甘蔗條紋花葉病毒HC-Pro、P3N-PIPO、CP和VPg基因酵母雙雜交誘餌表達載體的構建及自激活檢測

翟玉山,彭　磊,楊永慶,鄧宇晴,程光遠,鄭艷茹,徐景升

(農業部福建甘蔗生物學與遺傳育種重點實驗室,福建農林大學,福建 福州　350002)

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甘蔗條紋花葉病毒HC-Pro、P3N-PIPO、CP和VPg基因酵母雙雜交誘餌表達載體的構建及自激活檢測

翟玉山,彭磊,楊永慶,鄧宇晴,程光遠,鄭艷茹,徐景升

(農業部福建甘蔗生物學與遺傳育種重點實驗室,福建農林大學,福建 福州350002)

摘要：為探索甘蔗條紋花葉病毒與甘蔗的互作機制,利用酵母雙雜交技術篩選與SCSMV互作的甘蔗因子基因,利用PCR技術克隆了SCSMV的HC-Pro、P3N-PIPO、CP和VPg的編碼區,構建到酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7上,獲得了pGBKT7-HC-Pro、pGBKT7-P3N-PIPO、pGBKT7-CP 和pGBKT7-VPg4個誘餌載體。結果顯示,將重組質粒轉化酵母Y2HGold酵母菌株后,酵母菌株在SD/-Trp平板上生長良好,表明重組誘餌質粒表達產物對酵母細胞無毒性;在SD/-Trp/X-α-gal平板上長出白色菌落未變藍,在SD/-Leu、SD/-Trp/-Ade、SD/-Trp/-His和SD/-Trp/X-α-gal/AbA平板上不能生長,表明重組誘餌質粒表達產物對MEL1、ADE2、HIS3和AUR1-C報告基因無自激活作用。構建的誘餌表達載體可以作為誘餌用于文庫篩選,為探索SCSMV侵染機制和發病機理奠定了基礎。

關鍵詞：甘蔗條紋花葉病毒;HC-Pro;P3N-PIPO;CP;VPg;誘餌載體;酵母雙雜交

甘蔗(SaccharumofficinarumL.)是我國和全世界主要的糖料作物和能源作物。甘蔗花葉病(Sugarcane mosaic disease,SMD)是嚴重危害甘蔗生產的病毒性病害之一,嚴重影響甘蔗的產量和品質。甘蔗感病后,病株葉片出現黃綠相間的斑紋、分蘗減少、生長緩慢、節間變短、品質下降,產量損失可達3%~50%[1-3]。SMD最早于1892年在爪哇被發現[4],在20世紀20年代,SMD幾乎摧毀了阿根廷、巴西和美國的甘蔗產業[5-6]。甘蔗花葉病的病原主要有甘蔗花葉病毒(Sugarcanemosaicvirus,SCMV)、高粱花葉病毒(Sorghummosaicvirus,SrMV)和甘蔗條紋花葉病毒(Sugarcanestreakmosaicvirus,SCSMV)。其中SCMV和SrMV屬于馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)Y病毒屬(Potyvirus)。SCSMV于1978年在美國首次發現并報道[7],2012年被國際病毒分類委員會(International Committee on Taxonomy of Viruses,ICTV)歸為馬鈴薯Y病毒科禾草毒屬(Poacevirus)(http://www.ictvonline.org)。SCSMV主要分布在中國、孟加拉、印度、日本、印度尼西亞、巴基斯坦等地[8],曾在我國云南蔗區大面積爆發[9]。SCSMV發病率達到50%時,甘蔗產量損失達到20%[10]。

