家蠶腸道微生物的研究進展

郝志華 朱佳林 黃志君

（華南農業大學動物科學學院，廣東廣州 510642）

家蠶作為我國重要的特種經濟動物，在我國脫貧致富和國家出口創匯中發揮著特殊的作用。但家蠶容易感病和飼料效率低是影響養蠶業發展的主要問題，因此增強家蠶的抗逆性和抗病性，提升葉絲轉化率，提高蠶繭的產量和質量一直是養蠶業努力的方向。近年來，微生態學得到較快的發展，腸道微生物在動物生長發育中所扮演的角色越發引起人們的重視。隨著家蠶等昆蟲的腸道微生物種類和功能的研究不斷深入，發現腸道微生物在昆蟲的營養吸收、抵御病原微生物和促進機體免疫功能等方面都發揮了重要作用。利用腸道益生菌作為飼料添加劑的研究也取得了較大進展，方丹等分離了雞的腸道微生物并發現其中乳酸菌（lactobacillus）有抑制沙門桿菌（Salmonella）的效果，而且可促進雞的生長。將益生菌體外培養制成微生態制劑添加到飼料中，能提高畜禽的免疫能力和消化能力，增產增收。顧金剛等研發了由枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和黑曲霉（Aspergillus niger）組成的復合菌劑，能分別提高豬的日增重和雞的生長速度。家蠶腸道微生物的研究也有了可喜的進展，周洪英等介紹了關于家蠶腸道微生物對增強蠶體體質和提高吐絲量等有良好的效果。除提高蠶繭產量外，以家蠶為模式動物研究腸道微生物的作用機理，對研究鱗翅目昆蟲腸道微生物的功能和農作物害蟲防控方面也將有重要的指導作用。

隨著家蠶基因組計劃的完成和生物技術研究的迅速發展，分子生物學技術的應用為腸道微生物的研究帶來便利，也促進其快速的發展。家蠶腸道微生物的研究也得到不斷的推進，本文就家蠶腸道微生物的類群、腸道微生物的功能和影響腸道微生物生存的因素等方面對其進行綜述，展示家蠶乃至昆蟲的腸道微生物的最新研究進展。

1 家蠶腸道微生物的類群

腸道作為食物消化吸收的器官也提供了腸道微生物生活的環境，食物的消化吸收除了需要腸道分泌的酶外，還需要腸道微生物分泌的酶類，腸道益生菌與動物達成了共生的關系，但除了益生菌外，腸道內還生活了其它寄生菌，所有這些菌構成腸道菌的多樣性。家蠶腸道微生物的類群還隨著蠶期、齡期和品種的不同，呈現出動態變化的多樣性特點。孫雪奇等選取781×7532夏蠶為研究材料，分離并鑒定了該品種蠶腸道內微生物達16個屬，包含葡萄球菌屬（Staphylococcus）、微球菌屬 （Micrococcus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）等好氧及部分兼厭氧菌群。李蒙英等研究發現家蠶腸道中的優勢菌群為葡萄球菌屬（Staphylococcus），其中陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）在家蠶品種蘇5、蘇6的腸道也是除葡萄球菌（Staphylococcus）外的優勢菌群，在抗性較強的另外兩種雜交品種中，優勢菌群則包括了前兩者和蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）。易發平等的關于家蠶腸道好氧微生物菌群的研究中針對蠶品種夏芳的腸道菌群再不同齡期和不同蠶期下的構成成分和優勢菌群的變化進行了研究與分析，研究發現，春蠶的菌群數量要超過秋蠶，秋蠶腸道微生物菌群只有少量的微球菌科菌（Micrococcus）和芽孢桿菌屬菌（Bacillus）等，春蠶則不僅含有微球菌科菌（Micrococcus）和芽孢桿菌屬菌（Bacillus）還有大量的腸桿菌科菌（Enterobacteriaceae）。此外，春蠶在不同齡期中腸道微生物的優勢菌群也表現出的差異，說明蠶體生理變化也影響其體內菌群構成。張劍飛等以K100和E23為實驗材料對其腸道微生物分別分離鑒定，發現微球菌屬（Micrococcus）和芽孢桿菌屬（Bacillus）為優勢菌群，且在不同齡期優勢菌群的數量會發生變化，而所食用的桑葉表面附著的微生物也與其腸道的優勢細菌所對應，說明飼料的微生物組成成分也會影響到腸道的微生物構成。田貞華等通過16s rDNA序列分析的方法來測定了家蠶腸道的14個不同微生物類群，說明了其家蠶腸道中微生物具有極豐富的生物多樣性。

