動脈平滑肌細胞STIM1過表達上調Akt/mTOR通路并促進細胞增殖

張明芳，齊元麟，王　丹，王　情，陳富華，林默君

(福建醫科大學基礎醫學院1．生理學與病理生理學系、心血管科學研究室、2．生物化學與分子生物學系，福建福州　350108)

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動脈平滑肌細胞STIM1過表達上調Akt/mTOR通路并促進細胞增殖

張明芳1，齊元麟2，王丹1，王情1，陳富華1，林默君1

(福建醫科大學基礎醫學院1．生理學與病理生理學系、心血管科學研究室、2．生物化學與分子生物學系，福建福州350108)

中國圖書分類號: R322. 121; R322. 74; R322. 35; R329. 24; R544. 022; R977. 6

摘要:目的觀察基質相互作用分子1( stromal interaction molecule 1，STIM1)在肺動脈高壓組織中的表達，并探討STIM1對動脈平滑肌細胞增殖的影響及機制。方法一次性腹腔注射野百合堿( MCT)建立肺動脈高壓大鼠模型;實時定量PCR和蛋白印跡分別測定肺動脈高壓大鼠肺組織STIM1 mRNA和蛋白的表達;采用基因轉染技術建立STIM1瞬時高表達的動脈平滑肌A7R5細胞模型;用CCK-8法測定細胞增殖能力;用蛋白印跡測定Akt/mTOR通路分子的表達。結果與對照組相比，MCT組的右心室收縮壓( RVSP)和右心重量指數( RVMI)均明顯增高( P＜0. 01)，形態學觀察可見肺小動脈平滑肌層明顯增厚，管腔減小; MCT組大鼠STIM1 mRNA和蛋白表達量分別是對照大鼠的2. 19和1. 66 倍; STIM1瞬時過表達的動脈平滑肌細胞與對照組相比，生長速度加快; STIM1過表達可明顯增加Akt、mTOR、p70-S6K 和4E-BP1的磷酸化水平，而對它們的蛋白水平沒有影響。結論肺動脈高壓發病中存在STIM1的過表達，STIM1可促進動脈平滑肌細胞增殖，其機制與上調Akt/mTOR信號轉導通路相關。

關鍵詞:肺動脈高壓;動脈平滑肌細胞;基質相互作用分子1;細胞增殖;哺乳動物雷帕霉素靶蛋白; Akt信號通路

林默君( 1964－)，男，博士，教授，博士生導師，通訊作者，研究方向:循環生理學，Tel: 0591-22862006，E-mail: linmojunfz@163．com

肺動脈高壓( pulmonary arterial hypertension，PAH)發病的核心事件是肺動脈平滑肌細胞( pulmonary arterial smooth muscle cells，PASMCs)緊張性增強、過度增殖和凋亡不足而引起的肺動脈收縮加強和血管重構［1］。在PAH發病過程中，Ca2 +因能同時影響PASMCs的收縮、增殖和凋亡而成為PAH研究的熱點之一。最近發現，鈣池操縱性鈣通道( storeoperated calcium channel，SOCC)對細胞內鈣的穩態起重要的調節作用，SOCC是由經典瞬間受體電位( TRP Canonical，TRPC)亞家族和Orai家族組成的異多聚體蛋白，受內質網鈣池感受器基質相互作用分子1 ( stromal interaction molecule 1，STIM1)調控［2］。我們前期研究發現PAH動物模型上存在SOCC表達和功能的上調，而且這種上調參與了PAH的發病［3－5］。由于STIM1可調節多種正常細胞和腫瘤細胞的增殖［6－7］，我們推測STIM1可通過調節血管平滑肌細胞增殖而影響PAH發生，但目前相關研究尚少見報道。本研究首先建立肺動脈高壓動物模型，檢測STIM1蛋白和mRNA的表達，隨后在培養的動脈平滑肌細胞中過表達STIM1，觀察其對細胞增殖以及對Akt/mTOR增殖信號途徑的影響，擬探討STIM1對平滑肌細胞增殖的影響及可能的機制，為PAH防治提供新靶點。

