當歸多糖的提取、分離及純化

張清勇　于宏　王慶奎　孫學亮　邢克智　郭永軍

摘 要：對當歸多糖的提取方法進行了優化，并測定了當歸多糖得率及當歸多糖中蛋白質、總糖和還原糖的含量。結果表明先用乙醇進行處理可以改變當歸多糖的的獲得率，乙醇滲漏方法的當歸粗多糖獲得率最高。

關鍵詞：當歸多糖；總糖；還原糖

當歸為傘形科（Umbrelliferae）植物當歸（Angelica sinensis（Oliv）Diels）的根，藥性甘、辛、溫，有活血、補血、潤腸滑腸、調經止痛的功效，對于臨床應用使用的頻率很高，素有“十方九歸”的美稱[1]。隨著現代分離技術和儀器的進步，當歸的多種成分被分離出來，當歸多糖是從植物當歸原料中提取的水溶性多糖，是當歸的主要活性成分之一[2-3]。

目前當歸多糖的提取、分離及純化方法主要是傳統的水提醇沉后脫蛋白[4]。但影響水提醇沉的因素有很多，比如水提時間、溫度、料液比以及水提次數等[5]。傳統方法先將中草藥當歸加水煮沸，離心，上清液濃縮后加入一定體積的乙醇，靜置過夜，得到當歸多糖粗制品。粗制品加一定量的去離子水溶解，用不同的方法去除蛋白質后，透析、冷凍干燥后得到初步純化的當歸多糖[6-7]。但得到的當歸多糖得率并不高，并且費時費力。本試驗擬比較3種植物多糖的提取方法，尋找當歸多糖的最佳提取方法，為當歸多糖的后續研究提供前期基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

中草藥當歸購于本地中草藥市場，產地甘肅。

1.2 試劑與儀器

5%苯酚溶液：精確稱取2.449 6 g苯酚置于50 mL燒杯中，加入蒸餾水，玻璃棒攪拌使其充分溶解，然后置于50 mL容量瓶中定容。定容后裝入棕色玻璃瓶，以防苯酚溶液被氧化。

透析袋MW：8 000～14 400，BioSharp，USA。透析袋前處理：透析袋剪成適當的長度，將透析袋在含1 mmol/L EDTA 和2% 碳酸氫鈉（NaHCO3）的溶液中煮沸10 min，用蒸餾水清洗干凈，置于20%乙醇溶液中4 ℃冷藏備用。

1.3 試驗內容

1.3.1 當歸粗多糖的分離提取

提取方法Ⅰ：將自然風干后的新鮮當歸，直接用蒸餾水煮沸30 min，料液比為1∶30，最后得到的提取液用無水乙醇進行醇沉，乙醇終濃度至80%，攪拌均勻后，4 ℃冷藏靜置6 h后離心（4 000 r/min，10 min）。沉淀用95%乙醇去除色素，直到上清無色為止，沉淀冷凍干燥后即為當歸粗多糖（Crude angelica sinensis polysaccharide，CASP）。

提取方法Ⅱ：將新鮮當歸自然風干并處理成小片，用體積分數為75%的乙醇溶液浸泡一周，料液比為1∶10，浸泡并不時攪動。醇提后殘渣先用水煮沸30 min，料液比為1∶30，上清液中加入無水乙醇使乙醇終濃度至80%，攪拌均勻后4 ℃冷藏靜置6 h后離心（4 000 r/min，10 min）。將沉淀反復用95%的乙醇脫色，直到上清液無色，沉淀冷凍干燥后即為CASP。

提取方法Ⅲ：將自然風干后的新鮮當歸處理成小塊狀，用78%的乙醇浸泡一周，料液比為1∶10，要經常攪拌，浸泡好后用76%的乙醇進行滲漉，直到滲出液無色為止，將滲漉后的當歸用蒸餾水煮沸30 min，料液比為1∶30，水煮后得到的提取液加入無水乙醇使乙醇終濃度至80%，攪拌，4 ℃冷藏靜置后離心（4 000 r/min，10 min）。將沉淀反復用95%的乙醇脫色，直到上清液無色，沉淀冷凍干燥后即為CASP。

