正交實驗優化新疆沙棘果渣總黃酮的提取工藝

帕塔爾·尼牙孜，邱遠金，王婷媛，朱國強，賈曉光，蔡永國(.新疆大學生命科學院，烏魯木齊　80049；.新疆維吾爾自治區中藥民族藥研究所，烏魯木齊　8000；新疆慧華沙棘生物科技有限公司，阿勒泰　8600)

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正交實驗優化新疆沙棘果渣總黃酮的提取工藝

帕塔爾·尼牙孜1，邱遠金2*，王婷媛2，朱國強2，賈曉光2，蔡永國3(1.新疆大學生命科學院，烏魯木齊830049；2.新疆維吾爾自治區中藥民族藥研究所，烏魯木齊830002；3新疆慧華沙棘生物科技有限公司，阿勒泰836200)

摘要：目的對新疆青河縣沙棘果渣中總黃酮的提取工藝進行正交優化。方法通過單因素實驗，確定實驗因素與水平；采用正交實驗設計法優化沙棘果渣總黃酮的提取工藝條件。結果最佳工藝條件：乙醇體積分數為50%，提取時間為1.5 h，料液比為1∶20，提取3次。在此優化條件下,沙棘果渣總黃酮含量可達53.73 mg·g-1。結論新疆青河縣沙棘果渣總黃酮含量高。優化了沙棘果渣總黃酮提取工藝，工藝操作簡單，提取率高，為產業化生產提供指導和理論依據。

關鍵詞：沙棘；沙棘果渣；總黃酮；正交實驗

沙棘(HippophaerhamnoidesL.) 為胡頹子科(Elaeagnaceae)酸刺屬的灌木或小喬木，又名沙棗、醋柳果、酸刺、黑刺、酸溜溜，在我國分布廣泛[1]。我國是世界上沙棘資源最豐富的國家，占全世界沙棘資源的99%以上[2]。新疆擁有豐富的沙棘資源，南北疆均有分布，由于光熱資源豐富，其果實、葉中富含多種生物活性物質與營養成分[3]。沙棘的果實、葉子和果渣中均含有豐富的黃酮類化合物[4]。沙棘具有緩解心臟疾病、保肝、改善血液循環、治療咳嗽、免疫調節特性、抗氧化、抑制血小板聚集等多種功能[5]，并富含不同的生物活性物質，包括黃酮類、不飽和脂肪酸、甾醇、礦物質、茶多酚、維生素E、類胡蘿卜素等[6]。沙棘果汁、沙棘油等沙棘產品的生產帶來經濟效益的同時，也產生了沙棘資源的浪費和環境污染等安全隱患。研究正交實驗設計法優化沙棘果渣總黃酮的提取工藝條件，建立優化的沙棘果渣總黃酮提取工藝，指導對沙棘果渣黃酮類產品的研究開發和利用，對促進沙棘相關產業經濟發展和生態保護具有重要意義。

1儀器與試藥

1.1儀器紫外分光光度計(BECKMAN Du-7)；旋轉蒸發器RE-3000；恒溫水浴鍋(上海亞榮生化儀器廠)；KQ5200DA型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；酒精計(冀州市耀華器械儀表廠)；電子天平(上海科學儀器儀表有限公司)。

1.2試藥沙棘果渣(新疆慧華沙棘生物科技有限公司提供)；蘆丁對照品(批號11040，中國食品藥品檢定研究院)；乙醇(天津市百世化工有限公司)。

2方法

2.1沙棘果渣黃酮的提取取沙棘果渣2 g，精密稱定，加入體積分數為60%的乙醇30 mL，加熱回流提取2 h，冷卻至室溫，濾過，殘渣分別再加入體積分數為60%的乙醇25 mL，回流提取2次，每次1 h，濾過，合并濾液，置于100 mL量瓶中，殘渣用體積分數為60%的乙醇洗滌，洗液并入量瓶中，用體積分數為60%的乙醇定容至刻度，搖勻，測定總黃酮的含量。

2.2總黃酮的測定方法采用硝酸鋁絡合分光光度法測定黃酮含量[7]。

2.2.1標準曲線的繪制取蘆丁對照品20 mg，精密稱定，用體積分數為60%的乙醇定容至100 mL，備用。精密量取對照品液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0和6.0 mL，分別置于25 mL量瓶中，各加入體積分數為30%的乙醇至6.0 mL，加質量濃度為50 g·L-1的亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，放置6 min，再加質量濃度為100 g·L-1的硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加1 mol·L-1的氫氧化鈉試液10 mL，再加體積分數為30%的乙醇至刻度，搖勻，放置15 min，以相應的試劑為空白對照，按照紫外-可見分光光度法(附錄ⅤA)，在500 nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標、總黃酮質量濃度為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程：Y=11.313X-0.005 4(X：質量濃度，mg·mL-1；Y：吸光值)，r= 0.999 6。

