早期運動訓練對大鼠局灶性腦缺血后運動功能及磁共振彌散張量成像的影響①

米海霞，張通，繆培，張玉閣

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早期運動訓練對大鼠局灶性腦缺血后運動功能及磁共振彌散張量成像的影響①

米海霞，張通，繆培，張玉閣

[摘要]目的探究早期運動干預對大鼠局灶性腦缺血后運動功能的影響及腦機制。方法21只Sprague-Dawley雄性大鼠分為假手術組(n=7)、自然恢復組(n=7)和運動訓練組(n=7)，后兩組線栓法復制局灶性腦缺血模型。運動訓練組于造模術后24 h進行跑輪訓練14 d。所有大鼠術后21 d行Rogers神經功能缺損評分及平衡木測試；各組選取行為學評分相近的4只大鼠行核磁共振彌散張量成像(DTI)掃描，測量腦缺血區域(L)及對側相應區域(R)的部分各向異性(FA)和表觀彌散系數(ADC)及其比值(r)；彌散張量纖維束示蹤(DTT)觀察各組纖維束的形態。結果假手術組Rogers評分顯著低于模型各組(Z=-0.786, P<0.001)，運動訓練組與自然恢復組無顯著性差異(P>0.05)。自然恢復組平衡評分顯著高于假手術組和運動訓練組(F=38.11, P<0.001)，運動訓練組與假手術組間無顯著性差異(P>0.05)。自然恢復組LFA與假手術組相比有顯著性差異(P<0.05)，而運動訓練組與自然恢復組和假手術組均無顯著性差異(P>0.05)；自然恢復組rFA低于假手術組及運動訓練組(F=19.30, P<0.05)，而運動訓練組與假手術組無顯著性差異(P>0.05)。自然恢復組ADC和rADC與假手術組之間可能有顯著性差異(P=0.056, P=0.057)，運動訓練組與另兩組間無顯著性差異(P>0.05)。LFA和rFA與各項行為學評分有較高相關性(r=-0.90～-0.70, P<0.01)；LADC和rADC與平衡功能無相關性(P>0.05)，與其他行為學評分有中等相關性(r=0.50～0.75, P<0.05)。DTT顯示，運動訓練組和自然恢復組纖維成分、疏密程度兩側不對稱，病灶側各方向纖維減少、部分缺失；運動訓練組病灶側神經纖維較自然恢復組密集，對稱性及連續性好。結論早期進行運動訓練能夠促進大鼠局灶性腦缺血后運動功能恢復，可能與保護損傷側神經纖維完整性有關。

[關鍵詞]腦卒中；腦缺血；運動訓練；彌散張量成像；神經纖維；大鼠

作者單位：1.首都醫科大學康復醫學院，北京市100068；2.中國康復研究中心北京博愛醫院，北京市100068。作者簡介：米海霞(1989-)，女，瑤族，湖南辰溪縣人，碩士研究生，主要研究方向：神經康復。通訊作者：張通，男，博士，主任醫師，教授，博士生導師。E-mail: zt61611@sohu.com。

[本文著錄格式]米海霞，張通，繆培，等.早期運動訓練對大鼠局灶性腦缺血后運動功能及磁共振彌散張量成像的影響[J].中國康復理論與實踐, 2016, 22(1): 1-7.

CITED AS: Mi HX, Zhang T, Miao P, et al. Effects of early exercise on motor function and diffusion tensor imaging in rats after focal cerebral ischemia [J]. Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian, 2016, 22(1):1-7.

腦卒中已經成為第二大致死疾病及成年人致殘的最常見原因[1]。我國每年約有160萬人死于腦卒中，是最主要的致死性及成人致殘性疾病[2]。每年約有250萬新發腦卒中患者，在約750萬腦卒中幸存者[3]中，約65%留有不同程度功能障礙[4]。

臨床及動物研究證實，運動治療可以通過調節炎癥因子表達[5-6]、平衡氧化應激反應[7]、改善血腦屏障通透性[8]、增加腦血流量[9-10]、促進腦微血管新生[11]等途徑，發揮神經保護、改善功能恢復的作用。但目前卒中后運動訓練對腦結構的影響仍不很清楚。

彌散張量成像(diffusion tensor image, DTI)是基于組織中水分子彌散運動測量的成像方法，可無創監測腦組織微結構及纖維束的改變[12]，為揭示卒中后白質纖維動態重塑提供了有效手段；還可利用DTI數據進行大腦或者脊髓白質彌散張量纖維束示蹤(diffusion tensor tractography, DTT)[13]。本研究采用DTI探討早期運動干預對大鼠局灶性腦缺血后運動功能影響的腦解剖機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物

