Mash-1轉染對胚胎干細胞在小鼠脊髓損傷部位向神經細胞分化的促進作用①

徐樂勤，李曉鋒，施杞，王擁軍，周重建

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Mash-1轉染對胚胎干細胞在小鼠脊髓損傷部位向神經細胞分化的促進作用①

徐樂勤1,2，李曉鋒2，施杞2，王擁軍2，周重建2

[摘要]目的觀察過表達Mash-1基因的胚胎干細胞在脊髓損傷部位向神經細胞分化的情況及其對脊髓神經損傷的修復作用。方法采用鼠干細胞病毒將Mash-1基因轉染CE3小鼠胚胎干細胞穩轉株。4周齡雄性SPF級昆明小鼠鉗夾法建立急性脊髓損傷模型。造模后3 d向脊髓損傷部位注射生理鹽水(模型組, n=12)、CE3胚胎干細胞(CE3組, n=12)、轉染Mash-1基因的CE3小鼠胚胎干細胞(CE3-Mash-1組, n=12)。術后1 d、7 d、14 d、21 d、28 d檢測小鼠后肢功能評分。術后14 d、28 d分別處死小鼠，HE染色觀察脊髓剩余面積；CE3組、CE3-Mash-1組行Oct3/4、nestin、β-tubulinⅢ、神經膠質酸性蛋白(GFAP)免疫熒光染色，觀察移植細胞的分化。結果與模型組比較，移植CE3和CE3-Mash-1細胞的小鼠運動功能均提高(F>84.471, P<0.05)，脊髓剩余面積增加(F>49.990, P<0.05)。與移植CE3細胞相比，移植CE3-Mash-1細胞在損傷的脊髓部位Oct3/4陽性細胞數顯著減少(t=5.439, P< 0.001)，而nestin (t=-7.536, P<0.001)和β-tubulinⅢ(t=-9.941, P<0.001)陽性細胞數顯著增加，GFAP陽性細胞數無顯著性差異(t= 1.701, P=0.120)。結論過表達Mash-1基因可促進CE3細胞在脊髓損傷部位分化成神經元，促進小鼠后肢運動功能的恢復。

[關鍵詞]脊髓損傷；胚胎干細胞；基因轉染；Mash-1；神經分化；小鼠

作者單位：1.福建中醫藥大學附屬廈門中醫院，福建廈門市361009；2.上海中醫藥大學脊柱病研究所，上海中醫藥大學附屬龍華醫院，上海市200032。作者簡介：徐樂勤(1981-)，男，漢族，福建漳州市人，博士，主治醫師，主要研究方向：中醫藥促進脊髓神經損傷修復。通訊作者：周重建(1953-)，男，漢族，上海市人，博士，教授，主要研究方向：中醫藥促進脊髓神經損傷修復。E-mail: zhouchongjian@hotmail.com。

[本文著錄格式]徐樂勤，李曉鋒，施杞，等. Mash-1轉染對胚胎干細胞在小鼠脊髓損傷部位向神經細胞分化的促進作用[J].中國康復理論與實踐, 2016, 22(1): 46-52.

CITED AS: Xu LQ, Li XF, Shi Q, et al. Effects of transfection of Mash-1gene on neural differentiation of embryonic stem cell in spinal cord injury mice [J]. Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian, 2016, 22(1): 46-52.

脊髓損傷是一種高致殘率的中樞神經系統損傷，不僅給患者帶來極大痛苦，也給家庭和社會帶來沉重負擔。臨床采用的手術、藥物和物理康復等手段都不能完全解決患者的截癱問題[1]。

