多靶點鬼臼毒素新衍生物CCP-1抗腫瘤多藥耐藥作用機制研究

張　元，王　火，牛　聰，曹　波，陳　虹

( 1．武警新疆總隊南疆指揮部醫(yī)院，新疆喀什　844000;2．武警后勤學院附屬醫(yī)院，天津　300162; 3．武警總醫(yī)院，北京　100039;4．武警后勤學院，天津　300309)

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多靶點鬼臼毒素新衍生物CCP-1抗腫瘤多藥耐藥作用機制研究

張元1，王火2，牛聰3，曹波4，陳虹4

( 1．武警新疆總隊南疆指揮部醫(yī)院，新疆喀什844000;2．武警后勤學院附屬醫(yī)院，天津300162; 3．武警總醫(yī)院，北京100039;4．武警后勤學院，天津300309)

中國圖書分類號: R-332; R329. 24; R329. 25; R341; R730. 53; R979. 19

關鍵詞:鬼臼毒素衍生物;多靶點; P糖蛋白;抗腫瘤;抗多藥耐藥;微管蛋白

曹波( 1981－)，男，博士，講師，研究方向:腫瘤藥理學，通訊作者，E-mail: caobo19841@126．com

Anti-MDR tumor activities of CCP-1: a new multi-target podophyllotoxin derivative and its molecular mechanism

ZHANG Yuan1，WANG Huo2，NIU Cong3，CAO Bo4，CHEN Hong4
( 1．Xinjiang Provincial Corps South-region Command Post Hospital of CAPF，Kashgar Xinjiang844000，China; 2．Affiliated Hospital of Logistics University of CAPF，Tianjin 300162，China; 3．General Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces，Beijing 100039，China; 4．Logistics University of CAPF，Tianjin 300309，China)

Key words:podophyllotoxin derivatives; multi-target; P-gp; anti-tumor; anti-MDR;tubulin

以往單一靶點的抗腫瘤藥物極易產(chǎn)生耐藥［1－3］。多靶點的化療藥物具有其獨特優(yōu)勢，如多靶點的化療藥物是單分子化合物，不存在多藥物聯(lián)合應用中的藥物相互作用問題，也可避免藥物聯(lián)合應用中藥物配伍、劑量、給藥方式等問題。本課題組以天然產(chǎn)物中鬼臼毒素為母核，整合了具有抗腫瘤耐藥的小分子片段，將鬼臼毒素新衍生物設計為同時作用于多個耐藥靶點的化合物，以更好的克服傳統(tǒng)單靶點化療藥物易產(chǎn)生多藥耐藥的缺陷。前期篩選發(fā)現(xiàn)衍生物CCP-1具有良好的抗腫瘤多藥耐藥的作用。本文將對CCP-1的體內(nèi)和體外抗腫瘤作用及其可能作用機制作初步探討。

1　材料與方法

1．1一般材料CCP-1，分子質(zhì)量614. 6。依托泊苷( etoposide，VP-16)，分子質(zhì)量588. 56。人口腔鱗癌細胞KB及其長春新堿耐藥細胞株KBv200，人慢性髓性白血病急變期細胞K562及其阿霉素耐藥株K562/A02培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)基中。♂昆明種小鼠，體質(zhì)量18～22 g，SPF級。動物移植性腫瘤S180肉瘤由天津藥物研究院傳代保種。

1．2方法

1．2．1 MTT法測定CCP-1對多藥耐藥細胞的抗腫瘤活性按照文獻［4］方法進行測定。

1．2．2流式細胞儀檢測CCP-1對KBv200細胞凋亡率的影響加入CCP-1( 1. 0、2. 0、4. 0 μmol·L－1)，進行流式細胞儀檢測。

1．2．3 CCP-1對耐藥相關基因mdr-1表達的影響加入CCP-1( 1. 0、2. 0、4. 0 μmol·L－1)處理細胞。PCR分析:βactin作為內(nèi)標，靶基因為mdr-1。

1．2．4免疫細胞化學法觀察CCP-1對KBv200細胞P-gp蛋白表達的影響［5］加入CCP-1( 1. 0、2. 0、4. 0 μmol·L－1)，滴加兔抗人多克隆抗體(稀釋比例為1∶200)、鼠抗兔IgG二抗。光鏡觀察并照相。

1．2．5免疫熒光法檢測CCP-1對KBv200細胞微管蛋白的影響給藥組加入等濃度的CCP-1、長春新堿和紫杉醇，滴加兔抗人多克隆抗體、FITC標記的鼠抗兔IgG二抗、DAPI染液，高內(nèi)涵成像系統(tǒng)檢測并拍照。

1．2．6動物移植腫瘤模型研究CCP-1體內(nèi)抗腫瘤作用按照文獻［6］方法進行測定。

1．2．7統(tǒng)計學分析采用SPSS17．0統(tǒng)計軟件包處理分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)用±s表示，采用單因素方差分析( One-way ANOA)，顯著性水準為0. 05。

2　結果

2．1MTT法測定CCP-1對體外培養(yǎng)細胞增殖的影響從Tab 1、2可以看出CCP-1對多種腫瘤細胞均有較強的殺傷作用( IC50: 1. 41～3. 34 μmol·L－1)，與VP-16相比CCP-1顯示了更強的抗腫瘤活性，且對多藥耐藥細胞株的殺傷作用明顯高于臨床上廣泛使用的VP-16。

2．2流式細胞儀檢測CCP-1對KBv200細胞凋亡率的影響

CCP-1( 1. 0～4. 0 μmol·L－1)可誘導KBv200細胞產(chǎn)生凋亡，且有明顯量效關系。

2．3CCP-1對mdr-1基因mRNA表達的影響本研究發(fā)現(xiàn)CCP-1隨給藥濃度的增加可使mdr-1的mRNA表達量減少，有較明顯的劑量依賴性。