盡管SCSMV與SCMV、SrMV在分類上屬于不同的屬,但是基因組結構極為相似,均為單鏈正義RNA病毒,編碼11個功能蛋白,從5′至3′分別是P1、HC-Pro、P3、P3N-PIPO、6K1、CI、6K2、NIa-Vpg、NIa-Pro、Nib和CP[11-14]。其中,P3N-PIPO是由P3蛋白N端與位于P3順反子內部以+2 移碼方式編碼的PIPO組成,移碼發生在P3內部的高度保守序列G1-2A6-7,機制不明[15]。植物病毒作為一種細胞內專性寄生物,必須借助寄主的某些特異蛋白,才能在寄主體內完成復制、翻譯、運動等基本生命活動,建立系統性侵染[14,16]。馬鈴薯Y病毒屬病毒在寄主體內建立系統性侵染的過程中,HC-Pro、P3N-PIPO、CP和VPg是關鍵因子,發揮了極其重要的作用。HC-Pro在病毒基因組翻譯、蛋白加工中發揮重要作用,具有HC-Pro/P3特異切割位點識別功能[17]。HC-Pro的N端還參與調控病毒的蚜傳、致病性、病毒復制和積累的過程[18];中間區域與病毒長距離運輸、協生以及抑制寄主植物的基因沉默效應相關[19-21];C端則在病毒細胞間移動中起作用[22]。突變PIPO編碼區而不改變P3蛋白,突變毒株喪失胞間移動功能,無法完成侵染[23]。進一步研究證實P3N-PIPO與CI互作介導了病毒胞間移動,表明P3N-PIPO具有運動蛋白功能[24]。VPg在病毒的侵染過程中執行多種功能,可作為病毒RNA復制的引物,是病毒復制的必需蛋白[25-26];還可以充當帽子結構,通過與寄主的真核翻譯起始因子4E(Eukaryotic translation initiation factor 4E,eIF4E)互作,啟動病毒基因組的翻譯[27-28];此外,VPg還參與了病毒的移動[29-30]。CP是唯一的結構蛋白,可分為3個功能區域:暴露在病毒粒子表面的N端、C端[31]和中間區域[32]。蛋白結構域研究表明,CP蛋白高度保守的三組份氨基酸模體(Asp-Ala-Gly,DAG)會影響病毒組裝和蚜蟲傳播病毒的能力,特別是其N末端區域DAG模體的變異往往使SMV喪失蚜傳功能[33]。另外,CP還參與了病毒的胞間移動[14]。

酵母雙雜交系統(Yeast two-hybrid system,Y2HS)是Fields 和Song[34]建立的一種可用于檢測和篩選與目標蛋白具有相互作用的高通量技術,是目前研究病毒因子間、病毒因子與寄主因子互作最有效的技術。Y2HS已被成功應用于病毒蛋白間和病毒與寄主間的互作分析[35-36],如研究蕪菁花葉病毒[14-15](Turnipmosaicpotyvirus,TuMV)、大豆花葉病毒[37](Soybeanmosaicvirus,SMV)、胡蔥黃條病毒[38](Shallotyellowstripevirus,SYSV)和高粱花葉病毒[39](Sorghummosaicvirus,SrMV)等病毒與寄主蛋白之間互作關系。為研究SCSMV對甘蔗的侵染機制,本研究構建了SCSMV的HC-Pro、P3N-PIPO、CP和VPg基因的誘餌載體,并轉化酵母進行自激活活性和毒性檢測,為分離與SCSMV互作的甘蔗因子基因,研究SCSMV編碼蛋白之間以及SCSMV編碼蛋白與寄主因子互作關系奠定基礎。

1材料和方法

1.1主要試劑

試驗所需內切酶NcoⅠ、BamH Ⅰ、NdeⅠ、EcoR Ⅰ、T4DNA連接酶購自NEB公司,100 bp DNA Ladder、EXTaq酶、pMD19-T和RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0購自TaKaRa公司,RNA提取試劑TRIzol Reagent購自Invitrogen公司,感受態大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)DH5α、膠回收試劑盒和質粒提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司,引物合成及序列測定由上海生工生物工程公司完成,酵母菌株Y2HGold、載體pGBKT7和酵母生長培養基均購自Clontech公司。

