深刺加電針對兔膝骨關節炎軟骨的影響①

付妮妮，李學智，劉菲，席小芳，任毅，楊曉光，張愉

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深刺加電針對兔膝骨關節炎軟骨的影響①

付妮妮1，李學智1，劉菲1，席小芳1，任毅2，楊曉光1，張愉2

[摘要]目的觀察深刺加電針對兔膝骨關節炎軟骨組織的影響。方法新西蘭兔40只隨機分為正常組(A組)10只、造模組30只，后者以Hulth-Telhag法復制兔左膝骨關節炎模型，X線評價造模情況。造模成功后隨機分為模型組(B組, n=10)、深刺加電針組(C組, n=10)和普通電針組(D組, n=10)，造模后第6周開始對C組和D組進行治療，共4周。治療結束后檢測關節液pH值，透射電鏡下觀察軟骨細胞組織結構和病理學改變，檢測軟骨細胞凋亡指數，Western blotting檢測軟骨組織中酸離子敏感通道1(ASIC1)、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)的磷酸化水平和p53蛋白表達，免疫組織化學法檢測軟骨組織中ASIC1分布。結果關節液中pH值從高到低依次為A組=C組>D組>B組(P<0.01)；A組、C組、D組膝關節軟骨組織形態較B組完整，C組凋亡率低于B組和D 組(P<0.01)，與A組無顯著性差異(P>0.05)；軟骨組織中ASIC1和p53表達由低到高均為A組=C組

[關鍵詞]膝骨關節炎；電針；深刺；凋亡；酸離子敏感通道1；p38絲裂原活化蛋白激酶；p53；兔

作者單位：1.重慶醫科大學中醫藥學院，重慶市400016；2.漢中市中心醫院，陜西漢中市723000。作者簡介：付妮妮(1990-)，女，山西長治市人，碩士研究生，主要研究方向：針灸治療與中樞神經生物基礎。通訊作者：李學智，女，博士，副教授，碩士生導師。E-mail: lixz999@126. com。

[本文著錄格式]付妮妮，李學智，劉菲，等.深刺加電針對兔膝骨關節炎軟骨的影響[J].中國康復理論與實踐, 2016, 22(1): 38-45.

CITED AS: Fu NN, Li XZ, Liu F, et al. Effects of deep electroacupuncture on cartilage in knee osteoarthritis rabbits [J]. Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian, 2016, 22(1): 38-45.

骨關節炎(osteoarthritis, OA)是一種以炎癥和關節疼痛為主要癥狀的慢性進行性關節疾病，多發于膝關節，以軟骨變性和丟失以及關節邊緣和軟骨下骨質增生為特征，在老年人群中最為常見[1]。2010年，我國有關該疾病發布的統計結果表明，60周歲以上人群中，患有該病的患者多達0.78億[2]。該病的最終致殘率為53%，是導致殘疾的主要原因之一[3]，且在我國多數地區均有發病[4-6]。

針灸治療該病臨床療效明確、便捷、經濟、無毒副作用[7]。軟骨細胞凋亡和細胞外基質降解是軟骨退變的主要誘因。目前研究表明，針刺主要通過抑制凋亡因子的表達減少軟骨細胞凋亡[8]。

本研究觀察深刺加電針法對兔膝骨關節炎的療效，包括形態學、軟骨細胞凋亡情況、酸離子敏感通道1(acid-sensing ion channel 1, ASIC1)的表達、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinases, p38MAPK)的磷酸化水平和凋亡因子p53表達，探討深刺加電針法治療骨關節炎的相關機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物

健康3月齡新西蘭大白兔40只，雌雄不拘，體質量(2.1±0.3) kg，由重慶醫科大學實驗動物中心提供。動物生產許可證SYXK(渝)2012-0001，質量合格證0002541。實驗過程中對動物的處置符合中華人民共和國科學技術部頒發的“關于善待實驗動物的指導性意見”的要求。

將新西蘭兔編號1～40，在隨機數表，任意指定20 行20列，從左到右依次讀取40個兩位的隨機數字，按隨機數的大小順序排列，如果隨機數相同，按先后順序，先出現的為小。序號為1～10對應正常組(A 組)，11～40對應造模組。

1.2主要試劑及儀器設備

Anti-ASIC1、Anti-p38MAPK磷酸化、Anti-p53：北京博奧森生物科技有限公司。二抗：北京康為生物試劑公司。多聚甲醛：天津市福晨化學試劑廠。注射用青霉素鈉：西南藥業股份有限公司，國藥準字H50020196。常規手術器械：上海手術器械廠。H-7500透射電鏡：HITACH。pH電子測量筆：美國優特公司。電子天平、雙蒸水儀器、離心機：長沙湘儀離心機儀器有限公司。電泳儀、石蠟切片機：LEICA。BX51TF光學生物顯微鏡：OLYMPUS。Gel Doc 2000凝膠成像系統：BIO-RAO。DR3000數字放射成像系統：柯達公司。

