瓊脂糖- Zn（II）親和層析分離純化羅非魚水解多肽初探

張錦捷，曾慶祝（廣州大學化學化工學院，廣東廣州510006）

?

瓊脂糖- Zn（II）親和層析分離純化羅非魚水解多肽初探

張錦捷，曾慶祝*
（廣州大學化學化工學院，廣東廣州510006）

摘要：以廣州大學生化課題組自制瓊脂糖微球為載體、環氧氯丙烷（ECH）為活化劑、亞氨基二乙酸（IDA）為螯合配基、Zn（II）為螯合金屬制備瓊脂糖-Zn（II）親和層析介質。最佳活化工藝：DMSO 6 mL、ECH 10 mL、活化溫度35℃、活化時間3.0 h；最佳螯合工藝：IDA 0.9 g、反應時間4.0 h、ZnSO4濃度0.25 mol/L，Zn2+螯合量達到最大值。通過用0.05 mol/L EDTA緩沖液洗脫，有效地分離純化羅非魚水解多肽，得到適合與Zn（II）螯合的目標多肽組分，并制備出多肽-Zn（II）配合物。

關鍵詞：瓊脂糖-Zn（II）；金屬螯合親和層析（IMAC）；多肽；分離純化；多肽-Zn（II）

定化金屬螯合親和層析（Immobilized Metal Ion AffinityChromatography，IMAC）是由PorathJ等[1]于1975年首次提出，利用蛋白質表面暴露的一些氨基酸殘基與載體上的金屬離子之間相互作用而進行的分離純化技術。某些蛋白質或氨基酸對一些過渡態金屬離子如Cu2+、Zn2+、Mn2+等具有特異親和力，因此可以根據金屬螯合物與蛋白質的親和力不同，選擇性地分離純化蛋白質[2-3]。由于IMAC的配基簡單、吸附量大、交換載量大、分離條件溫和、通用性強等特點而被廣泛應用于蛋白質等生物工程產品的分離純化，逐漸成為最有效的技術之一[4-5]。

羅非魚魚肉含有多種不飽和脂肪酸和豐富的蛋白質，具有高蛋白、低脂肪，營養全面豐富、容易被人體吸收等特點[6-7]。肽類是氨基酸通過肽鍵結合連接形成的化合物，其實質可以看作是構成蛋白質的片段，肽類作為生命活動的調節物質，擔負著十分重要的角色[8]。鋅是人體必需微量元素，是多種酶的成分或酶的激活劑，對機體的生長發育、組織再生、增強免疫功能等多方面都有重要作用。研究已經發現，多肽比氨基酸更易被人體吸收，而且微量元素（鋅）可以通過肽轉運系統來轉運，具有毒性更小、易消化吸收、生物活性高等特殊優點，開發價值較大[9-10]。歐洲食品安全局（EFSA）和動物營養科學委員會（SCAN）的相關部門對氨基酸-鋅螯合物[Zn（x）1-3·nH2O，其中，x=大豆蛋白水解得到的多肽或氨基酸陰離子，分子量不超過1 500 Da]進行了系統評估，認為氨基酸-鋅螯合物是一種安全的有效鋅資源，可以應用于所有畜禽的飼料中，并且氨基酸-鋅螯合物的使用對環境和水質都不會產生負面的影響，并建議將氨基酸-鋅螯合物應用于飼料添加劑中[11-12]。

本研究以瓊脂糖為原料制備微球，以環氧氯丙烷為活化劑進行活化，再以亞氨基二乙酸為螯合活性介質與Zn（II）進行螯合制備瓊脂糖-Zn（II）親和層析介質，并初步探究將該介質用于分離純化羅非魚水解多肽，篩選出適合與Zn（II）螯合的多肽組分，并制備得到多肽-Zn（II）配合物。

1材料與方法

1.1試劑

瓊脂糖：西班牙BIOWEST公司；液體石蠟、司班80（Span80）、乙酸乙酯、石油醚、NaOH、環氧氯丙烷（ECH）、二甲基亞砜（DMSO）、亞氨基二乙酸（IDA）、硫酸鋅：所用試劑均為分析純，購自天津市致遠化學試劑有限公司。

1.2儀器

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鞏義市予華儀器有限責任公司；JJ-6數顯六聯電動攪拌器、THZ-82水浴恒溫振蕩器：金壇市華歐實驗儀器廠；HH-4C數顯恒溫水浴鍋：金壇市鴻科儀器廠；HL-2S恒流泵、HD-5電腦紫外檢測儀：上海滬西分析儀器廠有限公司。

