10種藥物材料對銅綠微囊藻的抑制作用*

胡利靜 肖艷翼 劉騰飛 吳映捷 胡 鯤 楊先樂

(上海海洋大學水產與生命學院，國家水生動物病原庫，上海 201306)

藍藻(Cyanophyta)是單細胞原核生物，又叫藍細菌、藍綠菌或藍綠藻，是一類藻類的總稱，主要指色球藻目(Chroococcales)、顫藻目(Oscillatoriales)、念珠藻目(Nostocales)、真枝藻目(Stigonema)4個目，可在營養豐富的淡水水體中出現。藍藻中有些種類常于夏季高溫時大量繁殖，并在水面形成一層藍綠色且有腥臭味的浮沫，稱為“水華”。藍藻水華的種類有很多，主要有微囊藻(Microcystis)、魚腥藻(Anabaena)、鞘顫藻(Lyngbya)、束絲藻(Aphanizomenon)、顫藻(Oscillatoria)[1]，其中以產毒的銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)最為常見。銅綠微囊藻大量繁殖時，水面會被厚厚的藍綠色湖靛所覆蓋，改變了水體的理化環境，降低了水體的透明度[2]，影響魚蝦等水生動物的正常生長；水體中營養物質被耗盡時，銅綠微囊藻開始大量死亡，藻細胞破解，使水體散發腥臭味，溶解氧減少，造成魚蝦等水生動物的死亡，所以池塘養殖水體中過量的銅綠微囊藻威脅著水產養殖業的健康發展，因此研發綠色環保的抑藻藥物勢在必行。

目前水產養殖中藍藻的除殺多采用人工或機械打撈、化學藥物殺藻等方法。人工或機械打撈的方法雖見效快，但勞動強度大、操作困難、耗時、效率低而且費用高，因此實際生產中以化學藥物抑藻方法為主。水產養殖中常用的化學抑藻藥物為硫酸銅，但硫酸銅的大量使用和使用次數的增加常會使重金屬在養殖水域中積累，引發二次污染，并影響水生生物生長等。因此，尋求經濟、安全、環保、有效的抑藻藥物，對水產養殖業的健康發展具有重要的意義。本研究從藥食兩用的植物及常見的中草藥中選擇了10種藥物材料，對銅綠微囊藻進行抑制效果篩選試驗，并對初篩藥物的有效劑量進行測定，以期為開發綠色環保的抑藻藥物提供一定的技術指導。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 供試藻種

銅綠微囊藻藻種購買于中國科學院野生生物種質庫——淡水藻種庫，編號為FACHB-434。

1.1.2 抑藻材料

蜜桔、馬水桔、蜜柚、大蒜從市場上購得；鐵觀音、大麥茶購于商店；仙鶴草、大黃、土槿皮提取物、黃連提取物等購于藥店。

1.1.3 主要儀器

MGC-250BPY-2智能型光照培養箱；DU730分光光度計(美國Beckman)；Allegra X-15R低速冷凍離心機(美國Beckman)。

1.2 培養基組分及培養條件

銅綠微囊藻的培養按淡水藻種庫提供配方，采用BG11培養基培養。培養條件為：溫度(25.0±0.5) ℃，光照強度3 000 lx，光暗比12 h∶12 h，每天搖動3～5次。

1.3 浸提液制備方法

蜜桔皮、馬水桔皮、蜜柚皮水提液的制備參考文獻[3]的提取方法，自來水沖洗柑橘皮表面灰塵，將柑橘皮切成小塊，在烘箱中干燥。以桔皮(干質量，下同)/去離子水為0.05 kg/L的比例，用去離子水在4 ℃黑暗中浸提4 d。