1.3模型建立

造模組采用Hulth-Telhag法[9]復制兔膝關節炎模型。3%戊巴比妥鈉1 ml/kg耳緣靜脈注射麻醉，仰臥于手術臺上固定。左側膝關節備皮，常規消毒，鋪無菌巾，取關節內側長2～3 cm縱切口，切斷并剔除內側副韌帶組織0.5 cm。組織剪平行于關節間隙進入關節腔，探查關節腔內無原發病變后切斷前后交叉韌帶；組織剪平行進入半月板和平臺間隙，完整切除內側半月板，注意勿傷及關節軟骨面。行抽屜實驗陽性后，沖洗消毒關節腔。逐層縫合，無菌敷料包扎切口處，不予固定。

術后分籠飼養，肌注青霉素4×104U，每天1次，共7 d。每天驅趕新西蘭兔活動1 h，連續6周。

A組不予任何處理。

6周對造模組左右后肢行X線檢測。滿足以下標準表明造模成功：關節間隙狹窄、骨贅形成、軟骨下骨改變、膝關節對線不良。所有造模兔均造模成功(圖1)。X線檢測在重慶醫科大學附屬第一醫院放射科進行。檢測參數：照射電壓60 kV，照射電流250 mA，照射量32 mAs，照射時間128 ms。

1.4分組及治療

將造模成功的30只兔根據體重平均分為3組，每個區組編號1～3，再將每個區組中的實驗兔編號1～ 10，然后從隨機數表中任意選取一開始點，從左到右依次讀取30個1位隨機數字，按區組順序和區組中實驗兔順序賦給每只實驗兔，最終分為B組、C組、D組，每組10只。

C組動物四肢捆綁仰臥位固定行針刺。取內外膝眼、足三里、梁丘、血海、陰陵泉。內外膝眼用1.0寸毫針，向關節腔內斜刺進針0.8～1.0寸，針刺抵骨后停止進針；足三里穴較普通電針法更靠近脛骨邊緣，貼骨進針，提插捻轉1 min；梁丘與血海穴用1.5寸毫針斜刺進針，直刺至股骨，針尖穿過股骨骨膜，透刺血海。

D組同法針刺，取穴相同。各穴均用0.5寸針灸針，提插捻轉，針刺深度不抵骨、不貼骨。

C組和D組均以電針儀通電留針20 min，一組電極連接內外膝眼，另一組電極連接同側足三里和陰陵泉，疏密波，頻率1.6～2 Hz，強度以保持針柄輕度震顫為度(電流強度1～3 mA，電壓4～6 V)。

A組和B組同法抓取捆綁動物。

各組均每周治療5 d，休息2 d，共4周。

圖1　兔膝關節X線正側位片

1.5檢測方法

1.5.1pH測定

用5 ml一次性注射器抽取關節液，20℃下用pH值電子測量筆(精確到0.1)測量關節液pH值。

1.5.2透射電鏡檢測

各組運動治療后，3%戊巴比妥鈉1 ml/kg麻醉，解剖左后肢膝關節，切取脛骨平臺關節面半月板和軟骨，分為2份，一份立即放入液氮保存，一份取部分組織切成3塊1×1×1 mm立方體，迅速置于2.5%戊二醛保存，其余組織置于4%多聚甲醛固定。置于2.5%戊二醛的標本送重慶醫科大學生命科學院電鏡室切片，鉛鈾雙重染色，于透射電鏡下觀察。

1.5.3HE及TUNEL染色

置于4%多聚甲醛的標本固定72 h，常規脫水、透明，石蠟包埋，連續冠狀切片，厚5 μm，行HE染色和TUNEL染色。光鏡下觀察。

TUNEL染色后，凋亡軟骨細胞呈棕黃色顆粒，正常軟骨細胞呈藍色顆粒。選取5個凋亡細胞數最多的高倍視野(400×)，計算500個細胞中陽性細胞所占的百分比(凋亡指數)。

1.5.4Western blotting

取液氮保存的軟骨約40 mg，PBS緩沖液冰水浴勻漿，加RIPA蛋白裂解液，4℃1200 r/min離心10 min，取上清液，BCA蛋白定量法檢測蛋白濃度。取蛋白樣品50μg上樣；行SDS-PAGE凝膠電泳：5%濃縮膠恒壓100 V，約20 min；10%分離膠恒壓120 V，約90 min。轉膜至PVDF膜上；5%脫脂牛奶室溫搖動封閉4 h，分別滴加ASIC1、p38MAPK、p53一抗(1∶1000)，4℃孵育過夜，37℃復溫30 min；滴加HRP標記的二抗(1∶1000)，37℃孵育1 h。凝膠成像系統成像，以GAPDH為內參，以Quantity One 4.6圖像分析軟件進行相對灰度分析。