1　材料與方法

1．1材料SD大鼠，♂，體質量160～180 g，福州吳氏實驗動物有限公司;動脈平滑肌細胞A7R5，中國科學院上海細胞庫;胎牛血清，Hyclone公司; F-12培養基、青鏈霉素、TRIzol，Invitrogen公司;膠原酶、木瓜蛋白酶、牛血清白蛋白、野百合堿( MCT)、HEPES、D-葡萄糖、抑肽酶、正釩酸鈉，Sigma公司; Rvert Aid First Strand cDNA合成試劑盒，Thermo Fermentas公司; X-tremeGENE HP DNA轉染試劑、SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒，羅氏公司;兔抗STIM1抗體，Alomone Labs公司;兔抗β-actin、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、p70-S6K、p-p70-S6K、4EBP1、p-4E-BP1抗體及第二抗體，Cell Signaling公司; CCK-8試劑盒，同仁化學研究所;蛋白定量試劑盒、RIPA裂解液、PMSF、抗體稀釋液、ECL發光試劑盒，碧云天生物技術研究所;質粒pEX-SP-YFPSTIM1及對照質粒購自Addgene，經本實驗室測序驗證。其余試劑均為進口或國產分析純。

1．2方法

1．2．1 MCT誘導的慢性肺動脈高壓大鼠模型的建立健康SD大鼠，♂，體質量160～180 g，隨機分成正常對照組( CON組)和MCT模型組( MCT組)。CON組: SD大鼠正常飼養3周，MCT組:按60 mg· kg－1劑量一次性腹腔注射2% MCT，正常飼養3周。

1．2．2右心室收縮壓( RVSP)和右心重量指數( RVMI)測定CON組和MCT組大鼠分別腹腔注射肝素( Heparin，50 IU/100 g)，在5 min后氨基甲酸乙酯( 1 g·kg－1)腹腔麻醉，從右頸外靜脈插管直到右心室，記錄大鼠RVSP。測完RVSP后，迅速開胸取出心臟及肺。沿房室交界處剪去左右心房及大血管，分離右心室( RV)及左心室+室間隔( LV + S)，用濾紙吸去多余水分，分別稱重，計算RV/( LV + S)即RVMI。

1．2．3肺動脈形態學檢測將取下的左肺用大頭針固定在泡沫板上，在距離肺尖約0. 5 cm處切取肺組織，肺組織在負壓中性甲醛中固定24 h、石蠟切片、HE染色。光鏡下觀察CON和MCT組的肺血管形態。

1．2．4大鼠肺動脈組織STIM1的表達對照組大鼠和模型組大鼠的肺動脈標本在液氮中充分研磨后，用TRIzol試劑提取RNA，實時定量PCR技術測定STIM1基因表達水平( 18S rRNA引物: 5'-GTCTGTGATGCCCTTAGATG-3'，5'-AGCTTATGACCCGCACTTAC-3; STIM1引物: 5'-GAGCACCGAACAGTGGAAGT-3，5'-GCCTCTCTGCATTTTGCTTC-3')。肺動脈標本以RIPA細胞裂解液(含1 mmol·L－1PMSF、1 mmol·L－1正釩酸鈉、10 mg·L－1抑肽酶)提取總蛋白，BCA法測定蛋白質濃度，取40 μg總蛋白進行Western blot實驗，測定STIM1蛋白表達水平。

1．2．5動脈平滑肌細胞A7R5的培養、轉染與鑒定

A7R5細胞于F-12培養基(含10%胎牛血清和1%青鏈霉素)、在5% CO2和37℃下正常培養。細胞按合適的比例接種6孔板中，每孔加培養液2 mL，培養約24 h，使細胞生長的匯合度在95%左右。參照X-tremeGENE HP轉染試劑說明書進行轉染實驗，簡述如下:配制X-tremeGENE HP轉染試劑工作液并按一定比例與配好的0. 01 g·L－1質粒溶液混合，在15℃～25℃下孵育15 min;取出細胞，無需棄去生長培養基，將轉染混合物滴加至細胞中，輕柔振蕩混勻后，37℃培養72 h后，提取總蛋白，采用Western blot技術測定STIM1蛋白表達量。實驗分組:①空白組:僅加轉染試劑，不加質粒;②對照組:加入空質粒;③實驗組:加入STIM1過表達質粒。

1．2．6細胞增殖實驗轉染72 h后，收集對照組和實驗組細胞，制成適當濃度的單細胞懸液( 5×107· L－1)，接種至96孔板，每孔100 μL。每組細胞設5個復孔，37℃和5% CO2實驗條件下常規培養。于接種后d 1、2、3、4、5各取出一塊96孔板進行檢測。每孔加入CCK-8 10 μL，37℃培養1 h后，酶標儀上檢測450 nm處的光吸收度，以培養時間為橫坐標，A450為縱坐標繪制細胞生長曲線。實驗重復3次。