細胞移植是神經再生領域研究最多的治療方法。當前可用于移植的細胞種類有誘導性多潛能干細胞、胚胎干細胞、神經干細胞、間充質干細胞、嗅鞘細胞、施萬細胞等[2-4]。由于胚胎干細胞具有無限增殖和多向分化的能力，具有較大的治療潛能；但其移植后的定向分化、成瘤危險以及存活數量少仍然是亟待解決的問題[2]。基因工程技術的應用可促進細胞的定向分化。Mash-1基因在哺乳動物的神經發生過程中起關鍵作用[5]。過表達Mash-1基因能使小鼠畸胎瘤P19細胞和胚胎前體皮層細胞向神經元方向分化[6]。我們前期體外實驗結果也表明，過表達Mash-1基因可促進CE3小鼠胚胎干細胞在體外分化成神經細胞。

本研究進一步觀察過表達Mash-1基因胚胎干細胞在體內的分化情況，以其對脊髓損傷的修復作用。

1　材料與方法

1.1動物

昆明小鼠，雄性，SPF級，體質量(20±2)g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號SCXK(滬)2007-0005。飼養于上海中醫藥大學附屬龍華醫院SPF級動物實驗室。

1.2試劑

DMEM、L-gul、β-mercaptoethanol、胰酶：GIBCO公司。FBS：BIOCHROM公司。LIF細胞因子：CHEMICON公司。逆轉錄試劑盒、熒光素酶：TAKARA公司。Oct3/4、nestin、β-tubulinⅢ和神經膠質酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,gFAP)一抗：ABCAM公司。紅色熒光標記的山羊抗小鼠IgG二抗：KPL公司。293T細胞由上海中醫藥大學脊柱病研究所提供。CE3細胞購自中國科學院上海生命科學研究所。

1.3過表達Mash-1基因CE3穩轉株的構建及細胞培養

待293T細胞生長達90%左右時，使用脂質體2000將鼠干細胞病毒(murine stem cell virus, MSCV)空載體質粒或MSCV-Mash-1轉染到293T細胞。轉染后24 h和48 h各取病毒上清，-80℃保存備用。

CE3細胞生長至70%～80%時，吸除細胞培養液，加入之前收集的病毒上清，4 h后換胚胎干細胞(embryonic stem cell, ESC)完全培養液培養；次日同法再感染1次。于末次感染后72 h，采用含潮霉素100 μg/ml的ESC完全培養液篩選陽性細胞。抽提感染MSCV-Mash-1和MSCV空載體的CE3細胞以及未經感染的CE3細胞的RNA，逆轉錄試劑盒將其逆轉錄成cDNA，聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR)鑒定3種細胞Mash-1基因表達情況。

將CE3和CE3-Mash-1細胞培養于0.2%明膠包被過的培養皿中，采用ESC完全培養液培養，每天換液1次。待細胞生長至80%時，0.125%胰酶消化，1∶6傳代。

1.4急性脊髓損傷模型建立及分組

小鼠適應性喂養3 d，以氯胺酮0.05 ml/10g腹腔注射麻醉。小鼠俯臥固定，背部備皮，碘伏常規消毒，背正中切口，分離棘突兩側椎旁肌，暴露棘突和椎板，以第13肋骨為標記，確定T13椎體位置。切斷棘上和棘間韌帶，用彎眼科剪從兩側椎板根部剪斷椎板，暴露T13節段脊髓。Dumont 5號鑷前后方向夾持脊髓15 s。無菌紗布輕輕壓迫止血，縫合封閉皮下筋膜和皮膚，關閉切口[7]。次日將造模后的動物分為模型組、CE3組、CE3-Mash-1組，每組12只。另12只為假手術組，僅暴露脊髓，不予損傷。術后每天腹腔注射青霉素50,000 U/kg，共3 d；擠壓膀胱輔助排尿至自身排尿反射恢復。

1.5移植細胞的制備和注射

常規培養和擴增CE3、CE3-Mash-1細胞。移植前0.125%胰酶消化，終止后吹打成單個細胞懸液，離心，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)洗2次，計數板計數確定細胞總數；生理鹽水重懸，調整細胞濃度為5×104/μl，冰上保存。

