DNA條形碼在我國家禽種質資源保護中的應用研究

鄧繼賢，楊秀榮，蔣和生，廖玉英，韋鳳英*

（1.廣西壯族自治區畜牧研究所，廣西 南寧 530001；2.廣西大學動物科學技術學院，廣西 南寧 530004）

DNA條形碼在我國家禽種質資源保護中的應用研究

鄧繼賢1，楊秀榮2，蔣和生2，廖玉英1，韋鳳英1*

（1.廣西壯族自治區畜牧研究所，廣西 南寧 530001；2.廣西大學動物科學技術學院，廣西 南寧 530004）

DNA條形碼技術就是利用一段短的標準的DNA序列來鑒定不同的種群，從DNA水平，來確定不同種群系統發育的關系。隨著對DNA條形碼技術的研究，其應用范圍也是越來越廣泛。DNA條形碼技術的研究先前在我國多側重于植物和海洋及漁業的分類上，現在逐漸發展到對物種的鑒別應用上，特別是在家畜、鳥類和家禽上，都有所應用。本文就DNA條形碼技術的特點、優勢及在家禽種質資源保護方面的應用進行簡要的綜述，討論了DNA條形碼技術在家禽種質資源保護的意義，并對DNA條形碼技術在我國地方家禽品種保護中的優勢進行展望。

家禽；種質資源；DNA條形碼；保護

我國是世界上地方家禽品種最為豐富的國家之一，擁有豐富的品種資源。畜禽品種資源是生物多樣性的重要組成部分，是長期選擇的結果，是人類賴以生存和發展的基石，是人類未來發展的重要基因庫。我國地方家禽品種具有肉品質好、耐粗飼、抗病性強及對環境適應性強等優點，在世界家禽品種中占有重要的位置。隨著國家對畜禽品種資源的重視，在很多地方建立了保種場或保護區，但受限于人們的認識及保種資金和技術限制，保種效果并不十分明顯。而人們對于純正地方品種的鑒別，也只是根據動物的外觀和從業者或科技工作者的經驗等傳統方法來進行判斷，對于其品種認定并沒有一個嚴格的界定，嚴格意義上來說，對品種沒有真正意義上的鑒別。DNA條形碼（DNA barcoding)技術的出現為我國物種分類研究和動物保護等科學領域開辟了一條新的出路，也為經濟家禽品種保護提供了一種新的鑒別方法。但目前在我國，這項技術的應用還沒普及，對于家禽品種資源并沒有很好的保護和充分利用其科學價值，相關的研究也僅限于對一些物種進行分類和簡單的鑒別。DNA條形碼技術就是利用一段短的標準的DNA序列來鑒定不同的種群，從DNA水平來確定不同種群系統發育的關系。應用DNA條形碼技術能確定種群之間的親緣關系，為更好地保護動物提供一些非常有價值的信息，對確定動物保護的基本單元非常有幫助。本文就DNA條形碼技術的現狀及其優勢、DNA條形碼在我國家禽領域應用現狀及在家禽種質資源保護方面的應用和意義進行簡要的綜述，并就DNA條形碼技術在我國地方家禽品種中的保護優勢進行展望。

1 DNA條形碼技術研究現狀

在2003年，加拿大的Hebert教授[1]首次提出了利用線粒體細胞色素C氧化酶I(Cytochrome c oxidase subunit I，COI)來構建物種鑒別體系的DNA條形碼。自Hebert教授提出之后，DNA條形碼技術經歷了快速發展。同年，在美國冷泉港就真核生物DNA條形碼的科學性和社會功能先后舉行了兩次專門會議來討論，并就此提出了國際生命條形碼計劃（International Barcode ofLife，iBOL）。隨后在2004年，“生命條形碼聯盟”（the Consortium for the Barcode of Life,CBOL）在美國華盛頓成立；同年，“生命條形碼聯盟”與美國國家生物技術信息中心（NCBI）建立合作關系，NCBI平臺同意收錄測序所獲得的DNA條形碼標準序列。生命條形碼數據庫（Barcode of life data systems,BOLD）在2007年正式啟動，為全球的DNA條形碼研究者或從業者提供數據共享和交流的平臺。國際生命條形碼計劃于2010年正式啟動。截至2014年4月，BOLD收錄了包含動物、植物、真菌和原生生物等四大類，總計超過了21萬種生物，條形碼序列總計超過290萬個。而我國的生物條形碼研究相對比較晚一些，在2011年先后成立的生命條形碼南方中心和北方中心兩個中心，目前我國的生命條形碼信息管理系統（data.barcodeoflife.cn）以不同的類群生物為記錄單元，收集了我國所有生物的DNA條形碼序列，以及物種描述等相關信息，目前該平臺共收錄了動物、植物、微生物三大類群，共超過18 000個樣本，序列信息超過了23 000條。