1.3方法

1.3.1瓊脂糖-Zn（II）親和層析介質的制備

1.3.1.1微球的制備

稱取一定量瓊脂糖加入蒸餾水中，水浴加熱至95℃使之溶解；在燒杯中分別加入液體石蠟、Span80、乙酸乙酯，攪拌約20 min后，緩慢加入上述瓊脂糖溶液，用恒溫水浴鍋將體系升溫至42℃，在420 r/min速度下攪拌30 min；攪拌結束后于迅速降溫，常溫放置6 h；抽濾，用石油醚、無水乙醇洗滌后再用蒸餾水反復沖洗，抽干，收集備用。

1.3.1.2微球的活化

稱取一定量上述制得的微球，依次加入一定量的DMSO、ECH、NaOH溶液，將上述混合液置于35℃的恒溫水浴中振蕩反應2 h；反應結束后用蒸餾水反復沖洗，直至濾液中無環氧基檢出，抽干，收集備用。

1.3.1.3配基的鍵合

稱取一定量活化后的微球，加入一定量DMSO/ IDA混合溶液，在恒溫水浴振蕩器中進行反應，反應結束后用蒸餾水反復沖洗，抽干，收集備用。

1.3.1.4鋅離子的螯合

稱取一定量鍵合配基后的微球，加入適量ZnSO4溶液，在常溫下振蕩反應一段時間，反應結束后用蒸餾水反復沖洗，抽干，即得瓊脂糖-Zn（II）親和層析介質。

1.3.2環氧基修飾密度的定量分析

環氧基修飾密度采用硫代硫酸鈉滴定法[13]測定。稱取0.5 g活化后的微球于磨口錐形瓶中，加入約5 mL 1.3 mol/L硫代硫酸鈉與1滴~2滴酚酞指示劑，在室溫下振蕩反應30 min后用0.01 mol/L鹽酸標準溶液滴定，根據消耗的鹽酸標準溶液的體積，由式（1）計算環氧基修飾密度：

式中：S為環氧基修飾密度，mmol/g；MHCl為HCl的濃度，mol/L；V0、V1為滴定前、后HCl的體積，mL；W為介質的質量，g；ρ為介質的密度，g/mL。

1.3.3 Zn2+螯合量的測定[14]

稱取一定量鍵合配基后的微球，加入25 mL ZnSO4溶液，在常溫下振蕩反應一段時間，反應結束后抽濾，收集濾液并定容至一定體積，用原子吸收分光光度計在324.7 nm處測定濾液的吸光值，再根據標準曲線即可計算Zn2+螯合量。

1.3.4羅非魚水解多肽的制備

稱取適量的魚靡，以1∶3（g/L）固液比加去離子水混勻，在55℃水浴預熱5 min，加入堿性蛋白酶，調節pH為9、溫度為55℃，水解1.5 h，水解結束后在100℃水浴滅活、冷卻、離心、抽濾、超濾、濃縮備用。

1.3.5分離純化

將制得的瓊脂糖微球與瓊脂糖-Zn（II）親和層析介質分別裝柱（1.0 cm×40 cm），用5倍體積蒸餾水平衡；加入2 mL上述制得的多肽液，繼續用蒸餾水平衡，同時用電腦紫外檢測儀監測，控制流速為1 mL/min；用蒸餾水洗脫至吸光度回歸基線后，改用0.05 mol/L EDTA緩沖液洗脫，收集洗脫峰，超濾管脫鹽濃縮，干燥后收集備用。

1.3.6多肽-Zn配合物的制備

取一定量分離純化后的多肽配成多肽液與適量ZnCl2溶液混合，調節pH，在一定溫度下反應一段時間；加入無水乙醇后產生沉淀，離心后收集沉淀物，干燥，收集備用。

2結果與分析

2.1活化條件的考察

2.1.1 DMSO用量對環氧基修飾密度的影響

其他條件不變，分別加入2、4、6、8、10 mL DMSO進行反應，結果如圖1所示。

圖1 DMSO用量對環氧基修飾密度的影響Fig.1 Effect of DMSO dosage on epoxy group density

由圖1可知，DMSO在反應中起到促進活化的作用，它能消除環氧氯丙烷與瓊脂糖微球在溶液中形成的相界面。隨著DMSO用量增加，環氧基修飾密度先增大后減小；當DMSO用量為6 mL時，環氧基修飾密度達到最大值。

