論板數以落新婦苷、白藜蘆醇峰計均＞3 000；分離度＞1.5，各成分基線分離良好。

2.2.2 線性關系考察 分別精密量取“2.1.2”項下混合對照品溶液0.1、0.5、1、5、10 ml，各置于10 ml量瓶中，加流動相（15∶ 95，V/V）定容，制成系列混合對照品溶液，精密量取各20 μl，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以落新婦苷、白藜蘆醇質量濃度（x，μg/ml）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得落新婦苷、白藜蘆醇回歸方程分別為y＝29.295x+40.586（r＝0.999 9）、y＝119.190x+0.385（r＝0.999 9）。結果表明，落新婦苷、白藜蘆醇檢測質量濃度線性范圍分別為6.65～425.6、1.72～110 μg/ml。

表3 13批樣品HPLC圖譜共有峰的相對保留時間Tab 3 Relative retention time of the HPLC chromatograms of 13 batches of samples

表4 13批樣品HPLC圖譜共有峰的相對峰面積Tab 4 Relative peak area of the HPLC chromatograms of 13 batches of samples

表5 13批樣品HPLC圖譜相似度評價結果Tab 5 Similarity evaluation results of the HPLC chromatograms of 13 batches of samples

2.2.3 精密度試驗 取“2.1.2”項下混合對照品溶液適量，按“2.1.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果，落新婦苷、白藜蘆醇峰面積的RSD分別為2.28%、1.88%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.2.4 穩定性試驗 取“2.1.2”項下供試品溶液（編號：S2）適量，分別于室溫下放置0、3、6、9、12 h時按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，落新婦苷、白藜蘆醇峰面積的RSD分別為1.72%、1.88%（n＝5），表明供試品溶液在12 h內基本穩定。

2.2.5 重復性試驗 精密稱取同一批樣品（編號：S2）適量，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，落新婦苷、白藜蘆醇峰面積的RSD分別為2.58%、2.77%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.2.6 加樣回收率試驗 取已知含量的樣品（編號：S2）適量，共6份，分別加入一定質量的落新婦苷、白藜蘆醇對照品，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表6。

2.2.7 樣品含量測定 取3批樣品各適量，分別按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量，結果見表7。

圖3 高效液相色譜圖A.混合對照品；B.供試品；1.落新婦苷；2.白藜蘆醇Fig 3 HPLC chromatogramsA.mix reference substance；B.test sample；1.astilbin；2.resveratrol

表6 加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 6 Results of recovery test（n＝6）

3 討論

筆者分別考察了100%甲醇、75%甲醇、75%乙醇對提取效果的影響，結果表明，以75%甲醇提取的樣品出峰數較多，基線平整，故提取溶劑選擇75%甲醇。筆者選擇流動相甲醇-0.2%乙酸溶液梯度洗脫時[3]，樣品出峰數最多，分離度佳，時間適中。落新婦苷在290 nm波長處有最大吸收，白藜蘆醇在306 nm波長處有最大吸收，因藥材中白藜蘆醇含量較低，為使二者均有較好的靈敏度，選擇306 nm為檢測波長[4]。

通過對13批樣品HPLC圖譜分析，發現批間色譜峰數和峰面積雖然存在一定差異，但整體特征相似，具有12個共有色譜峰，相似度均＞0.90。

表7 樣品含量測定結果（n＝3，%）Tab 7 Determination of Results of contents determination of samples（n＝3，%）

對13批樣品進行含量測定，結果表明其中落新婦苷與白藜蘆醇含量有明顯差異。2015年版《中國藥典》（一部）規定土茯苓中落新婦苷含量不得低于0.45%，13批樣品中7批含量符合規定，6批含量低于規定。這種差異可能與藥材的產地[5-6]密切相關。

綜上所述，本研究所建指紋圖譜可為土茯苓藥材的鑒別和質量評價提供參考；本測定方法操作簡便，精密度、穩定性、重復性良好，可用于土茯苓藥材中落新婦苷和白藜蘆醇含量的同時測定。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].2015年版.北京：中國醫藥科技出版社，2015：18.

[2] 王永齊，王寶昌，付效雪，等.菝葜和肖菝葜屬藥材中落新婦苷藥源植物的研究進展[J].中國藥房，2014，25（15）：1 430.

[3] 溫慶偉，鄒錄惠，藍曉慶，等.土茯苓配方顆粒HPLC指紋圖譜研究[J].中國實驗方劑學雜志，2013，19（6）：99.

[4] 李磊，張宏桂，喬延江.HPLC法測定土茯苓藥材中落新婦苷和白藜蘆醇的含量[J].藥物分析雜志，2007，27（5）：654.

[5] 白梅，劉為萍，李素珍.HPLC測定不同產地土茯苓中落新婦苷和黃杞苷含量[J].藥物分析雜志，2013，33（8）：1 352.

[6] 陳章源，李戰，董青松，等.廣西境內不同產區土茯苓中落新婦苷的含量測定[J].中國藥業，2011，20（17）：8.

（編輯：張 靜）

Study on the Quality of Commercially Available HPLC Fingerprint and Content Determination of Principal Component of Smilacis rhizoma

ZHANG Yonggui，ZHAO Li，YANG Xiaoying（General Hospital of Ningxia Medical University，Yinchuan 750004，China）

OBJECTIVE：To establish the HPLC fingerprint and determine the contents of astilbin and resveratrol in Amilacis rhizoma.METHODS：HPLC was performed on the column of Zorbax SB-C18with the mobile phase of methanol-0.2%acetic acid solution（gradient elution）at a flow rate of 1.0 ml/min，the detection wavelength was 306 nm，column temperature was 30Ⅱ，and injection volume was 20 μl.With reference of astilbin，the similarity analysis was conducted for the HPLC chromatograms of 13 batches of samples by using TCM Fingerprint Similarity Evaluation System（2004 A edition）.RESULTS：There were totally 12 common peaks in the HPLC chromatograms of 13 batches of samples，similarities were all higher than 0.90.The linear range was 6.65-425.6 μg/ml for astilbin（r＝0.999 9）and 1.72-110 μg/ml for resveratrol（r＝0.999 9）；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 3.0%；recoveries were 97.30%-102.30%（RSD＝1.97%，n＝6）and 98.12%-104.02%（RSD＝2.57%，n＝6）.CONCLUSIONS：The established fingerprint can provide reference for the identification and quality evaluation of S.rhizoma，the method is simple with good precision，stability and reproducibility，and can be used for the identification of S.rhizoma simultaneous determination of astilbin and resveratrol in S.rhizoma.

Smilacis rhizoma；Astilbin；Resveratrol；Fingerprint；Content determination

R927

A

1001-0408（2016）36-5143-04

2016-08-24

2016-10-27）

＊副主任藥師。研究方向：醫院藥學。電話：0951-5601267

#通信作者：主任藥師。研究方向：臨床藥學及臨床藥理學。電話：0951-6743031。E-mail：yxy-1970@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2016.36.33