1.2病毒材料

SCSMV分離物采集自福建農林大學甘蔗試驗田中具有明顯甘蔗花葉病癥狀的熱帶種Badila葉片。稱取感病甘蔗葉片2.0 g,在液氮中充分研磨后,用TRIzol試劑提取總RNA,用紫外分光光度計檢測其濃度和純度,用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性,確定無降解。按照RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0說明書進行反轉錄合成cDNA,使用特異性引物(表1)檢測和測序驗證后為SCSMV的分離物,置于-80 ℃保存備用。

1.3SCSMV的HC-Pro、P3N-PIPO、CP和VPg基因克隆

依據GenBank上公布的SCSMV參考序列(IND671,JN941985.1;TPT,GQ246187.1;THA-NP3,JN163911.1;ID,JF488066.1;JP2,JF488065.1;JP1,JF488064.1;PAK,NC_014037.1)設計含有合適酶切位點的特異引物(表1),以SCSMV分離物cDNA為模板,對目的基因進行擴增。PCR反應體系為25 μL,其中10×PCR Buffer 2.5 μL,dNTPs 2.0 μL,前引物(10 μmol/L)1.0 μL,后引物(10 μmol/L)1.0 μL,EXTaq酶(5 U/μL)0.125 μL,ddH2O 17.375 μL,模板(cDNA)1.0 μL。反應條件為:94 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s,64 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,35個循環;72 ℃ 10 min。PCR反應產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1　試驗中用到的PCR引物

1.4重組質粒的構建與驗證

PCR 產物經瓊脂糖凝膠電泳回收后與 pMD19-T載體連接,連接產物轉至E.coliDH5α感受態細胞,37 ℃ 培養12~16 h,挑取白色克隆進行菌液 PCR 鑒定,陽性克隆送上海生工生物工程有限公司測序。將陽性克隆搖菌提取質粒并雙酶切,分別回收HC-Pro、P3N-PIPO、CP和VPg目的片段,用T4DNA連接酶與經同樣雙酶切酵母表達載體 pGBKT7 連接過夜,轉化至E.coliDH5α,進行陽性克隆子篩選,提取陽性克隆質粒雙酶切檢測,陽性克隆送上海生工生物工程有限公司測序,測序結果正確的陽性克隆即為重組誘餌質粒。

1.5誘餌載體轉化酵母感受態及快速篩選

參照Clontech公司酵母雙雜交手冊進行酵母菌株Y2HGold感受態細胞制備和質粒轉化。將分別轉化pGBKT7-HC-Pro、pGBKT7-P3N-PIPO、pGBKT7-CP和pGBKT7-VPg的 Y2HGold 酵母菌涂布于SD/-Trp平板,倒置放30 ℃ 恒溫箱培養2~4 d,挑取 SD/-Trp平板上菌落生長良好,直徑在2~3 mm 菌落于2 mL無菌離心管中,加入SD/-Trp液體酵母培養基1 mL(卡那霉素為50 μg/mL),并用封口膜封口,200 r/min,30 ℃培養 8~10 h,進行PCR鑒定。方法如下:吸取200 μL活化的酵母菌液于PCR管中,5 000 r/min離心5 min,棄上清液,加入30 μL 0.2%SDS,渦旋振蕩數秒鐘,然后沸水浴中處理5 min,14 000 r/min離心30 s,取上清液 1 μL 作為 PCR反應的模板。使用pGBKT7載體上的測序引物(pGBKT7-F、pGBKT7-R,表1),進行 PCR 鑒定。取5 μL PCR擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6誘餌蛋白毒性檢測

分別將轉化重組誘餌載體pGBKT7-HC-Pro、pGBKT7-P3N-PIPO、pGBKT7-CP、pGBKT7-VPg和空載體pGBKT7的酵母菌Y2HGold涂布100 μL(3個梯度100,10-1,10-2)稀釋液于 SD/-Trp平板,倒置放30 ℃ 恒溫箱培養2~4 d,分別挑取 SD/-Trp平板上生長良好,直徑在2~3 mm的菌落,用10 mL SD/-Trp 液體酵母培養基(卡那霉素為50 μg/mL),250 r/min,30 ℃培養 22~24 h,分別測定OD600。