對家蠶腸道微生物的多樣性與構成變化的研究所取得的進展，揭示了家蠶腸道微生物可因為品種、食物、季節和發育階段而變化，家蠶腸道微生物豐富多樣性也為研究家蠶腸道微生物與蠶體的互作提供了新的思路。

2 家蠶腸道微生物的功能

研究和了解家蠶腸道微生物種群及其對蠶體的影響和作用，再優化和改變腸道內的優勢菌群，可達到增強家蠶體質和提高產量的目的。

近年來，對家蠶腸道微生物參與腸道營養消化吸收的酶學基礎與功能進行了深入的研究，并取得了一定的成績。高繪菊等以鎮·珠X春·蕾為實驗材料，從其腸道中分離了30種菌株，其中9種可以分泌蛋白酶，7種可以分泌脂肪酶，7種可以分泌纖維素酶，8種可以分泌淀粉酶。王在貴等從皓月和951等家蠶品種中分離并鑒定了家蠶腸道產蛋白酶菌株，利用16s rDNA分析法結合菌落形態特征觀察判斷之后，與GenBank的基因序列比對，發現其屬于不動桿菌屬（Acinetobacter）。楊文靜利用大造蠶品種分離并通過分子生物學的方法鑒定了2株其腸道內產α-淀粉酶的菌株屬蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）。馮偉利用桑葉和柘葉飼養家蠶后分別分離其腸道中的能產脂肪酶的菌株，發現不同飼料條件下的優勢菌群有較大差異，桑葉飼養的家蠶腸道內含有的產脂肪酶菌群要遠豐富于柘葉飼養的家蠶，桑葉喂食的家蠶腸道中分離出10種優勢菌群，其中屬短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）產酶能力較強。馬如箭從家蠶腸道中篩選出12種產纖維素酶的菌株，并經過鏡檢和18s rRNA序列分析鑒定其為毛霉屬（Mucor）真菌。豐富的菌群通過分泌各種消化酶來幫助家蠶消化食物，促進蛋白質、脂肪、淀粉和纖維素等物質的分解以供給家蠶正常的生長發育的營養需要，成為家蠶消化系統不可缺少的組成部分。

對于腸道微生物在昆蟲抵抗病原菌過程中的作用的研究也有一些新的發現。徐紅星等闡述了昆蟲共生菌的抵御病原菌、抵抗寄生蜂和通過釋放某些物質保護寄主不被捕食，以及通過促進昆蟲體內的免疫系統來增強昆蟲自身對外界病原菌的抵抗。其中關于家蠶的相關研究也早有進行，如魯興萌等從家蠶腸道中分離了4個腸球菌（Enterococcus）菌株，利用其進行家蠶微孢子蟲的發芽抑制實驗，實驗發現腸球菌（Enterococcus）對其發芽有較好的抑制效果。另有研究發現家蠶食下添有微孢子蟲的飼料后其體內的腸球菌數量有明顯的增加，但菌種數和生化表型卻有明顯的下降，說明腸球菌（Enterococcus）與微孢子蟲之間有著較為緊密的聯系，這可能將是今后預防家蠶微粒子病發生的一個潛在途徑。王曉強研究發現，家蠶腸道產脂肪酶的優勢菌株單獨發酵后給家蠶添食，能使得家蠶核型多角體病毒的感染率降低，這也說明了腸道優勢菌株與家蠶的防御功能有著緊密聯系。