DNA條形碼技術是以線粒體基因為基礎的，目前的研究表明，在不同種群的DNA條形碼標記基因有很多，且存在較大的差異，如在動物中常用的COI基因、NDI基因、Cytb基因、COII基因和16S rRNA基因等；在植物中常用的matK基因；真菌中的插入間隔序列(ITS)以及原生生物條形碼基因質體擴增子(UPS)等。但在DNA條形碼的選擇上，由于COI基因進化快，且與其他基因序列相比較而言，很少有缺失和插入的突變，從而Hebert等[2]曾極力推薦把COI作為一個最佳的候選通用條碼來鑒別動物物種；Miner等[3]認為COI基因的密碼子第3位堿基不受自然選擇壓力的影響，可以自由變異，而具有蛋白編碼基因所共有的特征。目前，在動物條形碼研究中，COI基因的應用最為廣泛，且被證明是動物分類鑒定中是最有效的條形碼基因[4-8]，而ITS、Cyt b、NDl等基因序列也被作為DNA條形碼，并能成功的鑒別動物物種[9,10]。

2 DNA條形碼技術的優勢

DNA條形碼技術可以避免物種在形態學分類上的缺陷，能加快物種的鑒定及挖掘隱存的物種，其國際上共享的條形碼數據庫資源也為生態學、醫學、生物地理學、生物工程、物種保護及進化生物學等研究領域提供重要的參考資料。Hebert等[2]認為DNA條形碼技術可以用來區分和鑒別物種，發現新的物種，通過分析變異的基因序列和種群的遺傳結構，重新構建物種和高級階元的演化關系。與傳統的形態學分類方法相比較，DNA條形碼技術主要有以下幾個方面的優勢：

2.1 可以準確地鑒別表型變化大的物種，使物種鑒定的界限更加清楚

有些物種受環境的影響，外部表型變異大，常規的分類方法難以區分，而應用DNA條形碼來進行物種鑒定的時候，通常采用一些特定的遺傳變異值來區分物種，能彌補傳統形態學分類的不足，更客觀地鑒定物種。

2.2 可以準確鑒別不同發育時期的個體，不會受到生物生長階段的影響

有一些生物在不同的發育階段和不同的生長環境，其形態的變化很大。然而DNA在個體發育過程中始終不會改變，從而DNA條形碼的鑒定結果也不會受到影響，所以采用DNA條形碼技術可以鑒定處于不同發育階段的生物個體。

2.3 能夠區分形態相似度很高的生物

對于外部形態極為相似的物種，應用傳統的形態學方法是很難區分的，而DNA條形碼技術就能從基因水平準確區分此類物種，有利于物種的分類，有時候還能夠發現一些隱存物種。

2.4 不受生物個體大小的影響，可以鑒定瀕危物種和未知物種

對于一些沒有妥善保存、外部形態或信息不完整的生物體，可以利用DNA條形碼技術進行區分鑒定?；蛘邔τ谝恍┱湎』驗l危物種，不能方便取樣，那么只需獲得其糞便、毛發或微少組織中的DNA物質，就能加以鑒定。

2.5 可以加速物種的鑒定和發現新的物種

DNA條形碼應用通用引物，可以一次性大批量的擴增和測序，從而提高了物種鑒定速度。而利用匯聚全球物種資料的DNA條形碼數據庫，便可以加速新物種的發現。

2.6 成本低廉、方便快捷

DNA條形碼技術能夠用較低的成本，可以快速獲得所需要的信息，且DNA條形碼方法簡單，即便是非專業人員也可以利用該方法進行物種鑒定。相比而言，要獲得形態學特征的數據比較費時，而且對于一些物種形態學數據根本無法獲得[11]。因此，應用DNA條形碼技術進行物種鑒定和分類是可行的。