1.5.5免疫組化染色

取置4%多聚甲醛的標本固定24 h后，常規脫水、透明，石蠟包埋，連續冠狀切片，厚5 μm。常規脫蠟1.5～2 h，枸櫞酸緩沖液修復抗原，加入3% H2O2，正常山羊血清封閉，滴加ASIC1一抗(1∶50)，生物素化二抗工作液，辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，DAB顯色，蘇木素復染，脫水，透明，封片。用PBS代替一抗做陰性對照。

1.6統計學分析

所有數據采用SPSS 17.0統計軟件進行分析。檢測數據均以(±s)表示。經方差齊性和正態性檢驗服從正態分布，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。顯著性水平α=0.01。

2　結果

2.1pH

C組、D組pH明顯高于B組(P<0.01)；C組明顯高于D組(P<0.01)；C組與A組無顯著性差異(P= 0.11)。見表1。

2.2透射電鏡

A組細胞呈卵圓形，胞質內有豐富的粗面內質網和高爾基體、線粒體，胞漿內微絲豐富，環繞細胞核；細胞核完整類圓形，居細胞中央；未見細胞器水腫裂解及細胞核裂解，軟骨陷窩清晰(圖2)。B組細胞形態不規則，網膜溶解斷裂，線粒體腫脹，胞漿內可見空洞；細胞核形態不規則，核內異染質較多(圖2)。C組軟骨細胞略萎縮，胞漿核完整，表面有許多微小突起，線粒體散在分布，核內染色質分布均勻(圖2)。D組軟骨細胞萎縮，胞核有溶解趨勢，線粒體腫脹不

明顯，線粒體分布相對均勻(圖2)。

圖2　各組膝關節軟骨軟骨細胞觀察

2.3HE染色

A組膝關節軟骨細胞排列均勻整齊，無增生，軟骨細胞形態正常，細胞核居中，胞質均勻(圖3)；B組軟骨細胞排列紊亂，粗糙不平，胞質中空泡明顯，細胞核被壓縮(圖3)；C組和D組軟骨細胞排列較整齊，胞質無明顯異常空泡，胞質均勻，細胞核居中(圖3)。

2.4TUNEL染色

各組凋亡指數由低到高依次為A組=C組

2.5Western Blotting

A組、C組和D組p38MAPK、ASIC1、p53表達均明顯低于B組(P<0.01)，C組明顯低于D組(P< 0.01)；C組ASIC1(P=0.018)和p53(P=0.031)與A組無顯著性差異；C組p38MAPK明顯高于A組(P<0.01)。見表1。

2.6免疫組化染色

C組、D組ASIC1散在陽性表達，著色較淺，明顯低于B組(P<0.01)；C組明顯低于D組(P<0.01)；C組與A組無顯著性差異(P=0.746)。見圖5、表1。

圖3　各組軟骨組織HE染色(200×)

圖4　各組軟骨組織TUNEL染色(40×)

圖5　各組軟骨組織ASIC1免疫組化染色(400×)

表1　各組測量參數比較

3　討論

OA是以關節軟骨退行性改變、繼發性骨質增生、關節間隙狹窄、滑膜炎癥增生為主要病理特征，以膝關節疼痛、腫脹、功能障礙為主要表現的常見疾病，是力學和生物學因素共同作用下，軟骨細胞、細胞外基質和軟骨下骨三者降解和合成偶聯失衡的結果。胞外酸度是關節軟骨基質代謝重要的調節劑，胞內酸中毒的直接作用可能是抑制基質合成代謝或者升高一些酶的活性[10]。

1980年，Krishtal等在神經元中首次發現酸誘導產生的膜電流，即ASICs，被認為是哺乳動物最重要的酸感受器；其中ASIC1可在軟骨細胞中表達，且對調控細胞外基質降解進，而影響細胞凋亡具有重要意義[11]。ASIC1對酸敏感度居中，表達量較高，占軟骨細胞中所有酸敏感離子通道的64%[12]。ASIC1屬于Ca2+滲透性酸離子敏感通道，胞外酸化激活ASIC1開放，可介導胞外Ca2+內流[13-14]。

p38MAPK是一種分布于胞質中，具有絲氨酸和酪氨酸雙重磷酸化能力的蛋白激酶，其信號轉導途徑是細胞外信號引起細胞內反應的通道之一，可被多種刺激因子激活，參與細胞的形成、生長、分化、凋亡等多種生理過程[15]。持續升高的胞質內Ca2+可以通過MAPKKK-MAPKK-MAPK通路激活p38MAPK，導致p38MAPK磷酸化[16]；之后將信號傳至細胞核內，介導相應的轉錄因子啟動基因轉錄。最近報道，p38MAPK可以誘導凋亡因子p53活化，軟骨細胞凋亡[17-19]。