1.3.2 CASP的脫蛋白處理 當歸粗多糖加三蒸水溶解（濃度為2 mg/mL），采用Sevag法脫蛋白[8]：當歸多糖粗提物溶液中按體積比為3∶1加入Sevag試劑，放在磁力攪拌器上攪拌45 min后離心（4 000 r/min，10 min）。離心后溶液分為三層，上層為多糖溶液，中層為蛋白質凝膠層，底層為有機溶劑。取上層多糖溶液重復上述步驟，直到蛋白質凝膠層消失。多糖溶液在280 nm波長附近無特征吸收峰，說明多糖中的蛋白質已經去除。

1.3.3 透析 將脫蛋白后的多糖溶液移到處理好的透析袋中，放入三蒸水中透析3～4 d。透析過程中，要注意勤換水。透析好的多糖溶液經旋轉蒸發儀濃縮后冷凍干燥得到當歸多糖（Angelica sinensis polysaccharide，ASP）。

1.3.4 CASP和ASP蛋白質、總糖和還原糖含量測定 采用考馬斯亮藍染色法測定蛋白質含量。精密稱取100 mg考馬斯亮藍G-250，溶于50 mL 95%乙醇中，加入100 mL 85%磷酸，最后用蒸餾水定容至1 000 mL。放于棕色瓶中備用。精確稱取牛血清白蛋白10 mg，用蒸餾水溶解并定容至100 mL，配成0.l mg/mL的標準蛋白質溶液。精密吸取蛋白質標準溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、和l mL，分別置于10 mL比色管中，然后加入配制好的考馬斯亮藍G-250溶液5.0 mL溶液，各管用蒸餾水加至6.0 mL，搖勻后放置2 min，用紫外分光光度計在波長595 nm處測定吸光度，將上述數據進行線性回歸，得標準曲線方程：y=0.006 x+0.014，相關系數為0.999，線性良好。精密稱取10 mg多糖樣品，用蒸餾水溶解并定容至10 mL，精密吸取1.0 mL多糖樣品溶液，加入考馬斯亮藍溶液5.0 mL，振蕩搖勻，靜置2 min后，在595 nm處測定其吸光度，從標準曲線上查得蛋白的濃度。

采用苯酚-硫酸法測定總糖含量。用分析天平精密稱取葡萄糖（105 ℃下干燥至恒重）100 mg，置于燒杯中用蒸餾水溶解后，置于1 000 mL容量瓶中定容，搖勻，配得葡萄糖標準溶液。精密吸取葡萄糖標準溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和l mL，分別置于10 mL比色管中，然后加入5%的重蒸酚1.0 mL溶液，搖勻，加入濃硫酸5.0 mL，加蒸餾水至刻度，搖勻后放置5 min，再于沸水浴中加熱15 min，取出冷卻至室溫。另以蒸餾水20 mL加5%的重蒸酚和硫酸，同上做空白對照，用紫外分光光度計在波長490 nm處測定吸光度，將上述數據進行線性回歸，得標準曲線方程：y=0.007 x+0.089，相關系數為0.999，濃度范圍在0～0.l mg/mL，線性良好。精密稱取多糖樣品20 mg，用蒸餾水溶解并定容至1 000 mL，精密吸取多糖樣品溶液0.2 mL，按上述方法測定吸光度，從標準曲線中求出樣品中總糖的含量。

用蒽酮-硫酸法測定還原糖活力。用分析天平精密稱取葡萄糖（105 ℃下干燥至恒重）100 mg，置于燒杯中用蒸餾水溶解后，置于1 000 mL容量瓶中定容，搖勻，配得葡萄糖標準溶液。精密吸取葡萄糖標準溶液0.0、0.2、0.4、0.8、1.2、和l.6 mL，分別置于10 mL比色管中，然后加入005%的蒽酮-硫酸溶液4.0 mL，混勻，立即用冰水冷卻，再于沸水浴中加熱5 min，取出在冰水中冷卻30 min。將上述數據進行線性回歸，得標準曲線方程：y=0.054 x+0.288，相關系數為0999，線性良好。精密稱取多糖樣品20 mg，用蒸餾水溶解并定容至1 000 mL，精密吸取多糖樣品溶液0.2 mL，按上述方法測定吸光度，從標準曲線中求出樣品中還原糖的含量。

