4R22修飾的紫杉醇脂質體對肺癌細胞多藥耐藥的逆轉作用

周毅　王赫　朱麗娜

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4R22修飾的紫杉醇脂質體對肺癌細胞多藥耐藥的逆轉作用

周毅1王赫2★朱麗娜1

［摘要］目的探索4R22修飾的紫杉醇脂質體逆轉肺癌細胞（耐順鉑阿霉素細胞株A549／Adr）多藥耐藥的能力。方法薄膜分散法制備4R22修飾的紫杉醇脂質體（4R22-liposome-paclitaxel，4R22-LP-PTX）；通過馬爾文粒徑、電位儀測試脂質體的物理性能，通過流式細胞儀檢測4R22-LP-PTX在普通A549和耐藥的A549／Adr細胞中誘導凋亡的能力和轉染能力；通過MTT法測試4R22-LP-PTX 對A549／Adr細胞的抑制率；通過流式細胞儀定量觀察4R22-LP-PTX轉入細胞中的熒光量。結果成功構建4R22-LP-PTX，平均粒徑為106．5 nm，電位為3．12 mv，PDI為0．22，包封率85%。4R22-LPPTX能顯著性的逆轉耐藥，有效的誘導A549／Adr細胞的凋亡，有效誘導A549／Adr細胞的增殖的抑制和有效的轉染進入細胞表達，P＜0．05。結論成功構建的4R22-LP-PTX具有逆轉人肺癌細胞A549／Adr耐藥性的能力。

［關鍵詞］4R22；紫杉醇脂質體；耐藥肺癌細胞

作者單位：1．廣州醫科大學藥學院，廣東，廣州511436

2．廣州醫科大學附屬第二醫院腫瘤科，廣東，廣州510250

化療是肺癌的主要治療手段之一，而多藥耐藥是導致肺癌化療失敗的主要原因［1－2］。大量文獻已經報道腫瘤靶向給藥系統能逆轉耐藥性從而誘導耐藥細胞的凋亡［3］。腫瘤靶向給藥系統是指借助載體、配體或抗體將藥物選擇性地濃集定位于靶組織、靶器官、靶細胞或細胞內結構的給藥系統［2］。其中靶頭修飾的納米粒或者膠束能有效的逆轉多藥耐藥性［4］，目前靶頭主要集中在抗體或者多肽方面，與前者相比，小分子短肽有著體積小、易滲入組織和免疫原性小等優點。前期文獻報道4R22是經過噬菌體庫篩選后特異性的靶向非小細胞肺癌的小分子短肽，它具有和藥物傳遞系統靶向肺癌的靶頭功能［5］，但其是否能有效逆轉多藥耐藥尚未定論。因此本研究以脂質體為載體，制備了4R22修飾的紫杉醇脂質體（4R22-liposome- paclitaxel，4R22-LP-PTX），檢測其逆轉多藥耐藥的作用。

1　材料與方法

1．1材料與儀器

Sizer Nano ZS 90型激光粒度儀及ZETA電位分析儀（英國Malvern instruments Ltd）。大豆磷脂（上海太偉藥業有限公司）；膽固醇（美國sigma公司）；DSPE-PEG 2000和DSPE-PEG 3500（美國A-vanti polar lipids）；香豆素-6（coumarin-6，coumarin，美國sigma公司）；DMEM高糖培養基和胎牛血清（美國GIBCO公司）；其余試劑為分析純。人肺癌細胞A 549和順鉑（CDDP）誘導耐受的A549／Adr由本實驗室提供。4R22（CSNIDARAC）由invitro公司合成。

1．2方法

1．2．14R22-LP-PTX的制備及其表征

參照文獻方法［6－7］合成磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇3500-4R22（DSPE-PEG 3500-4R22）。使用薄膜分散法制備4R22修飾脂質體。將處方量的紫杉醇，SPC，Cho，DSPE-PEG 3500-4R22，DSPE-PEG 2000，DSPE-PEG-OMe（保證總磷脂∶膽固醇＝73∶27（摩爾比），分別溶于氯仿，置50 mL茄形瓶中旋轉蒸發成膜后，再置真空干燥器中過夜。加入2．5 mL PBS緩沖液（pH 7．4），置空氣浴搖床中，37℃，180 r／min，20 min水化，水浴超聲5 min脫膜，探頭超聲制備得到4R22-LP-PTX或者載香豆素-6脂質體（4R22-LP-coumarin）。