2.1.2 ECH添加量對環氧基修飾密度的影響

其他條件不變，分別加入4.0、6.0、8.0、10、12 mL ECH進行反應，結果如圖2所示。

圖2 ECH添加量對環氧基修飾密度的影響Fig.2 Effect of ECH dosage on epoxy group density

由圖2可知，環氧基修飾密度隨著ECH添加量的增加而增大，當添加量為10 mL時，環氧基修飾密度趨于平穩，繼續增大ECH添加量，環氧基修飾密度無明顯增加。

2.1.3活化溫度對環氧基修飾密度的影響

其他條件不變，活化溫度分別為30、35、40、45、50℃，結果如圖3所示。

由圖3可知，溫度對環氧基修飾密度影響較大，溫度過高時環氧基修飾密度下降趨勢明顯，可能由于溫度過高會導致部分環氧基開環；當活化溫度為35℃時環氧基修飾密度達到最大值。

圖3活化溫度對環氧基修飾密度的影響Fig.3 Effect of activation temperature on epoxy group density

2.1.4活化時間對環氧基修飾密度的影響

其他條件不變，活化時間分別為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h，結果如圖4所示。

圖4活化時間對環氧基修飾密度的影響Fig.4 Effect of activation time on epoxy group density

由圖4可知，環氧基修飾密度隨時間增加先增大后減小，在3.0 h時達到最大值。這是由于環氧基在堿性條件下會發生開環反應，時間越長開環越嚴重，導致環氧基修飾密度下降。

2.2螯合條件的考察

2.2.1 IDA用量對Zn2+螯合量的影響

其他條件不變，分別加入0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 g IDA進行反應，結果如圖5所示。

圖5 IDA用量對Zn2+螯合量的影響Fig.5 Effect of IDA dosage on the adsorption of Zn2+

由圖5可知，Zn2+螯合量隨著IDA用量的增加而增大，當IDA用量為0.9 g時，Zn2+螯合量趨于平穩，說明反應已經達到平衡。

2.2.2反應時間對Zn2+螯合量的影響

其他條件不變，反應時間分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 h，結果如圖6所示。

圖6反應時間對Zn2+螯合量的影響Fig.6 Effect of activation time on the adsorption of Zn2+

由圖6可知，隨著反應時間的增加，Zn2+螯合量先增大后減小，可能是部分已經與瓊脂糖反應的IDA在堿性條件時間過長而降解，最終連接在介質上的IDA減少而導致Zn2+螯合量減小。

2.2.3 ZnSO4濃度對Zn2+螯合量的影響

其他條件不變，ZnSO4濃度分別為0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mol/L，結果如圖7所示。

圖7 ZnSO4濃度對Zn2+螯合量的影響Fig.7 Effect of ZnSO4concentration on the adsorption of Zn2+

由圖7可知，隨著ZnSO4濃度增大，Zn2+螯合量先增大后趨于平穩，在濃度為0.25 mol/L時，Zn2+螯合量達到最大值，反應達到平衡。

2.3瓊脂糖-Zn（II）親和層析圖譜分析

未螯合鋅離子的瓊脂糖微球層析圖譜如圖8所示。

層析過程只有一個峰值，在18 min左右出現峰值，說明開始有多肽被洗脫下來；在31 min左右峰值達到最大，且吸光度達到0.94；在50 min左右吸光度回歸基線再用0.05 mol/L EDTA緩沖液洗脫，無峰值出現；說明用蒸餾水已經將多肽全部洗脫下來，多肽未與瓊脂糖微球發生作用。

圖8瓊脂糖微球層析譜圖Fig.8 Chromatography spectra of sepharose microspheres

瓊脂糖-Zn（II）介質層析譜圖如圖9所示。

圖9瓊脂糖-Zn（II）介質層析譜圖Fig.9 Chromatography spectra of Sepharose-Zn（II）

層析過程出現兩個峰值，第一個峰值出現在18 min左右，在31 min左右峰值達到最大，與未螯合鋅離子的瓊脂糖微球層析圖譜出峰時間相同，且最大吸光度為0.89，比未螯合鋅離子的瓊脂糖微球層析圖譜的最大吸光度小，說明有部分多肽未被洗脫；在56 min左右吸光度回歸基線后再用0.05 mol/L EDTA緩沖液洗脫，在96 min左右出現第二個峰值，說明用0.05 mol/L EDTA緩沖液將未被洗脫的多肽組分洗脫下來，與第一個峰值吸光度較小解釋相吻合，即該多肽組分與瓊脂糖-Zn（II）介質發生了親和作用，為適合與Zn（II）螯合的目標多肽組分。