大蒜液制備：稱取100 g去皮大蒜，加入100 mL去離子水，攪拌成糜狀后擠壓得汁液，置于磨口試劑瓶中，室溫保存，大蒜質量濃度為1 kg/L。

鐵觀音、大麥茶浸提液制備：稱取鐵觀音、大麥茶2 g，加去離子水20 mL，煮沸10 min，重復一次，合并兩次茶液并用去離子水定容至20 mL，使茶液的最終質量濃度為100 g/L作為試驗原液，4 ℃保存備用。

仙鶴草、大黃浸提液制備參考文獻[4]的提取方法，按藥物/蒸餾水為0.10 kg/L的比例分別將兩種藥物加入盛一定量蒸餾水的燒杯中，置于電爐上煮沸浸提，煮沸20 min后濾出藥液，定容，使藥液質量濃度為100 g/L作為試驗原液，4 ℃保存備用。

土槿皮提取物、黃連提取物浸提液制備:按藥物/蒸餾水為0.05 kg/L的比例分別將兩種藥物加入盛一定量蒸餾水的燒杯中，煮沸10 min后過濾，定容，使藥液質量濃度為50 g/L作為試驗原液，4 ℃保存備用。

1.4 試驗方法

1.4.1 篩選試驗

將銅綠微囊藻在BG11培養基下預培養10～15 d，使其處于對數生長期，作為接種的藻種。在無菌條件下，在250 mL的錐形瓶中各加入20 mL藻液，初始葉綠素a為0.340 6 μg/mL，并分別加入一定量的浸提液，最后加入無菌培養基，使培養液總體積為100 mL。最終使蜜桔皮、馬水桔皮、蜜柚皮水提液質量濃度均為6.25 g/L，大蒜液和鐵觀音、大麥茶、仙鶴草、大黃浸提液的質量濃度均為5.000 g/L，土槿皮提取物、黃連提取物浸提液的質量濃度均為2.500 g/L。每組3個平行，并設空白對照組。

1.4.2 有效藥物最佳抑藻濃度確定

根據篩選結果，采用二倍稀釋法將有效藥物的母液依次倍數稀釋，查看抑藻效果，確定藥物的最佳抑藻濃度。每組3個平行，并設空白對照組。

1.4.3 測定指標

由于活體藻類中葉綠素a的含量較高，而在死亡藻體、浮游動物及其他無機漂浮物中葉綠素a的含量較低，因此把葉綠素a含量的測定作為測量藻類生物量的重要指標[5]。

葉綠素a測定：參考文獻[6]的測定方法，即取3 mL培養液，3 500 r/min下離心10 min，棄去上清液，然后加入等體積90%的(體積分數)甲醇，混合均勻。將混勻的溶液放置在4 ℃黑暗條件下萃取6～8 h，然后3 500 r/min下再離心10 min，取上清液，用分光光度計測定其在665 nm處的吸光度(OD665)，并計算葉綠素a的含量，計算公式[7]為：

c=13.9×OD665

(1)

式中：c為葉綠素a質量濃度，μg/mL。

表1 10種材料對銅綠微囊藻生長的抑制率1)

注：1)相同字母的數據間沒有顯著差異,不同字母的數據間差異顯著。

1.5 數據分析

各浸提液對銅綠微囊藻生長的抑制率計算公式為：

IR=(1-N/N0)×100%

(2)

式中：IR為抑制率，%；N為浸提液組藻的葉綠素a質量濃度，μg/mL；N0為對照組藻的葉綠素a質量濃度，μg/mL。

所得數據用Excel 2003和IBM SPSS Statistics 19.0軟件程序包進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 10種材料對銅綠微囊藻生長抑制率的影響