1.7誘餌載體轉錄自激活活性的檢測

參照Clontech公司 Matchmaker TM Gold 酵母雙雜交系統手冊進行[40]。將轉化了重組誘餌載體、pGBKT7空載體、陽性對照和陰性對照的酵母菌Y2HGold分別點板于SD/-Trp、 SD/-Leu、SD/-Trp/-Ade、SD/-Trp/-His、SD/-Trp/X-α-Gal 和SD/-Trp/X-α-Gal/AbA 平板上。倒置于30 ℃恒溫箱中培養2~4 d,觀察并記錄結果。

2結果與分析

2.1甘蔗感病葉片總RNA的提取

經紫外分光光度計測定,感病葉片總RNA純度OD260/280=1.95,濃度為1.25 μg/μL。1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示,18S rRNA和28S rRNA條帶清晰,無明顯拖尾現象(圖1),表明 RNA純度高,沒有降解。

M.D2000 DNA Marker;1,2.總RNA。

2.2目的基因擴增

經特異性引物擴增后獲得4種PCR產物,分別是SCSMV-HC-Pro(1 410 bp)、SCSMV-P3N-PIPO(825 bp)、SCSMV-CP(846 bp)和SCSMV-VPg(594 bp),瓊脂糖膠電泳檢測片段大小與預期一致(圖2)。測序后經Blast比對表明均為目的片段序列。

M.100 bp DNA Ladder;1.SCSMV-HC-Pro;2.SCSMV-P3N-PIPO;

2.3誘餌載體的構建與驗證

提取上述4種測序驗證后的陽性克隆的質粒,根據各自引物上所帶酶切位點,分別利用NcoⅠ、BamH Ⅰ、NdeⅠ和EcoR Ⅰ進行雙酶切,隨后用T4DNA連接酶連接到誘餌載體pGBKT7上,構建好的載體再進行雙酶切鑒定,瓊脂糖凝膠電泳結果表明載體構建成功(圖3)。使用pGBKT7載體上的引物做測序引物進行測序,結果表明，4個片段連接到載體中的方向和讀碼框均正確,分別將這4個誘餌載體命名為pGBKT7-HC-Pro、pGBKT7-P3N-PIPO、pGBKT7-CP和pGBKT7-VPg。

M1.D15000+2000 DNA Marker;M2.100 bp DNA Ladder;1.pGBKT7-HC-Pro;2.pGBKT7-P3N-PIPO;3.pGBKT7-CP;4.pGBKT7-VPg。

M1.D15000+2000 DNA Marker;M2.100 bp DNA Ladder;1.pGBKT7-HC-Pro;2.pGBKT7-P3N-PIPO;3.pGBKT7-CP;4.pGBKT7-VPg.

圖3重組誘餌載體雙酶切驗證

Fig.3Double restriction enzyme digestion for bait vectors

2.4誘餌載體轉化酵母鑒定

將上述構建好的4個誘餌載體分別轉化至酵母菌株Y2HGold中,挑取酵母單菌落培養過夜并進行菌液PCR,PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。結果顯示(圖4),4種轉化后酵母菌落PCR產物條帶大小與靶標基因大小一致,說明重組誘餌質粒載體pGBKT7-HC-Pro、pGBKT7-P3N-PIPO、pGBKT7-CP和pGBKT7-VPg轉化酵母成功。