此外，郎曉磊研究發現，通過利用添加了一定濃度的抗生素的人工飼料飼喂養家蠶可以得到無微生物的腸道環境，將蘇云金桿菌（Bacillus mucilaginosus）毒素分別對腸道無微生物的和正常的家蠶進行生物測定發現，腸道無微生物的家蠶對毒素的敏感性更高，家蠶腸道微生物對蘇云金芽孢桿菌（Bacillus mucilaginosus）的抑制性的效果。這在相關的農作物蟲害防治上有著很好的借鑒意義。

研究證明家蠶腸道微生物與蠶體免疫防御功能和營養吸收能力都有較為緊密的關系，因此，有效利用家蠶腸道微生物的抑制病原菌與助消化的功能將有望達到提高蠶繭產量的目的，可對蠶業的穩步發展帶來積極影響。

3 家蠶腸道微生物的影響因素

隨著對腸道微生物功能的不斷的深入研究和了解，人們對腸道微生態環境越來越重視，影響腸道微生物穩定的因素也引起了人們的關注。研究人員針對家蠶在不同飼料、添食外原菌，改變環境因素和不同品種等條件下做出了相應的研究。

向蕓慶利用了柘葉和桑葉分別對家蠶進行喂食，在四齡、五齡期從家蠶腸道中分離優勢菌群，柘葉飼養的家蠶腸道中有29株菌株，桑葉飼養的家蠶腸道中有27株菌株，除了兩種飼料飼養的家蠶腸道中共有的4種優勢菌群，喂食桑葉的家蠶還有5種優勢菌群，而喂食柘葉的家蠶卻只有2種。桑葉飼養的家蠶腸道微生物類型要遠比柘葉飼養的豐富。同時，通過將兩種飼料喂食后在腸道內生長的不同的菌混合飼養家蠶，發現會引起家蠶的吐液甚至群體死亡，推測：不同飼料會引起家蠶腸道微生態結構性的變化和產生基于適應性的不同微生態種群。李冠楠等人通過篩選分離出兩株可以同時分泌蛋白質酶、脂肪酶、淀粉酶和纖維素酶的菌株，并鑒定其為芽孢桿菌（Bacillus）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。研究發現枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的產酶能力要強于芽孢桿菌（Bacillus），在對家蠶進行枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）添食之后，發現其會導致芽孢桿菌（Bacillus）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）成為腸道微生物的優勢菌，并在腸道內定植，改變菌群的結構。說明腸道菌之間存在著密切的互作關系。李冠楠在研究氟脅迫對家蠶的影響中發現氟脅迫后家蠶734品種腸道的產酶細菌有明顯減少，優勢菌種發生改變只有產脂肪酶的葡萄球菌屬（Staphylococcus）占比較大，通過高通量測序發現腸道菌群的動態變化和蠶體對氟化物的耐性有相應的關聯。

孫振麗研究BmCPV感染家蠶后其腸道微生物構成的變化情況，發現雖然腸道微生物整體的多樣性有明顯降低，但是腸球菌屬（Enterococcus）和葡萄球菌屬（Staphylococcus）的數量卻有增加，且腸球菌屬的數量與其他優勢菌種數量呈負相關。同時孫振麗還發現家蠶腸道微生物在經過短暫高溫處理后也會發生優勢菌群的更變，而且菌群豐度的變化與其免疫信號通路的重要基因表達量呈現一定的關系，說明短暫高溫處理也會影響到腸道菌群結構。該研究通過比較野桑蠶和家蠶的腸道微生物優勢菌群發現人工馴化影響了腸道微生物與蠶體對環境適應性和攝食性的關系。

杜貝貝利用16s rRNA克隆文庫技術對家蠶腸道微生物測序，發現了高溫處理后，大造品種的家蠶腸道微生物發生了優勢菌群的變化，梭菌屬（Clostridium）和乳球菌屬（Lactococcus） 取代了鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）和銅綠假單胞菌屬（P.aeruginosa）的優勢地位。而且，大造和菁松兩個品種的優勢菌群差別較大，大造的腸道中紅球菌屬（Rhodococcus）和甲基桿菌屬（Methylobacillus）占有優勢，菁松則是梭菌屬（Clostridium）為優勢菌群。