2.2.2沙棘果渣黃酮含量的測定取沙棘果渣提取液1 mL，置于25 mL量瓶中，按照上述標準曲線制作的方法測定吸光度，根據標準曲線方程計算質量濃度C(mg·mL-1)，由質量濃度計算沙棘果渣總黃酮提取量(mg·g-1)。

2.3單因素實驗

2.3.1乙醇體積分數對黃酮提取量的影響取1 g沙棘果渣8份，精密稱定，按料液比1∶20，分別加入體積分數為20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%和90%的乙醇溶液，精密稱定，水浴加熱回流，提取1次，2 h。提取結束后，放冷，稱定，加相應體積分數的乙醇補足減失的量，過濾，測定總黃酮含量，平行3次測定，取平均值。

2.3.2料液比對黃酮提取量的影響取1 g沙棘果渣5份，精密稱定，乙醇體積分數為60%，分別以1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50的料液比，水浴加熱回流提取1次，2 h。提取結束后，放冷，稱定，加相應體積分數乙醇補足減失的量，過濾，測定總黃酮含量，平行測定3次，取平均值。

2.3.3提取時間對黃酮提取量的影響取1 g沙棘果渣5份，精密稱定，乙醇體積分數為60%，料液比為1∶35，分別水浴加熱回流提取1，2，3，4和5 h，1次。提取結束后，放冷，稱定，加相應體積分數的乙醇補足減失的量，過濾，測定總黃酮含量，平行測定3次，取平均值。

2.3.4提取次數對黃酮提取量的影響取1 g沙棘果渣4份，精密稱定，乙醇體積分數為60%，料液比為1∶35，分別水浴加熱回流提取1，2，3和4 次，2 h。提取結束后，放冷，稱定，加相應體積分數的乙醇補足減失的量，過濾，測定總黃酮含量，平行測定3次，取平均值。

2.4正交實驗設計分析根據單因素實驗結果，選取乙醇體積分數、提取時間、料液比和提取次數4個因素，以黃酮提取量為考察指標設計實驗，因素及水平見表1。

表1正交實驗因素與水平

Tab.1Factors and levels in the orthogonal experimental design

水平A．乙醇體積分數/%B．提取時間/hC．料液比/g·mL-1D．提取次數/次15011∶20126021∶25237031∶303

3結果與分析

3.1乙醇體積分數對沙棘果渣黃酮提取量的影響結果表明，沙棘果渣黃酮提取量隨著乙醇體積分數的增加而增加，當乙醇體積分數為60%時達到最大。當乙醇體積分數增加到60%之后，沙棘果渣總黃酮提取量有所下降。黃酮類化合物種類多，結構各異。黃酮類化合物的溶解特性因極性不同而有差異。沙棘果渣黃酮類化合物中含有多種成分，有苷元類物質也有黃酮苷類物質，選擇合適的乙醇體積分數有利于最大程度地提取沙棘果渣總黃酮。

3.2料液比對沙棘果渣黃酮提取量的影響結果表明，沙棘果渣黃酮提取量隨著料液比的增加而增加，料液比為1∶35時達到最大值。當料液比增加到1∶35之后，其增加量對黃酮提取量的影響不大。料液比越大溶劑用量越大，有利于黃酮的溶出，但當達到最大的溶解度后黃酮類化合物基本提取完全，黃酮提取量不再增加，繼續增加料液比會造成溶劑和能源的浪費。

3.3提取時間對沙棘果渣黃酮提取量的影響結果表明，隨著提取時間的增加，沙棘果渣黃酮提取量增加，提取時間為2 h時達到最大值。因此，提取時間的增加對沙棘果渣黃酮提取量影響不大。

3.4提取次數對沙棘果渣黃酮提取量的影響結果表明，沙棘果渣黃酮提取量隨著提取次數的增多而增加，提取次數為4次時達到最大值。當提取次數為3次之后，沙棘果渣黃酮提取量緩慢增加，但對提取量的影響不大。

3.5正交實驗設計分析選取乙醇體積分數、料液比、提取時間和提取次數進行正交實驗設計。按照4因素3水平正交實驗進行9次實驗，每次實驗平行2次。正交實驗安排和結果見表2。方差分析結果見表3。