1．2．7轉染STIM1對Akt/mTOR途徑蛋白表達的影響轉染72 h后，收集各組細胞，PBS洗2次，加入RIPA細胞裂解液(含1 mmol·L－1PMSF、1 mmol ·L－1正釩酸鈉、10 mg·L－1抑肽酶)提取總蛋白，BCA法測定蛋白質濃度，取40 μg總蛋白進行Western blot實驗。10% SDS-PAGE電泳后行轉膜印跡，分別用各種第一抗體與膜上的抗原結合，然后用HRP偶聯的二抗與其反應，用ECL化學發光試劑檢測，經壓片曝光后，顯影和定影。采用Phoretix 1D V2003. 03圖像分析軟件測定和比較各組蛋白表達情況。

1．2．8統計學分析所有數據均采用SPSS軟件進行統計學處理，實驗數據以±s表示，組間比較采用t檢驗。

2　結果

2．1MCT誘發肺動脈高壓大鼠模型鑒定

2．1．1血流動力學及RVMI腹腔注射MCT 3周后，MCT組的RVSP明顯高于CON組［( 57. 4±10. 3) mmHg vs ( 18. 1±3. 8) mmHg，P＜0. 01］( 1 mmHg = 0. 133 kPa)，而MCT組的平均體循環動脈壓( mean systemic arterial pressure，mSAP)與CON相比沒有明顯差異［( 102. 4±12. 1) mmHg vs ( 104. 8±10. 1) mmHg，P＞0. 05］，提示右心室內壓增高; MCT組的RVMI明顯高于CON組［( 53. 0±9. 2) % vs ( 29. 5± 4. 8) %，P＜0. 05］，表明右心重構、肥大，提示慢性PAH大鼠模型成功建立，見Fig 1A～D。

2．1．2 MCT引起肺動脈重構鏡下可見CON組的氣管上皮完整，軟骨片缺如，氣管外包繞一層平滑肌，與其伴行的肺動脈內皮完整，中膜由一層平滑肌組成。MCT組氣管上皮完整，軟骨片亦缺如，氣管外包繞一層平滑肌，與其伴行的肺動脈內皮完整，可見中膜由一層平滑肌組成。與CON組中外徑相近的肺小動脈相比，MCT組肌壁明顯增厚伴玻璃樣變，管腔狹窄甚至閉塞，內膜纖維化，出現了肺血管重構，說明MCT能使肺動脈平滑肌增生肥厚，見圖1 E～F。

Fig 1 Fig 1 Characterization of MCT-induced rat pulmonary hypertension model

2．2STIM1在肺動脈高壓組織中的表達以實時定量PCR和Western blot法分別檢測野百合堿誘導大鼠肺動脈高壓模型中STIM1 mRNA和蛋白質相對于正常大鼠的表達，結果顯示，模型組STIM1 mRNA和蛋白的表達量分別是對照組的( 2. 19±0. 49) 和( 1. 66±0. 32)倍，兩者相比差異存在顯著性，見Fig 2。

Fig 2 Expression of STIM1 in pulmonary arteries of MCT-induced hypertensive rat

2．3轉染STIM1質粒對A7R5增殖的影響轉染STIM1質粒明顯增加A7R5的STIM1蛋白表達，Western blot結果出現明顯的STIM1-YFP融合蛋白條帶，而空質粒轉染組無此條帶，見Fig 3。細胞生長曲線結果顯示:培養的A7R5在d 2開始增殖，d 3開始進入對數生長期，STIM1轉染組與對照組相比，細胞的生長速度加快，說明所得到的STIM1高表達可促進細胞增殖，見Fig 3。

Fig 3 Effects of STIM1 overexpression on A7R5 cells proliferation

2．4轉染STIM1對細胞增殖相關信號轉導的影響

Western blot結果顯示，轉染STIM1可明顯增加p-Akt、p-mTOR、p-p70-S6K、p-4E-BP1的表達，而對Akt、mTOR、p70-S6K和4E-BP1的表達沒有影響，見Fig 4。

3　討論

MCT是一種雙吡咯類生物堿，在肝臟內經酶的作用后形成野百合堿吡咯( MCTP)，沉積于肺小動脈壁和肺毛細血管，導致肺血管內皮發生廣泛、不可逆性損傷，導致肺動脈高壓，能很好的模擬急進型PAH的發生過程［8］。本研究顯示，大鼠腹腔注射MCT模型組RVSP相比正常組大鼠明顯升高( P＜0. 05)。HE染色結果顯示肺動脈肌壁明顯增厚，管腔狹窄甚至閉塞，內膜纖維化;小血管壁未見正常結構并有纖維素樣滲出，管周有炎癥細胞大量浸潤，結合大鼠一系列肺動脈高壓癥狀的出現，提示成功建立肺高壓大鼠模型。