1.4 數據處理

所得數據（平均值±標準誤表示，n=3）用Excel 2003和SPSS 18.0處理，做單因素方差分析，顯著水平為p<0.05。

2 結果

2.1 CASP得率

CASP得率的結果見表1。結果表明：第III種提取方法的CASP得率顯著高于其它提取方法。

2.2 蛋白質、總糖和還原糖含量

將分離到的CASP和ASP配成一定濃度的溶液，測定其蛋白質、總糖和還原糖含量，由標準曲線計算結果見表2。

3 討論

目前當歸多糖的提取方法主要是傳統的水提醇沉工藝、超聲波萃取和微波萃取法等[4]。本試驗采用水提醇沉的方法提取當歸粗多糖，影響水提醇沉的方法效果有很多因素，比如水提時間、溫度、料液比以及水提次數等[5]。楊婧等[9]通過正交試驗得出了水提法得到當歸多糖的最佳條件：水提時間為30 min、溫度為100 ℃、料液比為1∶20、提取2次。但是水提醇沉的方法本身也有很多缺點，反復高溫可能破壞多糖結構，乙醇的濃度也會影響當歸多糖的提取率。因為當歸中含有大量脂溶性物質，所以本試驗先用乙醇去除一部分脂溶性物質[10]。本試驗采用Sevag法脫蛋白，王慶奎等[7]通過試驗得出了sevag法脫除當歸多糖蛋白的最佳條件。本試驗結果表明，先用乙醇進行處理可以改變當歸粗多糖的獲得率，乙醇滲漉方法的當歸粗多糖的獲得率最高。

參考文獻：

[1]劉俊棟，劉海霞，李建基，等.當歸多糖對免疫系統作用的研究[J].四川畜牧獸醫，2005（3）：34-35

[2] 徐國鈞，何宏賢，徐珞珊，等.中國藥材學[M].北京：中國醫藥科技出版社，1996：332-338

[3] 鄧永健，郭志偉，王萌.當歸的化學成份及其藥理作用研究進展[J].新疆中藥，2006，24（5）：109-113

[4] 劉雪平.當歸有效成分分離純化工藝的研究進展[J].內蒙古中醫藥，2011（13）：93-95

[5] 韋瑋，龔蘇曉，張鐵軍.當歸多糖的提取純化工藝研究[J].中草藥，2009（S1）：137-139

[6] 孫元琳，楊萍芳，吳海霞，等.水法提取當歸多糖工藝條件優化[J].中國食品學報，2009（05）： 130-134

[7] 劉 娟，彭仁王秀，樂江，等.當歸多糖的分離純化及其部分理化性質的研究[J].華西藥學雜志，2004，19（6）：412-414

[8] 王慶奎，邢克智，趙海運，等.當歸多糖除蛋白質的方法與條件優化[J].時珍國醫國藥，2011（2）：10-12

[9] 楊婧，李琴，林河春，等.當歸多糖水提法正交設計及最佳Savags法去蛋白工藝[J].安徽農業科學，2009（24）：11532-11533+11536

[10] 趙迪加，張水寒，王宇紅，等.婦炎寧中當歸滲漉法提取工藝的研究及其與雙提法樣品的鎮痛作用比較[J].中成藥，2007（9）：1360-1362

Abstract：The sinensis polysaccharide yield was optimize and measured angelica sinensis polysaccharide content of protein， total sugar and reducing sugar .Results showed that the use of ethanol first processing can change the gain rate of angelica sinensis polysaccharide， ethanol sinelica angelica polysaccharide to obtain the highest rate of leakage method.

Key words：Angelica sinensis polysaccharide；；total sugar；reducing sugar

（收稿日期：2015-12-11）