取適量制備得到的脂質體樣品，用激光粒度儀測定其粒徑和電位。采用葡萄糖凝膠柱色譜法分離脂質體與未包載的紫杉醇，將過柱后的脂質體采用甲醇破乳，用高效液相色譜法在228 nm檢測紫杉醇含量。按照EE%＝W包／W投×100%計算包封率。W包：脂質體中包載的藥物量。W投：制備脂質體的投藥量。

1．2．2A549細胞對載coumarin脂質體的攝取

流式細胞儀（Becton Dickinson，San Jose，CA，USA）用于本次實驗［8］。將對數生長期的細胞以5×105個／孔的密度接種于6孔板中，37℃培養24 h后，每孔加入coumarin，LP-coumarin和4R22-LP-coumarin 0．5 h，coumarin最終濃度為1．0 mol／L。相同的培養液作為對照組。孵育后，細胞用冰冷的PBS沖洗2次停止細胞的吸收。而后加入0．5% trypsin-EDTA，最后吸收的細胞量使用流式細胞儀計數。每個實驗重復3次。

1．2．3熒光顯微鏡檢測4R22-LP- rhodamine 123進入細胞內的研究［9］

簡要如下：A549，A549／Adr細胞種在12孔板中，密度是10×104cells／孔。在5%CO2，37℃培養24 h后，細胞分別使用rhodamine 123，LP- rhodamine 123和4R22-LP- rhodamine 123作用2h，rhodamine 123在A549和A549／Adr細胞上的終濃度為10．0 mol／L。細胞用冰冷的PBS沖洗2次，再使用Hoechst 333342（10 mol／L）孵育30min后，沖洗細胞，最后用流式細胞儀檢測。對照組使用相同條件處理。

1．2．4細胞毒性實驗

培養A549和A549／Adr細胞并接種于96孔板中。孔板中細胞完全貼壁且處于對數生長期時加入無菌過濾后的紫杉醇濃度分別為0．25 μg／mL、2．5 μg／mL、10 μg／mL、25 μg／mL的脂質體。將孔板移入37℃或4℃CO2孵箱中培養24 h后取出，每孔加入20 μL 5 mg／mL MTT溶液，再放回孵箱中繼續孵育4 h，將孔板中液體倒出，每孔加入200 μL DMSO。37℃避光振搖15 min，用酶標儀在490 nm處測定各孔的光密度值。

1．2．5細胞凋亡實驗

A549和A549／Adr細胞并接種于96孔板中。孔板中細胞完全貼壁且處于對數生長期時加入無菌過濾后的Taxol，LP-PTX，4R22-LP-PTX，最終紫杉醇濃度為10 mol／L的脂質體。將孔板移入37℃或4℃CO2孵箱中培養24 h后取出，細胞混懸在緩沖液中，分別加入10 μL的Annexin V-FITC，室溫孵育15 min，再加入5 μL PI，使用流式細胞儀分析，重復3次。

1．2．6統計學方法

正態計量數據以“x±s”表示，應用SPSS 21．0統計軟件進行數據分析，兩組間比較用t檢驗，多組間比較用方差分析。P﹤0．05表示差異有統計學意義。

2　結果

2．14R22-LP-PTX的表征

制備得到的4R22-LP-PTX的粒徑在106．5 nm左右，粒徑分布系數PDI＜0．3，zeta電位為3 mV左右，紫杉醇的包封率為88．5%（見表1）。

表1　不同PTX納米粒的物理特征（n＝3）Table 1　The physical characteristics of different PTX nanoparticles（n＝3）