圖4　誘餌載體轉化酵母PCR檢測

2.5重組誘餌載體的蛋白毒性檢測

培養結果表明,轉有重組誘餌載體的SD/-Trp平板和轉有空載體的平板上菌落密集程度相似,生長均正常,菌落大小均介于2～3 mm。重組誘餌質粒pGBKT7-HC-Pro、pGBKT7-P3N-PIPO、pGBKT7-CP、pGBKT7-VPg和空載體pGBKT7的菌液OD600值分別為1.215,1.193,1.304,1.227,1.189,均超過了0.8的判斷標準,說明重組誘餌蛋白對酵母菌Y2HGold生長無毒性,可用于下一步的文庫篩選。

2.6誘餌蛋白自激活作用的檢測

將攜帶誘餌載體的酵母菌株點于不同的營養缺陷型培養基上,試驗結果表明，攜帶誘餌載體的菌株均可在SD/-Trp缺陷培養基上正常生長,而在SD/-Leu缺陷培養基上只有陽性對照和陰性對照能正常生長(圖5-A),這是因為AD和BD質粒載體上分別攜帶有Leu和Trp編碼基因,可以分別合成缺陷的營養元素使酵母菌株在對應的培養基上復蘇,表明轉入酵母菌株的誘餌載體正確。進一步利用 SD/-Trp/-Ade和SD/-Trp/-His缺陷型培養基檢驗誘餌蛋白是否對ADE2 和HIS3 報告基因具有激活作用。結果顯示,只有陽性對照質粒pGADT7-T+pGBKT7-53可在SD/-Trp/-Ade和 SD/-Trp/-His 營養缺陷培養基上復蘇,陰性對照pGADT7-T+pGBKT7-Lam、重組誘餌載體pGBKT7-HC-Pro、pGBKT7-P3N-PIPO、pGBKT7-CP、pGBKT7-VPg和空載體pGBKT7均不能正常生長(圖5-B),表明誘餌蛋白對ADE2 和HIS3報告基因均無自激活活性。

A、B、C.圖中自上而下依次為陽性對照、陰性對照、重組誘餌載體

為進一步確認誘餌蛋白無自激活活性,減少文庫篩選過程中假陽性克隆的出現,將攜帶重組誘餌質粒的菌株分別在SD/-Trp/X-α-gal和SD/-Trp/X-α-gal/AbA平板上進行復蘇檢測。結果顯示(圖5-C),所有菌株均可在SD/-Trp/X-α-gal復蘇,但僅有陽性對照pGADT7-T+pGBKT7-53變藍。在含有AbA抗性的平板上,也只有同時攜帶AD和BD載體且存在互作的pGADT7-T+pGBKT7-53獲得了復蘇,結果進一步說明pGBKT7-HC-Pro、pGBKT7-P3N-PIPO、pGBKT7-CP和pGBKT7-VPg對MEL1和AUR1-C報告基因無自激活活性。

3討論

SCSMV是甘蔗花葉病的主要病原之一,He等[9]研究表明SCSMV 在云南某些甘蔗主栽區大范圍流行,部分地區呈現爆發趨勢。闡明病毒的侵染機制,對于研究防治策略,篩選培育抗病品種,具有重要意義。在模式植物煙草、擬南芥等上,馬鈴薯Y病毒科Y病毒屬病毒的侵染機制已經有比較深入的研究[41-42],為研究SCSMV侵染甘蔗的分子機制提供了良好的借鑒。但是,SCSMV是禾草毒屬的新病毒,有關SCSMV侵染甘蔗分子機制的研究基本處于空白狀態。

近年來,酵母雙雜交技術在植物病毒學研究中已逐漸成為一種主要手段,廣泛應用于植物病毒蛋白與寄主編碼蛋白之間相互作用的研究,在分析病毒侵染、復制、細胞間的運動和長距離運輸,探討病毒對植物正常生理功能影響的分子機制等方面發揮了重要的作用[35]。HC-Pro、P3N-PIPO、CP和VPg蛋白被認為在病毒侵染過程中起著至關重要的作用,利用Y2HS篩選甘蔗內與SCSMV這些蛋白互作的寄主因子,將有可能從甘蔗中分離鑒定出參與病毒沉默抑制、胞間移動、長距離運輸和翻譯等重要環節的寄主因子基因。2014年,筆者與團隊其他成員合作構建了易感甘蔗花葉病的甘蔗 cDNA 文庫[43],文庫容量為2.0×107cfu,隨機挑取的24個克隆的重組率為100%,cDNA插入片段長度主要分布在1~2 kb,文庫質量合格,為篩選與SCSMV互作的甘蔗因子基因奠定了試驗基礎。