成年雄性Sprague-Dawley大鼠21只，體質量250～280g，SPF級，飼養于北京友誼醫院實驗動物部動物屏障實驗室，許可證號SYXK(京)2012-0023。分為假手術組(n=7)、自然恢復組(n=7)和運動訓練組(n= 7)。

1.2模型制備

根據Longa改良線栓法[14]制備大鼠大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型。自然恢復組和運動訓練組大鼠10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉，頸正中切開，鈍性分離，暴露左側頸總動脈、頸外動脈和勁內動脈分岔處；結扎頸總動脈近心端及頸外動脈遠心端，動脈夾臨時夾閉頸內動脈，于頸總動脈遠心端做一切口，插入相應直徑的硅膠頭線栓，沿頸總動脈進入頸內動脈，到達大腦中動脈起始部(有輕微阻力感，深度約1.8～2.0 cm)后固定線栓。檢查無出血后縫合頸部皮膚。皮下注射生理鹽水5 ml補充體液，連續3 d。

假手術組暴露動脈，不插線。其余損傷同上。

術后24 h采用Longa評分進行評定[14]，1～2分為造模成功，納入實驗。

1.3跑輪訓練

運動訓練組術后24 h開始進行跑輪訓練。采用YLS-15A大鼠轉輪式跑步機(北京眾實迪創科技發展有限責任公司)，初始轉速10 r/min；根據大鼠運動耐力調整跑步機速度；大鼠忍受10 s電擊后，轉輪停轉，休息1 min后繼續；如果10 min內大鼠連續休息3次或以上，下調跑籠速度。每次30 min，每天1次，連續14 d。

1.4行為學評價

術后21 d進行行為學功能評價。

1.4.1Rogers評分

輕提大鼠，將其懸至距地面1 m處，觀察前肢彎曲狀況，0分，大鼠雙前肢伸向地面且無其他神經病學特征；1分，對側前肢持續彎曲而無其他異常。2分，將大鼠置于軟塑封紙上，使其前爪可以牢牢抓住，拉住鼠尾，在其肩后輕輕側推直至前肢側滑數英寸，癱瘓側抵抗推力能力下降。3分，大鼠放在地面上，拉其尾時向癱瘓側旋轉；4分，大鼠放在地面上自由行動時向癱瘓側旋轉；5分，只在刺激時行走。6分，對刺激無反應，意識水平低。7分，死亡[15]。

1.4.2平衡木測試

0分，在平衡木上平穩步行；1分，穩定在橫木上；2分，抓住橫木一邊；3分，抱著橫木，一只爪掉下橫木；4分，抱著橫木，兩只爪掉下橫木，或者在橫木上轉圈，能待60 s以上；5分，在橫木上待40～ 60 s；6分，在橫木上待20～40 s；7分，20 s內掉下。

每只動物評估3次，取平均值。

1.5 DTI

術后21 d使用7.0 T MRI掃描儀(PharmaScan, Bruker Biospin, Rheinstetten,germany)對各組中行為學評分相近的4只大鼠進行掃描，包括定位圖、T2WI、T2map及DTI。定位相序列RARE，層厚1 mm，掃描層數8層，TR 2000 ms, TE 32.2 ms，FA 180°，FOV 330×330 mm，矩陣256×256；T2WI序列RARE，層厚0.7 mm，掃描層數30層，TR 5000 ms，TE 36 ms，FA 180°，FOV 330×330 mm，矩陣256×256；DTI為單次激發自旋平面回波序列(SE-EPI)，彌散敏感梯度為非共線且非共面的30個梯度方向，b=1000 s/mm2，同時包括5個b=0的DTI圖像，層厚0.7 mm，掃描層數30層，TR =7500 ms，TE 25 ms，FA 90°，FOV 330×330 mm，矩陣256×256，相位編碼方向為從左到右，平均激勵次數4次。

數據由同一實驗人員在工作站采集。在T2圖像上選取最大梗死面積層面(第20～22層)，畫取皮質梗死區域(信號異常區)，并在對側皮質畫出相應大小的感興趣區；在部分各向異性(fractional anisotropy, FA)及表觀彌散系數(apparent diffusion coefficient, ADC)圖的相應層面讀取感興趣區的平均值。