3 DNA條形碼在我國家禽種質資源保護中的應用

DNA條形碼在2003年被發現以來，在其數據庫、條形碼數量、研究領域和方法都得到了快速發展。在包括靈長類、腹足類、嚙齒類、蝶類、蚌類、魚類、昆蟲類、蟻類、甲殼類、蚯蚓類、原生動物和兩棲類等都有報道[4,7-10,12-14]，但是在哺乳動物家畜方面的研究較少，在鳥類和家禽方面鮮有報道。如Hebert等[15]以COI條形碼就鑒定出了8種有疑問的鳥類。在我國的家禽領域，DNA條形碼技術也有較多研究。徐向明[16]測定了3個地方品種鴨COI基因的部分序列，證明利用COI基因序列可以進行品種鑒定。高玉時等[17]測定了我國6個地方雞品種的COI基因的兩段序列，研究結果表明，Bar1序列可以用作地方雞品種鑒定條形碼；而Bar2序列不利于做品種鑒定序列。王潔[18]研究了我國三個地方品種鴨的COI序列的差異，結果表明3個品種的差異與形態學分類基本一致。屠云潔等[19]以大骨雞、安義瓦灰雞和金湖鳥鳳雞3個地方雞種為研究對象，利用DNA測序技術測定了COI基因序列，結果表明，選擇的這段COI基因序列在3個地方雞種中有3個突變位點，為4個單倍型。認為3個品種的DNA分類和形態學分類基本一致，該基因可以探討地方雞種分類問題。屠云潔等[20]利用COI基因序列對我國7個地方雞種進行分子評估，發現了存在22個突變位點，為13個單倍型，其中有11個單倍型為各品種所特有；其中6個雞種有其特異性位點，認為這些特異單倍型和特異位點可以作為DNA條形碼進行分子評估，并可以作為輔助各品種鑒定的依據。唐修君等[21]以中國2個新發現雞種資源金湖烏鳳雞、安義瓦灰雞及地方雞種狼山雞為研究對象，利用DNA測序技術測定了COI基因序列，揭示2個新發現資源COI基因的遺傳多樣性及其與地方雞種的遺傳關系。結果顯示，選擇的這段COI基因序列在2個新發現資源和狼山雞中有10個突變位點，為7個單倍型，其中有3個為特異性突變位點，5個特異性單倍型。認為利用COI這一特定基因的特定片段來作為DNA條形編碼的基礎，進行不同雞品種鑒定具有方便、快捷、經濟、準確等優點，是可行和有效的。薛茂云等[22]以狼山雞和鹿苑雞為研究對象，利用DNA測序技術測定了COI基因，結果表明選擇的COI基因序列有15個突變位點，共9個單倍型，其中狼山雞有3個特異單倍型，鹿苑雞有5個特異單倍型，這為尋找品種鑒定依據奠定了基礎。虞德兵等[23]利用COI基因測序方法對云南省施甸縣地方雞種進行了研究。虞德兵等[24]對中國9個地方鴨和1個番鴨品種的COI基因進行了測定，結果顯示所有家鴨個體在l517位點出現1個T堿基缺失。番鴨與家鴨的mtDNACOI基因堿基組成相似；9個鴨品種個體共檢出11種單倍型，單倍型的多樣度為0.856。高玉時等[25]以13個中國地方雞種和2個國外引進品種為研究對象，利用DNA測序技術測定了COI基因，認為這一特定基因的特定區段可以用來做DNA條形編碼，進行不同雞品種鑒定，具有可行性和有效性。從以上的這些研究報道可以看出，當前中國地方家禽品種的分類體系有所研究，但所涉及的品種較少，還不是很全，分子標記數量也很有限。通過對核DNA和線粒體DNA的序列信息分析，來探討我國地方家禽品種的系統發育問題，可為保護我國地方家禽品種提供遺傳物質本身DNA依據。

4 展望

我國地域遼闊，品種資源多樣性豐富，是世界上畜禽遺傳資源最為豐富的國家之一。我國養禽歷史悠久，家禽地方品種資源豐富，不僅物種、類群齊全，而且種質特性各異，各具特點。因此，也建議應用現有的技術水平，根據品種志上列出的家禽品種，以及新發現還沒有列入家禽品種，采集品種樣本，建立一個包含該品種的圖片、生活地點及環境、個體名稱及生長情況、年齡、采集的時間等一些重要信息的我國地方家禽（主要是雞和鴨）的DNA條形碼數據庫是非常有必要的，這對于保護我國地方家禽品種，尤其是一些瀕危或瀕臨滅絕的品種的基因資源和品種信息等都是至關重要的。建立的家禽DNA條形碼數據庫，不論從應用價值出發，還是從科研角度來看；不論從眼前的利益出發，還是長遠的發展來看，建立標準的數據庫，都將給我國地方家禽品種的科研和商業領域帶來無可估量的經濟價值和社會價值。

[1]Hebert P.D.,Cywinska A.,Ball S.L.,et al.Biological identifications through DNA barcodes[J].Proc Biol Sci,2003, 270(1512):313-21.

[2]Hebert P.D.,Ratnasingham S.,deWaard J.R.Barcoding animal life:cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species[J].Proc Biol Sci,2003,270 Suppl 1:S96-9.

[3]Miner B.E.,Stoger R.J.,Burden A.F.,et al.Molecular barcodes detect redundancy and contamination in hairpin-bisulfite PCR[J].Nucleic Acids Res,2004,32(17):e135.