表2L9(34)正交實驗結果

Tab.2 Results of L9(34) orthogonal experiment

項目ABCD黃酮提取量/mg·g-11111136．29092122219．13913133350．76574212344．78535223131．61516231218．53627313218．00478321343．03019332134．0289K135．39933．02732．61933．978K231．64631．26132．65118．560K331．68834．44433．46246．194R3．7533．1830．84327．634

表3方差分析結果

Tab.3 Results of variance analysis

因素偏差平方和自由度F比F臨界值顯著性A27．856220．34819．000*B15．250211．14019．000C1．36921．00019．000D1150．5622840．44019．000*誤差1．3702

注：差異顯著，*P<0.05；差異極顯著，**P<0.01。

對正交實驗結果進行極差分析，極差R的大小顯示影響因素的主次，由R值大小可知，不同因素對沙棘果渣黃酮提取量的影響程度不同。表2表明，沙棘果渣總黃酮提取率的影響因素大小順序為:提取次數(D)>乙醇體積分數(A)>提取時間(B)>料液比(C)。由表3可知，正交實驗方差分析有顯著性差異。提取次數和乙醇體積分數對提取量有顯著的影響。提取時間和料液比沒有顯著影響。

綜合單因素和正交實驗結果分析，最佳提取工藝參數為:乙醇體積分數為50%，提取時間為1.5 h，料液比為1∶20，提取3次。

3.6重復驗證實驗為進一步考察上述優選工藝條件的穩定性，按照最佳工藝條件：乙醇體積分數為50%，提取時間為1.5 h，料液比為1∶20，提取3次，進行5個平行實驗，對最佳提取工藝進行驗證。結果表明，在最佳工藝條件下沙棘果渣總黃酮含量可達53.73 mg·g-1。

4結論

通過研究單因素實驗，確定實驗因素與水平。乙醇是對人體無害的提取劑，選擇合適的乙醇體積分數能有效地提取活性成分。在生產中，提取時間過短，黃酮類化合物不能完全溶解在提取劑中，時間過長則會耗時耗資。同樣料液比和提取次數的增加會提高生產成本，延長生產周期，消耗資源。本實驗研究建立的沙棘果渣總黃酮提取工藝，操作簡單，提取率高，對青河縣沙棘果渣黃酮新技術、新方法、新工藝的研究提供了基礎數據，同時也為我國沙棘果渣資源的充分利用、研究開發和產業化生產提供了依據。

從對我國沙棘資源的利用角度來說，新疆青河縣沙棘果渣總黃酮的提取工藝研究范圍相對小，種類單一，應進一步擴大對其他地區和不同品種的沙棘進行深入研究。新疆氣候條件比較特殊，沙棘的品種和其活性成分的含量與其他地區有差異。建議進一步加大對不同地區沙棘活性成分的提取研究，更進一步了解對活性成分提取的影響因素，實驗工藝條件應做到符合實際生產。

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Optimization of extraction procedure of flavonoids from Xinjiang seabuckthorn residues using orthogonal experiment

Pataer NIYAZI1，QIU Yuanjin2*，WANG Tingyuan2，ZHU Guoqiang2，JIA Xiaoguang2，CAI Yongguo3(1.College of Life Sciences，Xinjiang University，Urumqi 830049，China；2.Xinjiang Uygur Autonomous Region Chinese Medicine and Ethnic Medicine Research Institute，Urumqi 830002，China；3.Xinjiang Huihua Seabuckthorn Biological Science and Technology Limited Company， Aletai 836200，China )

Abstract:Objective To study on the optimal extraction procedure of flavonoids from the residues of seabuckthorn cultivated in Qinghe county，Xinjiang. Methods The experimental factors and levels were designed by an orthogonal experimental design method. Results The optimal conditions for extracting flavonoids from seabuckthorn residues were as follows: 50% ethanol volume fraction，1.5 h extraction time，1∶20 liquid-to-solid ratio，three times of extraction. Under these optimized conditions，the extraction ratio of flavonoids could reach up to 53.73 mg·g-1. Conclusion Flavonoids content is high in the residues of seabuckthorn cultivated in Qinghe county，Xinjiang.The optimized extraction procedure is executable with high extraction ratio.

Key words:seabuckthorn；seabuckthorn residues；flavonoids；orthogonal experiment

(收稿日期：2015-06-23)

*通信作者：邱遠金，男，助理研究員

作者簡介：帕塔爾·尼牙孜，男，碩士研究生

基金項目：新疆維吾爾自治區公益性科研項目(編號：KY2015126)

中圖分類號：R284

文獻標志碼：A

文章編號：1004-2407(2016)02-0119-03

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.02.003