采用MRIcon軟件將核磁數據轉換成NIfTI格式，用Diffusion Toolkit軟件進一步處理，用Trackvis軟件進行最終纖維束示蹤。

1.6統計學分析

2　結果

2.1行為學評分

假手術組無神經功能缺損癥狀，Rogers評分與造模各組存在非常高度顯著性差異(P<0.001)；自然恢復組與運動訓練組間無顯著性差異(P>0.05)。

自然恢復組的平衡評分顯著高于假手術組及運動訓練組(P<0.001)，運動訓練組與假手術組間無顯著性差異(P>0.05)。見表1。

2.2FA

自然恢復組與假手術組間，左側感興趣區FA有顯著性差異(P<0.05)，而運動訓練組與自然恢復組及假手術組間均無顯著性差異(P>0.05)；各組間右側感興趣區FA無顯著性差異(P>0.05)。自然恢復組左右FA比值(rFA)低于假手術組(P<0.001)和運動訓練組(P< 0.05)，運動訓練組與假手術組間無顯著性差異(P> 0.05)。見表2。

2.3ADC

各組間左側感興趣區ADC及左右側比值rADC存在顯著性差異(P<0.05)，進一步行Bonferroni兩兩比較，各組間無顯著性差異。見表3。

表1　各組行為學評分比較

表2　各組FA比較

表3　各組ADC比較

2.4相關性分析

左側FA和rFA與Rogers評分、平衡評分均呈負相關；左側ADC與Rogers評分及平衡評分呈正相關；rADC與Rogers評分正相關，與平衡評分無顯著相關性(P>0.05)。見表4。

2.5DTT

全腦DTT(圖1)紅色代表左右走向纖維，藍色代表上下走向纖維，綠色代表前后走形纖維[16]。假手術組雙側纖維束走行、方向及疏密基本對稱；自然恢復組左側(病灶側)各方向纖維稀少，部分缺失；運動訓練組左側橫向纖維稀少，但較自然恢復組密集，前后及上下方向纖維保留較完整。

選取最大缺血層面DTT(圖2)，假手術組雙側纖維基本對稱，纖維束密集，纖維間連續性良好；自然恢復組左側纖維束明顯減少，纖維束不連續，各方向纖維束稀薄；運動訓練組可見左側橫向纖維減少，縱向纖維較對側減少，但連續性較自然恢復組好，且纖維束較自然恢復組密集。

表4　DTI指標與行為學評分的相關性分析

圖1　全腦DTT

圖2　最大缺血層面DTT

3　討論

缺血性腦卒中時，局部腦血流供應中斷，組織缺血缺氧引起一系列病理損傷，最終導致不可逆性腦神經損害。減少早期各種病理損害、降低繼發損傷、提高神經元存活，有助于減輕神經功能損害。

腦毛細血管、神經膠質與神經元之間在細胞和功能水平相互作用，即“神經血管單元”，在卒中后維持腦微血管完整性及減少神經損傷中具有重要作用[17-18]。研究表明，運動訓練可以通過減輕血腦屏障功能障礙、促進神經血管的完整性、抑制神經細胞凋亡及神經炎癥反應、促進神經血管再生等，減輕神經損傷，實現神經功能重塑[8-9,19-21]。然而運動訓練神經保護作用對結構重塑的影響研究仍然較少。

本研究顯示，模型各組在術后3周內，神經功能缺損癥狀持續存在，模型制備成功。自然恢復組與運動訓練組Rogers評分無顯著性差異，可能與樣本量少有關；運動訓練組平衡評分優于自然恢復組，且與假手術無顯著性差異，表明早期運動訓練能夠促進大鼠的運動功能恢復。這與其他研究結果一致[20-22]。

FA是水分子各向異性成分占整個彌散量的比例[23]。腦缺血時，神經纖維結構破壞，疏水的軸膜和髓鞘對水分子的限制減小或消失，水分子彌散特征可發生相應改變。高FA與神經纖維一致性及髓鞘增加相關，低FA可能表示神經纖維一致性降低，神經纖維損害或可能發生軸突出芽[24]。本研究顯示，早期運動訓練能夠在一定程度上減輕腦缺血損害，保護神經纖維。本研究還顯示，rFA能更敏感地反映損傷程度，這與一些臨床研究結果相符[25]。

ADC反映水分子在單位時間內彌散的范圍，用于描述組織中水分子彌散快慢。既往研究表明，腦梗死超急性期及急性期由于血管阻塞，細胞膜離子泵功能障礙，導致細胞毒性水腫，缺血區ADC下降；亞急性期由于血-腦屏障破壞，血管源性水腫與細胞毒性水腫并存，同時有不同程度的細胞膜破壞和組織壞死等，ADC圖表現為低高信號；慢性期由于血管源性水腫，且組織壞死更明顯，細胞結構崩解，部分液化形成軟化灶，伴有膠質細胞增生，ADC圖上升為高信號。

本研究中，自然恢復組和運動訓練組病灶側ADC高于假手術組，提示大鼠已趨于慢性期。各組間右側ADC無顯著性差異，左側ADC及rADC有顯著性差異，但兩兩比較時，組間差異不顯著。提示卒中后早期運動訓練可能通過降低急性期細胞毒性損害，改善血腦屏障功能障礙，進而減少亞急性期和慢性期的血管源性水腫以及細胞壞死。