研究表明，腸道微生物的影響因素對于調節家蠶腸道的益生優勢菌群至關重要，可以通過創造各種有利因素來提高家蠶腸道的益生優勢菌群，進而提高家蠶對營養的吸收和增強免疫防御能力，最終提高蠶繭產量。

4 昆蟲腸道微生物研究

昆蟲腸道微生物的研究以等翅目的昆蟲研究較多，近年來逐漸增多了對各類農業害蟲的的腸道微生物研究工作。2014年員超利用16s rRNA高通量測序技術分析白蟻的腸道微生物，選擇性培養基篩選研究菌群，梯度凝膠電泳鑒定菌群的種類，確定了白蟻后腸內可以產出高效分解木聚糖的酶的類芽孢桿菌（Paenibacillus）。戴楠晶研究小菜蛾腸道微生物對蘇云金桿菌（Bacillus mucilaginosus）的殺滅作用的影響，發現通過比較正常腸道微生物和Bt毒蛋白培養的腸道微生物的變化，篩選出兩者中可培養的豐度有明顯差異的菌群，添加到蘇云金桿菌（Bacillus mucilaginosus）處理后的小菜蛾，其中普城沙雷菌（Serratia plymuthica）和泛菌屬（Pantoea）細菌的濃度越高，Bt對小菜蛾的殺滅效果越差。徐陽研究不同發育階段的日本弓背蟻的腸道微生物變化發現Blochmannia在各個發育階段的腸道中都有出現，在卵、蛹、大工蟻、雄蟻和蟻后的腸道中居優勢菌群地位，小工蟻和幼蟲也有各自的優勢菌群，結果表明大工蟻較其他發育階段的腸道微生物種類更加多樣化，日本弓背蟻的腸道微生物菌群種類和優勢菌群也隨著發育階段變化而變化。Engel等發現諸如白蟻、螞蟻和蜜蜂之類的社會性昆蟲因為其社會互動的特性，較之其他昆蟲腸道微生物，其腸道微生物中出現了一些特有并一致的菌群提供專門的營養和保護功能。Brune等也發現了白蟻的社會集群聚集的特性導致了其腸道微生物的進化與蟑螂的有所不同，較之蟑螂的腸道微生物受環境的選擇影響，白蟻的社會性聚集的特性影響腸道與菌群的共同進化。

關于除家蠶外的其他昆蟲的腸道微生物的研究中，針對昆蟲特點利用了不同的研究方法和策略，這對家蠶的腸道微生物的研究將有著很好的參考借鑒意義。

5 展望

昆蟲腸道微生物的研究目前仍然處于不斷推進的階段，對于微生物與宿主之間更復雜的關系尚不清楚，更深一層的微生物對宿主的功能更有待研究。一方面是由于腸道微生物涉及方面較多，多樣性的微生物種群結構和多種功能存在極大的復雜性；另一方面從近年來的研究方法可以看出，隨著生物技術的不斷發展，腸道微生物的研究技術也從單一的形態觀察鑒定發展到了分子生物學鑒定，包括諸如16S rRNA的分子檢測技術、高通量測序技術、基因芯片等，相信隨著技術的不斷發展，腸道微生物的研究也會更深入。

這些相關的研究不僅在理論上解釋某些生物現象，并在實踐領域具有廣闊的應用價值。如，以腸道微生物與宿主的共同進化為模型，研究選擇性的環境下的生物進化規律。又譬如通過研發微生態制劑，改變家蠶腸道的優勢菌群，使得中腸對飼料的吸收更充分，提高葉絲轉化率，降低蠶業生產中的勞動成本，提高養蠶的整體經濟效益。也可以通過農藥與昆蟲腸道微生物的特定互作引起的致死作用方面來研究有害昆蟲的防控。

現階段，昆蟲腸道微生物的研究已取得了一定的成績，相信隨著研究的不斷深入的研究，腸道微生物一定會在不久的將來大放異彩。

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