動脈平滑肌細胞膜上的鈣池操縱性鈣通道( SOCC)參與了細胞內Ca2 +穩態的維持，對動脈平滑肌的收縮和增殖起重要作用。它是由經典瞬間受體電位( TRP Canonical，TRPC)亞家族和Orai家族組成的異多聚體蛋白，受內質網鈣感受器STIM1調控，當內質網腔Ca2 +充盈時，STIM1在內質網膜上均勻分布; Ca2 +池耗竭使STIM1在內質網上形成多聚體，作用于質膜上TRPC/Orai復合體，觸發SOCC開放。我們前期發現，在慢性缺氧和MCT誘發的PAH大鼠模型上，SOCC膜通道的組分之一TRPC1 在PASMCs的表達上調［3－4］，提高SOCC介導的Ca2 +內流，引起PASMCs的靜息［Ca2 +］i升高和基礎張力增加;耗竭細胞Ca2 +池可激活Ca2 +內流和血管收縮，SOCC抑制劑( Gd3 +、La3 +、SKF-96365)不僅抑制SOC介導的鈣內流，也抑制內皮素引起的血管收縮［3，5］。這些結果提示，PAH動物模型存在SOCC功能的上調。

Fig 4 Effects of STIM1 overexpression on Akt－mTOR signaling

為確定PAH動物是否存在SOCC關鍵分子STIM1表達上調，本研究采用實時PCR和Western blot法分別檢測MCT誘導大鼠肺高壓模型中STIM1 mRNA和蛋白質相對于正常大鼠的表達，結果顯示，MCT誘導產生的肺高壓大鼠肺動脈組織的STIM1 mRNA和蛋白質表達水平均明顯高于對照大鼠，證實肺高壓模型上存在STIM1的表達上調。Soboloff等［9］測定了過表達STIM1、Orai1對HEK293細胞鈣池操縱性鈣內流( store-operated calcium entry，SOCE)的影響，發現單獨過表達STIM1可適度增加SOCE( 2～3倍)，單獨過表達Orai1可明顯抑制SOCE(下降至30%～40%)，而共表達STIM1、Orai1可大幅度增加SOCE( 20～30倍)。本研究室前期測定了MCT肺高壓大鼠模型中Orai1的表達，發現Orai1表達明顯增加(另文發表)。因此，本研究中模型組大鼠肺動脈STIM1表達的上調，可與Orai1的增加形成協同效應，導致肺動脈SOCE的增高。

對多種腫瘤或正常細胞的研究顯示，SOCE及其主要成分STIM1與細胞增殖密切相關［10－11］。本研究中，為探討STIM1對動脈平滑肌細胞增殖的影響，我們在體外培養的動脈平滑肌細胞A7R5上建立STIM1瞬時高表達模型，觀察其對細胞增殖的影響。結果顯示，過表達STIM1可促進A7R5的增殖，這一結果說明，模型大鼠肺動脈組織STIM1高表達可促進動脈平滑肌細胞增殖，可能對肺動脈高壓形成起促進作用。Potier等［12］采用RNAi技術在A7R5上抑制STIM1和Orai1的表達，發現可大幅度降低SOCE，并抑制A7R5細胞的增殖和遷移，與我們的結果是一致的。

PI3K/Akt/mTOR途徑是調節細胞增殖的重要信號通路，多種生長因子可激活PI3K/Akt信號，進而激活mTOR復合物，增強細胞能量代謝及蛋白質、脂類合成，促進細胞生長［13］。研究顯示，mTOR因能促進細胞增殖，抑制細胞凋亡，對PAH的發病起到促進作用［14－15］。劉杰等［16］采用雷帕霉素對MCT誘導的PAH大鼠進行實驗性治療，發現與野百合堿組相比，雷帕霉素干預組大鼠右心室收縮壓明顯改善，右心室肥厚指數明顯降低，肺動脈重構程度明顯減輕，證明mTOR在肺動脈高壓發病中起重要作用。