[4]Ward R.D.,Zemlak T.S.,Innes B.H.,et al.DNA barcoding Australia's fish species[J].Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci,2005,360(1462):1847-57.

[5]Ekrem T.,Willassen E.,Stur E.A comprehensive DNA sequence library is essential for identification with DNA barcodes[J].Mol Phylogenet Evol,2007,43(2):530-42.

[6]Rach J.,Desalle R.,Sarkar I.N.,et al.Character-based DNA barcoding allows discrimination of genera,species and populations in Odonata[J].Proc Biol Sci,2008,275(1632):237-47.

[7]Dinca V.,Zakharov E.V.,Hebert P.D.,et al.Complete DNA barcode reference library for a country's butterfly fauna reveals high performance for temperate Europe[J].Proc Biol Sci,2011,278(1704):347-55.

[8]Elmeer K.,Almalki A.,Mohran K.A.,et al.DNA barcoding of Oryx leucoryx using the mitochondrial cytochrome C oxidase gene[J].Genet Mol Res,2012,11(1):539-47.

[9]KochziusM.,SeidelC.,AntoniouA.,etal.IdentifyingFishesthroughDNABarcodesandMicroarrays[J].PLoSOne,2010,5(9): e12620.

[10]Yao H.,Song J.,Liu C.,et al.Use of ITS2 region as the universal DNA barcode for plants and animals[J].PLoS One,2010,5(10).

[11]肖金花,肖暉,黃大衛.生物分類學的新動向—DNA條形編[J].動物學報,2004,50:852-855.

[12]Hebert P.D.,Gregory T.R.The promise of DNA barcoding for taxonomy[J].Syst Biol,2005,54(5):852-9.

[13]Lakra W.S.,Verma M.S.,Goswami M.,et al.Gopalakrishnan A.,Singh K.V.,Ward R.D.,Hebert P.DNA barcoding Indian marine fishes[J].Mol Ecol Resour,2011,11(1):60-71.

[14]Smith M.A.,Bertrand C.,Crosby K.,et al.Wolbachia and DNA barcoding insects:patterns,potential,and problems[J].PLoS One,2012,7(5):e36514.

[15]Hebert P.D.,Penton E.H.,Burns J.M.,et al.Hallwachs W.Ten species in one:DNA barcoding reveals cryptic species in the neotropical skipper butterfly Astraptes fulgerator[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2004,101(41):14812-7.

[16]徐向明.我國3個地方品種鴨線粒體DNACOI基因的DNA條形碼初步分析[J].畜牧與獸醫,2008,40(11):51-53.

[17]高玉時,屠云潔,童海兵,等.6個地方雞種線粒體COⅠ基因的DNA條形碼研究[J]:第十三次全國家禽學術討論會:2007;中國河南鄭州;2007:391-398.

[18]王潔.我國部分家鴨品種的DNA條形碼初步分析[D].南京：南京農業大學,2009.

[19]屠云潔,陳國宏,高玉時,等.3個地方雞種線粒體DNA COⅠ基因條形碼遺傳多樣性研究 [J].家畜生態學報, 2009,30(01):16-19.

[20]屠云潔,高玉時,陳國宏,等.7個地方雞種的分子評估[J].家禽科學,2008,(09):6-10.

[21]唐修君,高玉時,屠云潔,等.基于線粒體COⅠ基因的2個新發現雞種資源DNA編碼研究[J].中國畜牧獸醫, 2011,38(01):133-136.

[22]薛茂云,高玉時,屠云潔,等.基于線粒體COⅠ基因狼山雞和鹿苑雞DNA條形編碼分析[J].揚州大學學報(農業與生命科學版),2009,30(04):26-29.

[23]虞德兵,李平華,吳望軍,等.基于線粒體Co I基因施甸縣地方雞種DNA條形碼分析[J]:中國畜牧獸醫學會信息技術分會,2013:222-232.

[24]虞德兵,陸應林,徐昊翔,等.基于線粒體C0Ⅰ基因序列分析家鴨系統發育關[J].南京農業大學學報,2011,34(6):109-114.

[25]高玉時,唐修君,屠云潔,等.基于線粒體COⅠ基因15個雞種的DNA編碼研究[J].中國農業科學,2011,44(03):587-594.

（編輯：高真貞）

S813.9

A

1006-799X(2016)21-0026-03

廣西水產畜牧科技推廣應用項目(桂漁牧科201633008)，國家現代農業產業技術體系廣西創新團隊肉雞產業體系（nycytxgxcxtd-04-20）。

鄧繼賢(1979-)，男，廣西桂林人，畜牧師，研究方向為家禽育種及地方畜禽種質資源保護。

韋鳳英(1962-)，女，廣西扶綏人，研究員，研究方向為家禽育種及健康養殖。