2．4免疫細胞化學法觀察CCP-1對KBv200細胞P-gp蛋白表達的影響實驗結果顯示，隨劑量的增加，CCP-1有降低P-gp蛋白表達的明顯趨勢。

2．5免疫熒光法檢測CCP-1對KBv200細胞微管蛋白的影響實驗顯示長春新堿能夠阻止微管結構的合成，而CCP-1作用于KBv200細胞6 h后，與紫杉醇作用結果相似，能夠促進微管聚合、抑制微管解聚。

2．6CCP-1對小鼠實體型S180肉瘤的抑制作用腹腔注射CCP-1( 25、50 mg·kg－1·d－1)，對小鼠實體型S180肉瘤的生長抑制率分別為55. 11%和62. 72%。在小鼠體重方面，高低劑量組與陰性對照組相比較未見明顯減輕( P＞0. 05)。陽性對照組依托泊苷( 20 mg·kg－1·d－1)抑瘤率為58. 54%，但小鼠體重與陰性對照組相比有明顯降低(體重下降20%)，且出現(xiàn)動物死亡現(xiàn)象(死亡4只)。

Tab 1 Multiple drug resistance of KBv200(±s，n =3)

Tab 1 Multiple drug resistance of KBv200(±s，n =3)

＊＊P＜0．01 vs control

IC50/μmol·L－1KB　KBv200　Mult of Drug fast Vincristine　0．28±0．07　9．25±1．03　33．04 Etoposide　1．71±0．04　12．1±1．23　7．07＊＊CCP-1　1．41±0．06　2．06±0．38＊＊　1．46＊＊

Tab 2 Multiple drug resistance of K562/A02(±s，n =3)

Tab 2 Multiple drug resistance of K562/A02(±s，n =3)

＊＊P＜0．01 vs control

ADM　0．34±0．11　12．22±1．25　35．94 Etoposide　3．56±0．23　34．76±4．23　9．76＊＊CCP-1　1．02±0．58　3．34±1．12＊＊　3．27＊＊IC50/μmol·L－1K562　K562/A02　Mult of Drug fast

Tab 3 Inhibitory effect of CCP-1 on transplantable sarcoma S180 in mice( n =10 per group)

Fig 1 Chemical structure of CCP-1

3　討論

本實驗室通過結構改造和構效關系的研究，引入活性基團，合成了一系列結構新穎的鬼臼毒素衍生物，其中CCP-1是將小分子5-甲氧基吲哚引入天然產(chǎn)物鬼臼毒素中合成的全新化合物，4β-( 5-甲氧基吲哚3-草酰氨基) -4-脫氧表鬼臼毒素( Fig 1)，具有微管蛋白的抑制劑活性。

本實驗中，MTT法結果顯示CCP-1對多種腫瘤細胞敏感，與抗癌藥物依托泊苷相比，其抗腫瘤活性更強，顯示了其高效低毒，抗癌譜廣等優(yōu)點，并對耐藥細胞也有明顯的抑制活性。本研究通過流式細胞術觀察發(fā)現(xiàn)CCP-1可使細胞出現(xiàn)明顯凋亡現(xiàn)象，由此推斷CCP-1可能通過凋亡途徑來發(fā)揮抗腫瘤作用。經(jīng)典的MDR主要與一種相對分子質(zhì)量為170 ku的跨膜糖蛋白( P-gp)有關［7－8］。分子水平研究顯示: CCP-1可使KBv200細胞中mdr-1基因mRNA水平下降，免疫細胞化學法顯示了相同的作用，不同濃度的CCP-1均可使KBv200細胞P-gp蛋白的表達量降低。由此提示CCP-1誘導多藥耐藥細胞凋亡，可能通過降低p-gp高表達細胞株上p-gp的表達，從而增加多藥耐藥細胞對抗癌藥物的敏感性。含有微管蛋白的結構，如微管等，對有絲分裂過程中紡錘體的形成非常重要，在細胞生長、分裂以及細胞骨架組成中扮演關鍵角色。免疫熒光法檢測顯示CCP-1能夠促進微管聚合、抑制微管解聚，這可能是其引起細胞凋亡的一個重要原因。動物移植腫瘤模型試驗發(fā)現(xiàn)，CCP-1對小鼠實體肉瘤S180的生長抑制作用強于VP-16且毒性更小。

綜上所述，CCP-1抗腫瘤多藥耐藥作用機制可以歸結為下調(diào)mdr-1基因的表達，從而減少P-gp蛋白表達量，逆轉(zhuǎn)其多藥耐藥表型，同時作用于微管蛋白促進微管聚合，進而誘導多藥耐藥腫瘤細胞凋亡。CCP-1較本實驗室先前合成的鬼臼毒素衍生物YB-L1EPO、YB-1EPN等有更強的抗腫瘤活性及抗多藥耐藥性，且毒性更小，有望成為新型高效的多靶點抗腫瘤藥物。

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作者簡介:張元( 1982－)，男，碩士，住院醫(yī)師，研究方向:腫瘤藥理學，E-mail: 306064053@ qq．com;

基金項目:國家自然科學基金資助項目( No 30873363) ;武警后勤學院博士啟動金( No WHTD201304-2)

收稿日期:2015－09－07，修回日期: 2015－11－13

文獻標志碼:A A

文章編號:1001－1978( 2016) 01－0144－02 1001－1978( 2016) 01－0144－02

doi:10．3969/j．issn．1001－1978．2016．01．030 10．3969/j．issn．1001－1978．2016．01．030