圖1顯示體外評估納米粒在包含10%FBS的PBS中釋放PTX的累積量。結果顯示，在2 h時，所有納米粒釋放PTX都少于20%。超過12 h，注射的PTX在體液中釋放超過了98%，但注射劑Taxol不及10%。同時，LP-PTX和4R22-LP-PTX納米粒釋放PTX在12 h時分別為（32．3±2．23）%，（44．4±4．45）%和（53．4±5．54）%。與注射PTX相比，納米粒釋放PTX都出現了延遲的特點。然而，12 h后，所有納米粒的釋放曲線趨于平衡。

2．2A549細胞對脂質體的攝取

圖2A顯示的是腫瘤細胞對各種包載PTX制劑吸收后的流式結果。腫瘤細胞對脂質體的攝取量與流式細胞檢測的熒光強度成正比，空白組、Taxol、LP-PTX和4R22-LP-PTX在A549細胞上的熒光強度分別為5．45．55±1．22，224．56±3．45， 510．34±12．33，778．98±12．34；而在A549／Adr中的強度分別為6．44±1．21，121．34±1．34，465．56± 13．23，790．65±12．45。靶向制劑在A549／Adr中的吸收略高于A549，提示靶向制劑能有效逆轉耐藥。

為了進一步觀察細胞對不同組藥物吸收的情況，使用rhodamine 123代替PTX制備并分組成rhodamine 123，LP-rhodamine 123納米粒和4R22-LP-rhodamine 123納米粒。圖2B顯示，親水性的rhodamine 123能較好的分布在A549細胞中，導致了綠色熒光累積。當rhodamine 123被包入形成納米粒時，與rhodamine 123和LP-rhodamine 123納米粒相比，4R22-LP -rhodamine 123納米粒在細胞漿中的重疊圖像顯示出更強的綠光。相反，rhodamine 123在A549／Adr中的熒光強度有限（圖2C）。同時，我們發現，4R22-LP-rhodamine 123在A549／Adr細胞中的重疊的熒光強度接近在A549細胞中的（圖2C）。該結果進一步證明了4R22-LP-rhodamine 123納米粒能更有效的逆轉耐藥。

2．34R22-LP-PTX體外誘導耐藥A549凋亡和細胞毒性

圖3顯示在空白組、taxol組、LP-PTX組和4R22-LP-PTX組作用中，A549和A549／Adr細胞凋亡的情況。細胞早期凋亡作為評價標準。空白組、Taxol組、LP-PTX組和4R22-LP-PTX組誘導A549細胞凋亡率分別是4．44%，10．43%，9．34%和11．65%，而誘導A549／Adr凋亡率分別為11．54%，17．65%，16．45%和23．46%。其中4R22-LP-PTX組誘導的A549／Adr相對凋亡率（4R22-LP-PTX組減掉PBS組后的凋亡值）與A549相比，差異不顯著（P＝0．085）提示4R22-LP-PTX組能逆轉耐藥，誘導肺癌細胞凋亡。

圖4顯示了在不同組藥物對A549（A）和A549／Adr（B）細胞的抑制性。和Taxol以及LPPTX相比，4R22-LP-PTX在1，5，10 mol／L的濃度下顯著抑制了A549和A549／Adr細胞，P＜0．05。空靶向納米粒展現較小的抑制性（＜1 mol／L），并且在高濃度10 μm對兩細胞的抑制率小于30%。

3　討論

MDR是導致惡性腫瘤化療療效差的主要原因之一［10］，尋找和開發新藥或治療策略成為當務之急。藥物傳遞系統在傳遞抗癌藥物到達腫瘤部位逆轉耐藥、提高療效發揮著重要的功效，其中靶向基團修飾、且由生物降解材料構建的載體在藥物傳遞系統研究中備受關注［11］。

4R22-LP-PTX納米粒具有以下的特點：小粒徑，高包封率和較低的陽性點位（圖1）。小粒徑和高包封率能使4R22-LP-PTX進入腫瘤組織，并且通過EPR效應在腫瘤組織中累積［12］。較低的陽性電位能使納米粒進入腫瘤細胞后很好的與帶有負電荷的線粒體結合［13］。