10種材料對銅綠微囊藻生長抑制率的影響如表1所示。經統計分析可知，從1 d時的抑制率來看，蜜桔皮、蜜柚皮、馬水桔皮對銅綠微囊藻生長的抑制率較大；大黃、土槿皮提取物、黃連提取物對銅綠微囊藻的抑制率次之，且3者之間無顯著差異；大蒜、大麥茶對銅綠微囊藻的抑制率最低。從2 d的抑制率來看，3種柑橘皮對銅綠微囊藻的抑制率依然較高，且明顯高于其他7種材料對銅綠微囊藻的抑制率；大黃、土槿皮提取物、黃連提取物對銅綠微囊藻的抑制率次之；仙鶴草、大蒜、大麥茶對銅綠微囊藻的抑制率較低。從3～5 d的抑制情況看，大蒜對銅綠微囊藻的抑制率上升較快；仙鶴草、大麥茶對其的抑制率仍保持較低水平；其他材料抑藻率較大，且不同的材料間有不同的差異性。

2.2 10種材料對銅綠微囊藻葉綠素a含量的影響

10種材料在不同時間內對銅綠微囊藻葉綠素a質量濃度的影響如圖1所示。銅綠微囊藻各處理組作用的時間對葉綠素a含量的回歸方程如表2所示，其中y為銅綠微囊藻的葉綠素a質量濃度，μg/mL；x為各處理組作用的時間，d。從圖1及表2可以看出，蜜桔皮、馬水桔皮、蜜柚皮、土槿皮提取物、黃連提取物浸提液組中銅綠微囊藻的葉綠素a含量隨著時間延長呈下降趨勢，各組間下降的幅度略有不同，馬水桔皮>蜜桔皮>蜜柚皮>黃連提取物>土槿皮提取物。大蒜、鐵觀音、大麥茶、仙鶴草、大黃的浸提液組及對照組中銅綠微囊藻的葉綠素a含量隨著時間延長呈上升趨勢，大蒜、鐵觀音、大黃的浸提液組上升幅度明顯小于仙鶴草和大麥茶，且這些浸提液組中葉綠素a含量的上升幅度均低于對照組的上升幅度，但仙鶴草和大麥茶浸提液組葉綠素a含量的上升幅度與對照組相差不大。

表2 銅綠微囊藻各處理組作用的時間對葉綠素a含量的回歸方程

2.3 有效材料抑藻最佳濃度的確定

各質量濃度蜜桔皮水提液對銅綠微囊藻葉綠素a的作用效果如圖2所示，其中0.39、0.78 g/L濃度組與對照組中銅綠微囊藻葉綠素a變化相似；1.56 g/L濃度組的銅綠微囊藻葉綠素a的合成呈上升趨勢，但與對照組相比上升幅度降低，說明該濃度組對銅綠微囊藻葉綠素a的合成具有一定的抑制能力；3.13 g/L濃度組使銅綠微囊藻的葉綠素a基本維持在初始值(0.340 6 μg/mL)狀態；而6.25、12.50、25.00 g/L濃度組能明顯抑制銅綠微囊藻葉綠素a的合成。

圖1 10種材料對銅綠微囊藻葉綠素a質量濃度的影響Fig.1 Effect of 10 kinds material on growth of M. aeruginosa

圖2 蜜桔皮對銅綠微囊藻生長的影響Fig.2 Effect of Tangerine peel on growth of M. aeruginosa

如圖3所示，馬水桔皮水提液質量濃度為1.56 g/L時銅綠微囊藻的葉綠素a能基本維持在初始值狀態，當小于1.56 g/L時對銅綠微囊藻葉綠素a的合成抑制率減弱甚至促進其合成，當大于1.56 g/L時能抑制銅綠微囊藻葉綠素a的合成。

如圖4所示，蜜柚皮水提液0.78、1.56 g/L濃度組的葉綠素a與初始值相比略有增長，而3.13 g/L濃度組與初始值相比略有下降，0.39 g/L濃度組的葉綠素a反而超過了對照組的葉綠素a含量，而大于3.13 g/L的各濃度組均對銅綠微囊藻的葉綠素a合成具有抑制作用。