造模后3 d，小鼠以氯胺酮0.05 ml/10g腹腔注射麻醉，俯臥固定，碘伏常規消毒，拆除背部縫線，直接暴露損傷節段。用10 μl微量進樣器抽取細胞懸液2 μl，注射到損傷部位中心：垂直進針，深1.5 mm，緩慢注射，注射后留針2 min。

CE3組和CE3-Mash-1組分別注射CE3、CE3-Mash-1細胞懸液，假手術組和模型組分別注射等量生理鹽水。

1.6功能評定

各組分別于術后1 d、7 d、14 d、21 d、28 d行小鼠后肢運動功能量表(Basso Mouse Scale, BMS)評分[8]。BMS通過觀察小鼠后肢主動彎曲、著地，行走時軀干的平衡以及尾巴的活動情況，分為10個等級，0分為關節沒有任何活動，9分為各關節活動均正常。

1.7取材與染色

分別于造模后14 d和28 d，每組取6只小鼠，10%水合氯醛1 ml腹腔注射處死。咬骨鉗咬除椎板，暴露脊髓。切除損傷部位上下各0.5 cm脊髓段。脊髓標本4%多聚甲醛中固定16 h后，棄去多聚甲醛，清水沖洗，置15%蔗糖溶液中脫水24 h，25%蔗糖溶液再脫水24 h。去除蔗糖溶液，-80℃冰箱保存。

冰箱保存的脊髓組織置于切片機冰凍變硬，Oct膠包埋，切片，片厚5 μm。防脫載玻片粘取組織，室溫通風晾干1 d，-20℃冰箱保存。

1.7.1HE染色

冰箱中取出切片，室溫10 min；置于清水中5 min，蘇木素2 min，清水沖洗；0.04%鹽酸酒精分化5 s，清水沖洗；2%氨水返藍10 min，清水沖洗；伊紅2 min，清水沖洗；85%乙醇2 min，95%乙醇2 min，100%乙醇2min；二甲苯Ⅰ2 min，二甲苯Ⅱ2 min，二甲苯Ⅲ2 min；中性樹膠封片；60℃烤箱過夜；相差顯微鏡觀察。IPP 6.0軟件橫切面下測量面積。

1.7.2免疫熒光染色

冰箱中取出切片，PBS浸泡5 min，置于濕盒中，紙巾擦除周圍水分，蛋白酶K消化10 min修復抗原，PBS洗2 min，共3次；0.5% PBST通透20 min，PBS洗2 min，共3次；5% BSA封閉20 min；14 d標本加Oct 3/4、nestin，28 d標本加β- tubulinⅢ、GFAP一抗(均1∶500)，4℃過夜。37℃恒溫箱孵育1 h，PBS洗5 min，共3次；加紅色熒光標記的山羊抗小鼠IgG二抗，37℃避光孵育1 h，PBS洗5min，共3次，加入DAPI 1 μg/ml室溫避光孵育10 min，PBS洗2 min，共3次，熒光顯微鏡觀察。陰性對照用PBS代替一抗。計算陽性細胞率。

1.8統計學分析

2　結果

2.1功能評定

脊髓損傷小鼠后肢運動功能明顯受損，爬行時出現拖拽后肢現象。術后1 d，各損傷小鼠評分值為0，假手術組功能無明顯下降。

術后7 d、14 d、21 d、28 d，即注射后4 d、11 d、18 d、25 d，模型組、CE3組、CE3-Mash-1組評分均有提高，其中CE3組和CE3-Mash-1組評分高于模型組(P<0.05)，CE3組與CE3-Mash-1組間無顯著性差異(P>0.05)；術后28 d，模型組BMS評分無明顯改善，而CE3組和CE3- Mash- 1組評分改善，CE3-Mash-1組評分最高。見表1。

2.2HE染色

損傷14 d和28 d時，模型組脊髓剩余面積明顯減少。CE3組和CE3-Mash-1組脊髓剩余均明顯大于模型組(P<0.01)；假手術組、CE3組和CE3-Mash-1組間脊髓剩余面積無顯著性差異(P>0.05)。見圖1、表2。