在藥物釋放實驗中，釋放期間的前2h，納米粒中小量藥物釋放可以防止藥物在傳遞過程中因泄漏帶來的較大損失。即能保證藥物釋放后期在細胞、腫瘤中的藥物累積達到較高的濃度。在腫瘤細胞毒性評價中，雖然Taxol的抑制能力在A549／Adr細胞中受到限制，但4R22-LP-PTX在A549和A549／Adr展現出強大的抑制率，而且兩者的抑制率相近，提示4R22-LP-PTX有較強的逆轉耐藥的能力（圖1）。

在凋亡評價中，4R22-LP-PTX同樣在A549和A549／Adr表現出優秀的誘導細胞凋亡的能力（圖3）。各種劑型誘導凋亡的效率相似或者有輕微不同。誘導A549／Adr細胞高凋亡率是由于未加藥A549／Adr細胞高凋亡（與空白對照10．65± 0．43%，4R22-LP-PTX：24．05±0．40%）造成。而在A549細胞上的低凋亡率起源于未加藥A549細胞低凋亡（與空白對照：4．63±0．27%相比，4R22-LPPTX：11．33±0．58%）。在未加藥A549／Adr中的高凋亡是由于CDDP誘導并保持CDDP耐受A549的培養中造成的。從結果，我們可以清晰的看出4R22-LP-PTX誘導耐藥的A549／Adr細胞凋亡的效果與普通的A549無顯著性差異，進一步證實了4R22-LP-PTX逆轉耐藥、誘導腫瘤細胞的凋亡。

通過流式細胞儀檢測，我們清晰觀察到rhodamine 123進入細胞漿產生的綠光的情況；同時借助Hoechst 33342染核產生的藍光，觀察脂質體作用到核，最后誘導細胞死亡的情況。與普通A549細胞相比，普通rhodamine 123進入A549／Adr細胞核的量有限，產生較弱的藍光；而4R22-LP- rhodamine 123帶來顯著的藍光（重疊部分）。重要的是，與A549細胞相比，4R22-LP-rhodamine 123轉入A549／Adr細胞率無顯著性差異，提示4R22-LP- rhodamine 123有較好的逆轉耐藥功能。其機制可能是靶頭4R22修飾的脂質體運載了大量rhodamine 123在A549細胞的聚集、內吞并且作用細胞核。

綜上所述，4R22-LP-PTX能顯著性的逆轉耐藥，并有效的誘導A549／Adr細胞的凋亡，該制劑可成為臨床治療耐藥的手段的選擇。

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Overcoming the drug resistance in lung cancer cells with 4R22-modified paclitaxel liposome treatment

ZHOU Yi1, WANG He2★, ZHU Lina1
(1. College of Pharmaceutics Science, Guangzhou Medical University, Guangzhou, Guangdong, China, 511436; 2. Department of Oncology, The Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou, Guangdong, China, 510260)

[ABSTRACT]ObjectiveTo study how to regain the sensitivity to the drugs in the drug resistant lung cancer cells with 4R22 modified paclitaxel liposome (4R22-LP-PTX) treatment. Methods4R22-LPPTX was prepared by film dispersion method. The biophysical properties of 4R22-LP-PTX were tested by Malvin size and potentiometer. The apoptosis of lung cancer cells (A549 cells and A549/Adr cells [resistant cell line]) and carrying capacity induced by 4R22-LP-PTX were evaluated by flow cytometry. Inhibition rates of 4R22-LP-PTX on A549/Adr cells were determined by MTT method, and fluorescence of 4R22-LP-PTX penetrated in the cells was quantified by flow cytometry.Results4R22-LP-PTX was successfully constructed. The average particle size, potential, PDI, and coating rate were 106.5 nm, 3.12 mv, 0.22, and 85%, respectively. 4R22-LP-PTX could be effectively transfected into A549/Adr cells, significantly overcome the drug resistance, induce apoptosis of A549/Adr cells, and thus inhibit the proliferation of A549/Adr cells, compared with A549 cell (P<0.05). Conclusion4R22-LP-PTX can be successfully constructed, transfected into the drug resistant human lung cancer cells, and thus overcome the drug resistance of the cancer cells.

[KEY WORDS]4R22; Paclitaxel liposome; Drug resistant lung cancer cells

通訊作者：★王赫，E-mail：wanghe97＠hotmail．com

基金項目：國家自然科學基金（81402023）