圖3 馬水桔皮對銅綠微囊藻生長影響Fig.3 Effect of Mashui orange peel on growth of M. aeruginosa

圖4 蜜柚皮對銅綠微囊藻生長的影響Fig.4 Effect of Pomelo peel on growth of M. aeruginosa

大蒜液對銅綠微囊藻葉綠素a質量濃度的影響如圖5所示。0.313 g/L濃度組對其葉綠素a的合成無抑制作用，其他各濃度組隨著時間的延長葉綠素a含量總體呈增長趨勢，但在同一個時間點其葉綠素a均低于對照組，且隨著大蒜液濃度的增大葉綠素a含量的增長幅度降低。當其大于5.000 g/L時，葉綠素a含量基本維持在初始水平。

圖5 大蒜對銅綠微囊藻生長的影響Fig.5 Effect of Allium sativum on growth of M. aeruginosa

圖6、圖7分別為鐵觀音、大黃浸提液對銅綠微囊藻生長影響趨勢圖。在2.500 g/L時兩種材料均使銅綠微囊藻的葉綠素a維持在初始值附近；當大于2.500 g/L時兩種材料均能有效抑制銅綠微囊藻葉綠素a的合成，且大黃的抑制效果好于鐵觀音；當小于2.500 g/L時，除大黃1.250 g/L濃度組外其他濃度組中的葉綠素a含量與對照組的接近且均呈增長趨勢；大黃1.250 g/L濃度組葉綠素a含量雖有增長趨勢，但明顯低于對照組。

圖6 鐵觀音對銅綠微囊藻生長的影響Fig.6 Effect of Tieguanyin tea on growth of M. aeruginosa

圖7 大黃對銅綠微囊藻生長的影響 Fig.7 Effect of Radix et Rhizoma Rhei on growth of M. aeruginosa

如圖8、圖9所示，土槿皮、黃連提取物浸提液對銅綠微囊藻葉綠素a含量的影響相似。當大于2.500 g/L時，兩種材料各濃度組中的葉綠素a均呈下降趨勢，且濃度越大其下降幅度越大；當小于2.500 g/L時，兩種材料各濃度組中的葉綠素a均呈上升趨勢，且隨著濃度降低其上升幅度增加，但各濃度組上升幅度均低于對照組。

圖8 土槿皮提取物對銅綠微囊藻生長的影響Fig.8 Effect of Cortex Pseudolaricis on growth of M. aeruginosa

圖9 黃連提取物對銅綠微囊藻生長的影響Fig.9 Effect of Rhizoma Coptidis on growth of M. aeruginosa

3 討 論

目前，防治淡水水華的發生不僅是環境領域的熱點[8]，也是淡水水產養殖業關注的焦點。隨著抑藻技術的發展，國內外研究者研究溶藻菌[9-11]、水生植物[12-13]、陸生植物[14-16]等抑藻技術，尤其是植物化感作用因其具有經濟、高效、綠色環保的特點，備受國內外學者親睞[17-18]。目前研究報道的具有抑藻作用的水生植物有很多種[19-22]，但利用水生植物直接抑制銅綠微囊藻的作用效果并不理想，可能因水生植物長期生長并適應了該特定的環境從而不再產生對銅綠微囊藻的生長具有抑制作用的代謝產物[23]，也可能是其代謝產物長期在特定環境中抑藻效果逐漸消亡。目前，關于藥物材料對銅綠微囊藻控制的研究，主要集中在個別藥物材料的研究[24]。如潘琦等[25]研究美人蕉種植水對銅綠微囊藻的抑制效應時發現，以蒸餾水培養3 d收集獲得的美人蕉種植水對銅綠微囊藻的生長有明顯的抑制作用，且推斷美人蕉自身代謝產生的化感物質可有效抑制銅綠微囊藻的正常生長。李娟等[26]發現，50 mg/L的H2O2能有效抑制銅綠微囊藻的生長，且對藻細胞的生理指標等有很強的損傷效應。汪小雄等[27]發現，浸泡5 d的荔枝落葉能抑制銅綠微囊藻的生長，且隨著時間延長，抑制效應下降。而對于藥物材料篩選方面的研究報道卻較少[28]。因此，本試驗選擇了10種陸生藥物材料，用其浸提液進行了對銅綠微囊藻生長抑制的研究，發現不同的藥物材料浸提液對銅綠微囊藻生長表現出不同的抑制效果。具有較強抑藻作用的有蜜桔皮、馬水桔皮、蜜柚皮、大黃、土槿皮、黃連，且2～5 d均可保持一定的抑藻率，說明這幾種材料均有持久抑藻的作用效果；其次是鐵觀音、大蒜；而大麥茶和仙鶴草在試驗期間其抑制率一直小于30%，可認為這兩種材料對銅綠微囊藻生長的影響作用不明顯。另外，大蒜、大黃在前期抑制率較低，隨著時間延長其抑制率增幅較大，可能是由于浸提液中的有效成分需要一定的活化時間后才能發揮抑藻效果；蜜桔等柑橘皮含有豐富的生物活性物質[29]，具有抗菌、抗病毒等作用[30]。柑橘、大蒜、鐵觀音都是人們常用的食物及飲品，較之土槿皮、黃連更加方便易得，綜上而言這幾種材料有望作為抑藻劑的制備材料。