2.4多肽與多肽-Zn配合物紅外光譜分析

多肽與多肽-Zn配合物紅外光譜如圖10所示。

圖10多肽（a）與多肽-Zn（II）（b）紅外光譜圖Fig.10 FT-IR spectra of Peptide（a）and Peptide-Zn（II）（b）

由圖10多肽（a）與多肽-Zn（II）（b）紅外光譜圖可以發現，當多肽上的氨基酸殘基與金屬離子結合后，能觀察到多肽的紅外圖譜發生變化[15-16]。首先觀察光譜的官能團區，多肽（a）在3 349 cm-1處由酰胺的N-H的伸縮振動引起的一個寬吸收峰，在形成多肽-Zn（II）配合物（b）后移至較低波數3 294 cm-1處，紅移了54.50 cm-1。多肽（a）在2 959 cm-1處由-CH3伸縮振動引起的吸收峰，在多肽-Zn（II）配合物（b）中轉變到2 964 cm-1處，藍移了5.30 cm-1，強度也減弱了，并且多肽-Zn（II）配合物（b）在3 077 cm-1處出現了吸收峰，說明多肽與Zn（II）結合后，多肽的結構構型發生了改變。多肽（a）在1 650 cm-1附近有伸縮振動酰胺I帶的特征譜峰，這是由酰胺的C=O伸縮振動引起的。多肽與Zn （II）結合后，這個譜帶位置變換到了1 655 cm-1，藍移了5.30 cm-1。多肽（a）在1 596 cm-1處有一個吸收峰，可能是由C=N、C=C伸縮振動引起的，與Zn（II）結合后這個峰消失了。多肽（a）在多肽吸收帶1 400 cm-1處附近有伸縮振動酰胺III帶的特征譜峰，這是由酰胺的NH彎曲振動或C-N的伸縮振動引起的，在多肽-Zn（II）配合物（b）的吸收帶變換到1398cm-1，紅移了2.27cm-1。接著觀察光譜的指紋區，多肽（a）在1 113 cm-1和1 048 cm-1處分別有一個由C-O伸縮振動引起的特征峰，而多肽-Zn（II）配合物（b）中這兩個譜峰均消失了。多肽（a）在多肽吸收帶652 cm-1處有附近有一個由NH面外變形振動引起的寬吸收峰，在與Zn（II）結合后這個譜帶位置變換到669 cm-1，藍移了16.65 cm-1。以上這些結果表明分離純化得到的多肽是適合與Zn（II）螯合的目標多肽組分，多肽與Zn（II）的配合位置可能在N-H的氮原子與C=O或C-O的氧原子上。

3　結論

以瓊脂糖為原料制備微球，以環氧氯丙烷為活化劑進行活化，再以亞氨基二乙酸為螯合活性介質與Zn2+進行螯合制備瓊脂糖-Zn（II）親和層析介質，并對親和層析介質的活化與螯合過程的工藝參數進行優化。

1）活化工藝：DMSO與ECH的添加量分別為6 mL 和10 mL，在35℃下恒溫水浴振蕩反應3.0 h，環氧基修飾密度達到最大值。

2）螯合工藝：IDA用量為0.9 g，在恒溫水浴中反應4.0 h后與0.25 mol/L硫酸鋅溶液進行螯合，Zn2+螯合量達到最大值。

3）分離純化：通過對比未螯合鋅離子的瓊脂糖微球與瓊脂糖-Zn（II）親和層析圖譜，表明自制的瓊脂糖-Zn（II）親和層析介質能有效地分離純化羅非魚水解多肽，通過用0.05 mol/L EDTA緩沖液洗脫，得到適合與Zn（II）螯合的目標多肽組分，并制備出多肽-Zn （II）配合物，為制造出一種免疫增強和促進機體健康生長的生物活性物質—羅非魚蛋白多肽-Zn配合物作為飼料添加劑奠定基礎。

參考文獻：

[1] Porath J, Carlsson J, Olsson I, et al. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation[J]. Nature,1975, 258(5536): 598-599

[2] Chaga G S. Twenty -five years of immobilized metal ion affinity chromatography: past, present and future[J].J Biochem Bioph Methods.2001,49(12): 313-334

[3]邱雁臨,黎琛子,潘飛,等.金屬螯合親和層析分離純化谷胱甘肽(GSH)初探[J].中國釀造,2005,4(6):22-24

[4] Vladka G P, Viktor M. Perspectives of immobilized-metal affinity chromatography[J].Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 2001,49(1): 335-360