相關性分析顯示，缺血側FA和rFA與行為學評分有較高的相關性，與其他研究的結果一致[24,26-27]。Song等報道，FA是腦卒中患者接受腦刺激治療后一項有價值的內囊后肢微結構完整性的測量方式及有前途的示蹤和預測運動功能恢復的生物指標[26]。DTI參數的患健側比值與運動功能恢復顯著相關，低彌散率和高FA與較好的功能恢復相關[25]。

DTT是近年來迅速發展起來的磁共振功能成像技術，它利用主要特征向量的數據，映射為不同顏色。本研究全腦及最大缺血層面DTT均顯示，運動訓練組和自然恢復組兩側纖維成分、疏密程度明顯不對稱，病灶側各方向纖維減少、部分缺失；運動訓練組病灶側神經纖維較自然恢復組密集，對稱性及連續性均較好。這與FA、rFA及運動評分一致。提示早期運動訓練有助于維持神經纖維的完整性。

本研究的主要不足之處包括：①樣本量偏少；②采用量表評分實現對大鼠局灶性腦缺血模型的均一性控制，準確性有待提高；③DT核磁成像技術對交錯纖維、膠質瘢痕識別能力差，容易導致假陽性結果。

綜上所述，大鼠局灶性腦缺血損傷后，早期進行運動訓練能夠促進大鼠運動功能、平衡及協調功能恢復，可能與保護維持纖維束的完整性有關。此外，患側皮質FA及rFA與行為學評分具有高度相關性，有可能有效預測腦缺血后運動功能結局。

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Effects of Early Exercise on Motor Function and Diffusion Tensor Imaging in Rats after Focal Cerebral Ischemia

MI Hai-xia, ZHANG Tong, MIAO Pei, ZHANG Yu-ge
1. Capital Medical University School of Rehabilitation Medicine, Beijing 100068, China; 2. Beijing Bo'ai Hospital, China Rehabilitation Research Center, Beijing 100068, China
Correspondence to ZHANG Tong. E-mail: zt61611@sohu.com

Abstract:Objective To explore the effects of early exercise on motor function and the mechanism in rats after focal cerebral ischemia. Methods 21 Sprague-Dawley male rats were divided into controlgroup (n=7), natural recoverygroup (n=7) and exercise traininggroup (n= 7), and the latter 2groups were modeled with middle cerebral artery occlusion. The exercise traininggroup received wheel running exercise 24 hours after modeling for 14 days. They were assessed with Rogers score and beam balance test 21 days after modeling. 4 rats in eachgroup received routine MRI and diffusion tensor imaging (DTI) scanning. The fractional anisotropy (FA) and apparent diffusion coefficient (ADC) of ischemic (L) and contralateral side (R) were measured, and the rate of them (L/R, r) was calculated. Results There was significant difference in Rogers score among thegroups (Z=-0.786, P<0.001), but no significant difference between the natural recoverygroup and the exercise traininggroup (P>0.05). Beam balance score of the natural recoverygroup was significantly different from the controlgroup and the exercise traininggroup (F=38.11, P<0.001), but there was no significant difference between the latters (P>0.05). The LFA of the natural recoverygroup was significantly different from the controlgroup (P<0.05), but not significantly different from the exercise traininggroup (P>0.05); while the rFA of the natural recoverygroup was significantly different from the controlgroup and the exercise traininggroup (F= 19.30, P<0.05). LADC and rADC might be different between the controlgroup and the natural recoverygroup (P=0.056, P=0.057), but not significantly different between the natural recoverygroup and the exercise traininggroup (P>0.05). LFA and rFA strongly correlated with all the behavior scores (r=-0.90--0.70, P<0.01); while LADC and rADC moderately correlated with the behavior scores (r=0.50-0.75, P0.05). DTT showed that the direction and density of neural fibers were significantly asymmetrical in the natural recoverygroup and the exercise traininggroup, and more symmetrical in the exercise traininggroup. Conclusion Early exercise can promote the neural functional recovery in rats after focal cerebral ischemia, which may associate with the improve of conduction of fibers.

Key words:stroke; cerebral ischemia; exercise; diffusion tensor imaging; neural fibers; rats

(收稿日期：2015-10-09修回日期：2015-11-02)

[中圖分類號]R743.32

[文獻標識碼]A

[文章編號]1006-9771(2016)01-0001-07

基金項目：“十二五”國家科技支撐計劃項目(No.2011BAI08B11)。

DOI:10.3969/j.issn.1006-9771.2016.01.001