在利用Y2HS篩選文庫及研究蛋白之間的互作關系過程中,誘餌蛋白的正確表達至關重要。一方面,由于某些誘餌蛋白本身可能具有轉錄激活的作用,能夠直接激活報告基因的表達,造成過多假陽性結果;另一方面,某些誘餌蛋白的表達可能對酵母菌株產生毒害作用,將導致酵母細胞不能正常生長,影響后繼的篩選工作。因此,必須對誘餌蛋白進行毒性與自激活檢測。本研究中構建了SCSMV的HC-Pro、P3N-PIPO、CP和VPg這4個基因的誘餌載體,試驗結果表明，這4個誘餌載體均無毒性和自激活作用,可以應用甘蔗cDNA文庫篩選和蛋白間的互作研究。本研究為闡明SCSMV侵染機制奠定了試驗基礎。

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Construction and Self-activated Detection of the Baits ofHC-Pro,P3N-PIPO,CPandVPgfromSugarcanestreakmosaicvirusfor Yeast Two Hybrid System

ZHAI Yushan,PENG Lei,YANG Yongqing,DENG Yuqing,CHENG Guangyuan,ZHENG Yanru,XU Jingsheng

(Key Laboratory of Sugarcane Biology and Genetic Breeding,MOA,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou350002,China)

Abstract：Sugarcane streak mosaic virus (SCSMV) is one of the main pathogens causing mosaic syndrome on sugarcane.Yeast two hybrid system (Y2HS) is the main technique to investigate the mechanism between pathogen with host plant.In order to elucidate the interaction between the SCSMV and sugarcane by Y2HS,the coding sequences of HC-Pro,P3N-PIPO,CP and VPg from SCSMV were cloned into the pGBKT7,respectively,to generate 4 bait vectors,pGBKT7-HC-Pro,pGBKT7-P3N-PIPO,pGBKT7-CP and pGBKT7-VPg.Then the 4 bait vectors were transformed into the yeast strain Y2HGold,respectively.All the Y2HGold strains containing the bait vectors grew well on the SD/-Trp media as the control.It suggested that the proteins encoded by the baits were not toxic to yeast.All these 4 transformed yeast strains developed white but not blue plaques on the SD/-Trp/X-α-gal media.And they could not survive on the SD/-Leu,SD/-Trp/-Ade,SD/-Trp/-His or SD/-Trp/X-α-gal/AbA media,which indicating the bait proteins could not activate the report genes,such as MEL1,ADE2,HIS3 or AUR1-C.These 4 bait vectors constructed in this study could be used to screen the host proteins interacting with them to investigate the molecular mechanism and pathogenesis of SCSMV infection on sugarcane.

Key words:Sugarcane streak mosaic virus;HC-Pro;P3N-PIPO;CP;VPg;Bait vector;Yeast two hybrid system

doi:10.7668/hbnxb.2016.01.014

中圖分類號：Q78

文獻標識碼：A

文章編號：1000-7091(2016)01-0083-07

作者簡介：翟玉山(1989-),男,安徽渦陽人,在讀碩士,主要從事甘蔗病原侵染分子機制等方面的研究。通訊作者：徐景升(1973-),男,黑龍江佳木斯人,副研究員,博士,博士生導師,主要從事甘蔗功能基因組學、甘蔗生物學等方面的研究。

基金項目：國家高技術研究發展計劃“863計劃”項目(2013AA102604);國家自然科學基金項目(31171605;31371688)

收稿日期：2011-10-09