正常情況下，關節液的pH為(8.5±0.3)[20]；關節炎狀態下，由于軟骨細胞無氧酵解以及周圍組織細胞產生炎癥因子，軟骨微環境酸化，局部pH降低[21-22]，影響關節軟骨細胞的代謝[23]。

綜上所述，軟骨組織酸化可引起軟骨細胞表達ASIC1，介導胞外Ca2 +內流；持續升高的Ca2 +導致p38MAPK磷酸化，最終誘導凋亡因子p53表達，引起軟骨細胞凋亡。這可能是導致OA發生或加重的重要誘因。

OA屬中醫學“痹癥”“骨痹”范疇，病機為筋骨衰疲、肝腎虧虛、經絡氣血痹阻，治療以補益肝腎、祛風散寒、活血化瘀、溫經通絡為法。

短刺法是治療OA的重要手段。短為接近之意，深刺至骨，上下摩骨，可使硬化腫脹的筋膜軟化，重新建立有效的血液循環，達到疏通經絡、活血消腫止痛的目的，具有扶正祛邪、調和陰陽的作用。該法治療骨關節炎副作用小，臨床有效[24-26]。本研究根據近部選穴原則選取內外膝眼，針體可以直接進入關節腔，作用于軟骨表面。足三里為足陽明胃經合穴，主治虛勞諸證、下肢痿痹；梁丘為胃經郄穴，主治怯寒癥、膝痛、浮腫等。血海、陰陵泉為脾太陰經穴，陰陵泉為該經合穴，主治肌痹、膝痛；血海具有活血化瘀，養血和血的功效，可治療膝關節疼痛。

本研究采用Hulth-Telhag法復制新西蘭兔KOA模型，運用深刺加電針法，緩慢進針，搖動針身使針深刺至骨，在骨旁或骨縫間作提插捻轉、搖動等“摩骨”手法。相比常規電針，能明顯升高關節液pH，減少ASIC1和p53表達，p38MAPK磷酸化水平降低，達到降低軟骨細胞凋亡，修復損傷軟骨組織的作用。與湯劍斌等觀察電針治療OA軟骨大體形態學變化一致[27]。這可能是深刺加電針法治療OA的機制之一。

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Effects of Deep Electroacupuncture on Cartilage in Knee Osteoarthritis Rabbits

FU Ni-ni1, LI Xue-zhi1, LIU Fei1, XI Xiao-fang1, REN Yi2, YANG Xiao-guang1, ZHANG Yu2
1. College of Traditionl Chinese Medicine, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China; 2. Central Hospital of Hanzhong, Hanzhong, Shaanxi 723000, China
Correspondence to LI Xue-zhi. E-mail: lixz999@126.com

Abstract:Objective To observe the effects of deep electroacupuncture on carlilage tissue in knee osteoarthritis (KOA) rabbits. Methods 40 New Zealand rabbits were randomly divided into normalgroup (A, n=10) and modelgroup (n=30). The modelgroup was modeled KOA with Hulth-Telhag way, and identified with X-ray. Then they were divided into no-treatedgroup (B, n=10), deep electroacupuncturegroup (C, n=10) and routine electroacupuncturegroup (D, n=10) randomly. Thegroups C and D accepted electroacupuncture since 6 weeks after modeling, for 4 weeks. They were measured with pH of joint fluid, observed structure and pathology of cartilage under transmission electron microscope, detected apoptosis index, and determined the expression of acid-sensing ion channel 1 (ASIC1), p38 mitogen-activated protein kinases (p38MAPK) and p53 with Western blotting, and distribution of ASIC1 with immunohistochemistry in cartilage tissue. Results The pHs of joint fluid from high to low were ranged as thegroups A=C>D>B (P<0.01). The cartilage structure was more complete in thegroups A, C and D than in thegroup B. The apoptosis rates from less to more were ranged as thegroups A=C

Key words:knee osteoarthritis; electroacupuncture; deep acupuncture; apoptosis; acid-sensing ion channel 1; p38 mitogen-activated protein kinases; p53; rabbits

(收稿日期：2015-09-17修回日期：2015-11-09)

[中圖分類號]R684.3

[文獻標識碼]A

[文章編號]1006-9771(2016)01-0038-08

基金項目：重慶市衛生和計生委中醫藥科技項目(No.ZY201402117)。

DOI:10.3969/j.issn.1006-9771.2016.01.008