[5]宋超,吉愛國,梁浩.金屬螯合親和層析的應用研究進展[J].現代生物醫學進展,2008,8(6):1178-1180

[6]鞏育軍,郭先霞,李瑞偉,等.羅非魚營養成分研究進展[J].中國食物與營養,2009,11(2):50-52

[7]秦培文,李瑞偉,王輝,等.四種羅非魚肌肉氨基酸組成及營養價值評定[J].食品研究與開發, 2010,31(2): 173-176

[8]陳黎龍.綠色營養型飼料添加劑一生物活性肽[J].獸藥與飼料添加劑.2001,6(5):23-24

[9]蘇純陽,董仲華,香紅星.微量元素氨基酸(小肽)螯合物的研究應用進展[J].飼料工業,2002, 30(5):341-346

[10]曾慶祝,陳陸欣.多肽-鋅配合物的生物功能活性及安全性[J].現代食品科技,2013, 29(8):2035-2039

[11] EFSA Panel on Additives and Products or Substances used in Animal Feed (FEEDAP). Scientific Opinion on the safety of a zinc chelate of hydroxy analogue of methionineadditive for all species[J]. EFSA Journal, 2009, 7(11): 1381-1393

[12] European Food Safety Authority (EFSA). Scientific Opinion on safety and efficacy of zinc compounds (E6) as feed additives for all animal species[J]. EFSA Journal, 2012, 10(3): 2621

[13] Judith A Scoble, Robert K Scopes. Assay for determining the number of reactive groups on gels used in affinity chromatography and its application to the optimization of the epichlorohydrin and divinylsulfone activation reactions[J]. Journal of Chromatography A, 1996,752(7):67-76

[14]李煥德,張畢奎,朱運貴,等.原子吸收光譜法測定新制劑的含量[J].藥物分析雜志,1998, 18(3):180-182

[15]胡皆漢,鄭學仿.實用紅外光譜學[M].北京:科學出版社,2011: 314-328

[16] Houser RP, Fitzsimons M P, Barton J K. Metal -dependent intramolecular chiral induction: The Zn2 +complex of an ethidiumpeptide conjugate[J]. Inorganic chemistry, 1999, 38(6):1368-1370

[17]易喻,崔國艷,王鴻,等.一種新型殼聚糖分離介質的制備[J].化工進展,2011,30(9): 2049-2054

[18]崔國艷.以殼聚糖為載體適合于抗體分離的介質研究[D].杭州:浙江工業大學,2011:45-48

[19]祝驥,易喻,吳銀飛,等.金屬螯合親和層析法純化抗乙肝核心抗原單克隆抗體[J].生物工程學報,2009,25(5):1572-1578

[20]包海生,高秀峰,鄭雪妮,等.殼聚糖固定化離子親和層析法對重組乙醛脫氫酶的純化[J].釀酒科技,2012(2):27-29

Purification of Tilapia Hydrolysis Polypeptide by Sepharose-Zinc（II）Affinity Chromatography

ZHANG Jin-jie，ZENG Qing-zhu*
（College of Chemical Engineering，Guangzhou University，Guangzhou 510006，Guangdong，China）

Abstract：The Sepharose-zinc（II）affinity chromatography chelating with Zn（II）using self-made sepharose microspheres as substrate. The iminodiacetic acid（IDA）was attached onto chitosan microspheres activated by epichlorohydrin（ECH）. The results indicated that the optimal activation process was achieved at 10 mL epichlorohydrin as activating accelerator in the solution consisting of 6 mL DMSO at 35℃for 3.0 h. The study on linkaging of IDA demonstrated that the support was synthesized in the solution with 0.9 g IDA for 4.0 h，then synthesized in the solution with 0.25 mol/L ZnSO4whose adsorption of Zn2+was up to the maximum. The tilapia hydrolysis polypeptide had been effectively purified，then got the component which was suitable for chelating with Zinc（II）and the preparation of peptide-Zinc complexes by using 0.05 mol/L EDTA buffer.

Key words：sepharose-Zinc（II）；IMAC；polypeptide；purification；peptide-Zinc

收稿日期：2014-08-20

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.01.004

*通信作者：曾慶祝，男（漢），教授。

作者簡介：張錦捷（1989—），男（漢），碩士，研究方向：食品加工副產物的高值化利用。

基金項目：廣州市科技計劃項目（12C12011620）；廣州市科信局重大專項（2012Y2-00008）