為了進一步了解有效抑藻材料的最佳抑藻濃度，本試驗采用二倍稀釋的方法對銅綠微囊藻進行抑制試驗。柑橘皮類水提液對銅綠微囊藻有低促高抑的作用效果，這與梁宇斌等[31]的研究結果類似,臍橙皮提取液有低促高抑的作用效果，在質量濃度為1.66 g/L時對銅綠微囊藻的生長有促進作用，而在3.31、6.62 g/L時對其具有明顯的抑制作用。本試驗得到的具體結果與之略有不同，可能是由于柑橘種類不同或所產地區不同所致。不同種類的中草藥材料對藻的影響可能起抑制作用，也可能起促進作用。劉東超等[32]研究了馬齒覓、桔梗、花粉等對亞心形扁藻生長的影響，表明其對亞心形扁藻有一定的促進作用，且作用的最佳質量分數分別為1.50%、0.75%和1.00%。周銀環等[33]研究了3種中草藥對綠色巴夫藻生長及葉綠素a含量的影響，結果表明添加一定量的當歸、桔梗能提高綠色巴夫藻的生長及葉綠素a含量。當歸、桔梗屬于營養性的藥物材料，仙鶴草也屬于該類材料，本試驗中雖然并未出現促進銅綠微囊藻生長的作用效果，但其抑藻效果并不明顯。土槿皮等具有殺菌、抗病毒的作用，本試驗中其對銅綠微囊藻的生長具有抑制作用效果。因此，選擇合適的抑藻材料對抑藻機制的研究及抑藻劑的研制非常重要。

4 結 論

(1) 從10種材料中篩選出8種有效抑制銅綠微囊藻生長的材料：大黃、黃連、土槿皮、蜜桔皮、馬水桔皮、蜜柚皮、鐵觀音、大蒜，且抑藻的作用效果能夠持久。而大麥茶、仙鶴草不能有效抑制銅綠微囊藻的生長。

(2) 蜜桔皮等柑橘皮類水提液在低濃度時促進銅綠微囊藻的生長，具有低促高抑的作用效果。而黃連、土槿皮等藥物材料在低濃度時抑制作用較弱。

(3) 由于本試驗中的藥物材料浸提液本身具有顏色，考慮到應用時對水質環境的影響，各材料抑藻質量濃度如下：蜜桔皮、蜜柚皮水提液為6.25 g/L；馬水桔皮水提液為3.13 g/L；鐵觀音、大黃浸提液及大蒜液為5.000 g/L；土槿皮、黃連提取物浸提液為2.500 g/L。參考文獻:

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