本研究在動脈平滑肌細胞A7R5中過表達STIM1，觀察STIM1對Akt/mTOR信號途徑的調節，結果顯示，Akt和mTOR磷酸化水平增加而蛋白質水平不變，提示Akt/mTOR途徑活化。P70S6K和4E-BP1是mTOR的直接底物，其磷酸化水平常用于判斷mTOR的活化，本研究發現STIM1過表達可增強p70S6K和4E-BP1的磷酸化，證明了STIM1可促進mTOR的活化，這可能與肺動脈高壓發病中PASMCs增殖能力增強有關。Selvaraj等［17］在帕金森病的細胞模型上的研究發現，過表達STIM1/TRPC1，可升高神經細胞的鈣池操縱性Ca2 +內流，并進而激活Akt/mTOR途徑，促進細胞生存和對抗神經毒素MPTP( 1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶)的能力。Selvaraj等［18］的另一項研究發現，白藜蘆醇可抑制STIM1并進而抑制mTOR途徑，誘導前列腺癌細胞死亡，而過表達STIM1可增強mTOR磷酸化，抑制內質網應激和細胞死亡。這些結果說明，STIM1對Akt/mTOR的調節可能是多種細胞都存在的普適性的調節機制。

綜上所述，我們在MCT誘導的肺動脈高壓大鼠模型中，觀察到了SOCC關鍵分子STIM1的mRNA和蛋白質的高表達;在大鼠動脈平滑肌細胞A7R5中過表達STIM1，發現細胞增殖能力增強和Akt/ mTOR途徑活化。這些結果提示，在PAH發病過程中，STIM1可能通過上調Akt/mTOR信號，促進PASMCs增殖和PAH發生。STIM1調節MCT誘導的肺高壓發病的確切機制，以及在其他肺動脈高壓大鼠模型中的作用仍在進一步研究中。

(致謝:本文在福建醫科大學基礎醫學院心血管研究室完成，特此致謝! )

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STIM1 promotes arterial smooth muscle cells proliferation by regulating Akt/mTOR pathway

ZHANG Ming-fang1，QI Yuan-lin2，WANG Dan1，WANG Qing1，CHEN Fu-hua1，LIN Mo-jun1
( 1．Dept of Physiology and Pathophysiology，2．Dept of Biochemistry and Molecular Biology，School of Basic Medical Sciences，Fujian Medical University，Fuzhou 350108，China)

Abstract:AimTo investigate the expression of stromal interaction molecule 1 ( STIM1) in rat pulmonary arterial hypertension ( PAH) tissues and effects of STIM1 on arterial muscle cells proliferation．Methods PAH was induced by a single intraperitoneal injection of MCT at a dose of 60 mg·kg－1．The mRNA or protein expressions of STIM1 in monocrotaline-induced pulmonary hypertensive rats were measured by realtime PCR or Western blot，respectively．The arterial smooth muscle cells A7R5 were transiently transfected with STIM1 plasmids to prepare STIM1 overexpressed cells．Cell proliferations were detected by using CCK-8 kits．The expressions of Akt/mTOR pathway molecules of A7R5 were measured by Western blot．Results The right ventricular systolic blood pressure ( RVSP) and right ventricular mass index ( RVMI ) were markedly elevated in MCT-treated rats ( P＜0. 01) in comparison to control rats．The mRNA and protein expression levels of STIM1 in monocrotaline-induced pulmonary hypertensive rats were 2. 19 and 1. 66 folds of control rats，respectively．STIM1 were transiently overexpressed in cultured A7R5．Cells transfected with STIM1 grew more quickly than non-transfected control．Overexpression of STIM1 significantly increased the phosphorylation of Akt，mTOR，p70-S6K，and 4EBP1，but did not change their protein expression levels．ConclusionSTIM1 are over-expressed in rat PAH tissues．Overexpression of STIM1 can promote arterial smooth muscle cells proliferation by regulating Akt/mTOR pathway．

Key words:pulmonary hypertension; arterial smooth muscle cells; stromal interaction molecule 1 ( STIM1) ; cell proliferation; mammalian target of rapamycin ( mTOR) ; Akt signaling

作者簡介:張明芳( 1973－)，女，博士，副教授，研究方向:心血管病理生理學，E-mail: mfzhang@ fjmu．edu．cn;

基金項目:國家自然科學基金資助項目( No 31171104) ;福建省教育廳科技重點資助項目( No JA10130) ;福建省自然科學基金資助項目( No 2015J01611，2013J01373)

收稿日期:2015－10－05，修回日期: 2015－11－20

文獻標志碼:A

文章編號:1001－1978( 2016) 01－0037－06

doi:10．3969/j．issn．1001－1978．2016．01．009