表1　各組BMS評分比較

圖1　各組脊髓橫切面(HE染色, bar=500 μm)

表2　各組脊髓橫切面剩余面積(105μm2)

2.3免疫熒光染色

CE3組和CE3-Mash-1組損傷部位均可觀察到移植細胞。術后14 d，CE3組Oct3/4陽性細胞數明顯多于CE3-Mash-1組(P<0.01)，nestin陽性細胞數明顯少于CE3-Mash-1組(P<0.01)。見圖2、表3。術后28 d，CE3-Mash-1組β-tubulinⅢ陽性細胞數明顯多于CE3 組(P<0.01)。GFAP陽性細胞數兩組間無顯著性差異(P>0.05)。見圖3、表3。

表3　CE3組和CE3-Mash-1組表面蛋白標記的表達(%)

圖2　CE3組和CE3-Mash-1組Oct3/4和nestin表達(免疫熒光染色, bar=50 μm)

圖3　CE3組和CE3-Mash-1組β-tubulinⅢ和GFAP表達(免疫熒光染色, bar=50 μm)

3　討論

脊髓損傷的主要造模方法有重物打擊、半側脊髓切斷、鉗夾損傷、牽拉損傷、光化學損傷、缺血損傷等[9]。鉗夾法能較好保持硬脊膜的完整性，該方法造成的神經功能改變與臨床上挫傷型脊髓損傷的病理改變非常相似。該方法由Rivlin報道[10]；Fehlings等[11]和李剛等[12-13]驗證了該方法的可重復性，認為該方法復制的脊髓損傷能較好模擬臨床上的脊髓損傷。該模型引起脊髓損傷程度主要取決于夾持力量的大小和夾持時間的長短。此類動物模型多為閉合性損傷，方便進行神經功能評定和脊髓病理檢測。2008年Plemel等提出小鼠鉗夾脊髓模型[7]。該模型采用不同間隙Dumont 5號鑷夾持脊髓15 s造成不同程度脊髓損傷，被廣泛應用于脊髓損傷治療和機理的研究中[14-16]。該方法復制的脊髓損傷模型死亡率25%左右，是一種成功率相對較高、造模簡便的急性脊髓損傷模型，動物間損傷程度差異小、一致性強、可重復性好。

本研究采用間隙為0.25 mm的Dumont 5號鑷，造模后小鼠后肢運動功能明顯障礙，脊髓病理染色顯示脊髓橫切面剩余面積減少，損傷局部組織結構不清，細胞排列紊亂。

細胞移植后，移植的細胞可分化成神經元、少突膠質細胞，建立新的神經連接，保護或形成新的髓鞘，從而改善神經功能。McDonald等將小鼠的ESC誘導分化成的神經前體細胞后注射到22只損傷9 d的成年大鼠脊髓損傷部位，經過數周觀察，發現移植細胞在大鼠受損脊髓部位進一步分化，形成少突膠質細胞、星形膠質細胞和神經元；移植的細胞從注射部位向兩端遷移8 mm；步態分析儀分析發現，移植組比對照組(移植成年大鼠大腦皮質的神經細胞)的后肢功能有更好恢復[17]。另有報道，移植ESC來源的前體細胞可減少膠質瘢痕形成[18]，促使中樞神經系統損傷后脫髓鞘的神經纖維髓鞘再生[19-20]，產生新的郎飛結，減少脊髓損傷面積的丟失[21]，使傳導通路部分或全部恢復，促進動物前后肢的運動功能[22-23]。

Oct3/4是ESC細胞全能性標記蛋白之一，陽性表示移植的CE3細胞處于未分化狀態；nestin是神經干細胞標記蛋白，β-tubulinⅢ是神經元標記蛋白，GFAP則為膠質細胞標記蛋白。

本研究顯示，移植轉染Mash-1基因的CE3細胞，在脊髓損傷部位能更多分化成nestin陽性的神經干細胞和β-tubulinⅢ陽性的神經元，而表達Oct3/4細胞數明顯減少，表明Mash-1基因修飾可促進CE3細胞在損傷脊髓部位分化成神經元。運動功能評分顯示，術后14 d，CE3組、CE3-Mash-1組后肢功能評分優于模型組，但兩組間無顯著性差異。CE3組21 d時1只小鼠功能評分惡化，并持續到28 d。實驗結束后，我們對這只小鼠進行病理檢查，移植細胞在損傷的局部聚集成團。

Bottai等直接移植未分化的ESC到損傷的脊髓部位，形成不對稱的克隆[24]；Howard等將ESC進行抗凋亡基因Bcl-2修飾后移植到大鼠的脊髓損傷部位，6周后在移植部位發現未分化的細胞團塊[25]。提示直接移植未經合理修飾或未分化的ESC存在形成腫瘤的危險。移植經過Mash-1基因修飾的CE3細胞不但可以促進脊髓神經功能的恢復，也未發現移植細胞在體內形成團塊。

綜上所述，Mash-1基因轉染小鼠CE3胚胎干細胞，可促進CE3細胞在脊髓損傷部位分化成神經細胞，促進脊髓損傷后小鼠后肢運動功能的恢復，可避免形成腫瘤的危險。

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Effects of Transfection of Mash-1gene on Neural Differentiation of Embryonic Stem Cell in Spinal Cord Injury Mice

XU Le-qin1,2, LI Xiao-feng2, SHI Qi2, WANG Yong-jun2, ZHOU Chong-jian2
1. Xiamen Hospital of Traditional Chinese Medicine, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Xiamen, Fujian 361009, China; 2. Institute of Spine, Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200032, China
Correspondence to ZHOU Chong-jian. E-mail: zhouchongjian@hotmail.com

Abstract:Objective To investigate the effects of overexpression of Mash-1gene on functional recovery and neural differentiation of embryonic stem cells in spinal cord injury mice. Methods CE3 cell line with overexpression of Mash-1gene wasgenerated with murine stem cell virus. Spinal cord injury model was established with forceps compression in 4-week-old KM mice. Normal saline (modelgroup, n= 12), CE3 cells with or without overexpression Mash-1gene (CE3-Mash-1 and CE3groups, n=12 respectively) were transplanted into the areas of injury 3 days after injury. They were assessed with the Basso Mouse Scale (BMS) 1, 7, 14, 21, and 28 days after injury. 6 mice from eachgroup were sacrificed 14 and 28 days after injury respectively. The spinal cord area remained were observed with HE stained, and the expression of Oct3/4, nestin,β-tubulin III andglial fibrillary acidic protein (GFAP) were detected with immunofluorescence in the injured spinal cord in the CE3 and CE3-Mash-1groups. Results The score of BMS significantly improved in CE3 and CE3-Mash-1groups compared with that of the modelgroup (F>84.471, P<0.05), with the more area of spinal cord remained (F>49.990, P<0.05). There were less Oct3/4 positive cells in the CE3-Mash-1group than CE3group (t=5.439, P<0.001), with more nestin (t=-7.536, P<0.001) and β-tubulin III (t=-9.941, P<0.001) positive cells. However, there was no significant difference ingFAP positive cells between CE3-Mash-1 and CE3groups (t=1.701, P>0.05). Conclusion Overexpression of Mash-1gene promotes CE3 cells to differentiate into neurons in spinal cord injury mice, and improve the motor function recovery.

Key words:spinal cord injury; embryonic stem cell;gene transfection; Mash-1; neural differentiation; mice

(收稿日期：2015-10-11修回日期：2015-11-12)

[中圖分類號]book=47,ebook=52 R651.2

[文獻標識碼]A

[文章編號]1006-9771(2016)01-0046-07

基金項目：1.上海市教委創新基金項目(No.08-YZ56)；2.國家自然科學基金面上項目(No.30973760)；3.上海市科委非政府國際合作項目(No.10410702800)。

DOI:10.3969/j.issn.1006-9771.2016.01.009